電動装置を用いた単一細胞解析のための組織の機械的解離

要約

フローサイトメトリーなどのダウンストリーム解析用の単一細胞懸濁液を生成するために、組織の酵素的および半自動機械的解離を組み合わせるための一般的なプロトコルが提供されています。このプロトコル用に開発された低コストの機械装置の製造、組み立て、および操作に関する説明が含まれています。

要約

組織サンプルの分析のために単一細胞を単離して調製できることは、新しい生物医学的発見や研究にとって急速に重要になっています。シングルセル単離のための手動プロトコルは、非常に時間がかかり、ユーザーによるばらつきが生じやすいです。自動化された機械的プロトコルは、処理時間とサンプルのばらつきを減らすことができますが、リソースの少ない研究環境では簡単にアクセスできず、費用対効果も高くありません。ここで説明する装置は、学術研究室向けの低コストの代替品として市販の材料を使用した半自動組織解離用に設計されました。デバイス設計を製造、組み立て、および操作するための手順が提供されています。解離プロトコルは、複数のマウス組織にわたる手動調製と同等の細胞収量とサンプル生存率を持つ単一細胞懸濁液を確実に生成します。このプロトコルは、デバイスごとに最大12個の組織サンプルを同時に処理する機能を提供し、大きなサンプルサイズを必要とする研究をより管理しやすくします。付属のソフトウェアにより、さまざまな組織や実験の制約に対応するためにデバイスプロトコルをカスタマイズすることもできます。

概要

シングルセル解析は、フローサイトメトリー、異なる細胞タイプの同定、シングルセルシーケンシング^{、細胞間の}ゲノムやトランスクリプトーム変異の同定などのアプリケーションにおいて、新しい生物医学的発見に急速に重要になっています1。目的組織からこのような細胞単離を行うには、解剖した組織を細かく刻み、それらを微細なセルストレーナーに押し込んで、目的の細胞から結合組織をろ過する必要があります(図1A)。樹状細胞やマクロファージなどの接着細胞タイプ、または特に線維組織からの細胞を単離するには、追加の機械的または酵素的分離ステップ^{が必要です2,3,4}。このプロセスは通常、手作業で行われるため、細胞収量やサンプルの生存率を評価する際に、非常に時間がかかり、ユーザーによるばらつきが生じやすくなります。したがって、自動組織解離のためのカスタマイズ可能なオプションを導入することが重要です。このようなシステムを設計する試みはいくつか行われてきましたが、特に学術研究室やリソースの少ない環境では、主にこれらのデバイスのコストが法外な性質のために、既存のオプションに常に容易にアクセスできるとは限りません⁵。さらに、これらの機器....

プロトコル

このプロトコルは、UMD Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) によって承認されました。これらの研究には、7週齢から9週齢の雌のC57BL/6Jマウスの組織を使用しました。動物は市販の供給源から入手した( 資料表参照)。

1. 手動解離

注:この手順は、Maisel K. et ^al.7 から引用したものです。

1. 解剖した組織を除去し、5%ウシ胎児血清(FBS)を含む低温細胞培養培地に入れます。
2. 鋭利な解剖ハサミを使用して、破片が任意の寸法で1mm未満になるまで組織を切り刻みます。
3. みじん切りにした組織を15 mLのコニカルチューブに移し、5 mLの培地を加えます。
4. 単離する組織および細胞の種類に基づいて消化酵素を添加します。提示された実験では、コラゲナーゼ4(1 mg/mL)、コラゲナーゼD(1 mg/mL)、およびDNase(40 μg/mL)を使用します。
5. シェーカーまたはロッカーで37°Cで1時間インキュベートし、インキュベーション中は穏やかに撹拌します。サンプルを100回上下にピペットで移動させます。
6. EDTAを添加....

ディスカッション

このデバイスは、研究環境で簡単に組み立てられるように設計されており、その後のシングルセル解析のために組織全体からシングルセル懸濁液を提供します。これらの機能は、基本的なものですが、学術現場やその他の研究者のニーズを満たすのに十分です。このデバイスを使用する主な利点は、ばらつきを低減することにより、単一細胞懸濁液の調製を改善できる可能性があることです?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
¼ inch acrylic sheet  12" x 24"	Acrylic Mega Store	N/A
½ inch acrylic sheet 12" x 12"	SimbaLux	SL-AS13-12x12
12 G stainless steel wire (for tension arms)	Everbilt	1000847413
16 G electrical wire (stranded)	Best Connections	N/A
2 x 3 mm magnet	SU-CRO0587	N/A
2-channel relay board (to reverse polarity of current to motors)	AEDIKO	AE06233
37 mm Diameter DC Motors (12 V, 200 rpm) x 12	Greartisan	N/A	Rated Torque: 2.2 Kg.cm Reduction Ratio: 1:22 Rated Current: 0.1 A D Shaped Output Shaft Size: 6 x 14mm (0.24" x 0.55") (D x L) Gearbox Size: 37 x 25 mm (1.46" x 0.98") (D x L) Motor Size: 36.2 x 33.3 mm (1.43" x 1.31") (D x L) Mounting Hole Size: M3 (not included)
AC/C Power Adapter with variable voltage controller   (5 Amps, 3-12 volts)	Mo-gu	J19091-2-MG-US
AC-DC 5 V 1 A Precision buck converter step down transformer	Walfront	1A	(power adapter for powering Arduino Nano)
Arduino Nano   (Lafvin)	LAFVIN	8541582500
Buttons	Awpeye	Push-button
C57BL6/J mice	Jackson Laboratory
Collagenase 4	Worthington	CLS4 LS004188
Collagenase D	Roche	11088866001
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Corning	10-013-CV
DNAse	Roche	11284932001
Double sided foam tape	SANKA	N/A
Double Sided prototyping circuit board	deyue	N/A
EDTA	Sigma- Aldrich	E7889
Electrical solder and soldering iron	LDK	1002P
Electrical Tape	3M	03429NA
FBS (Fetal Bovine Serum)	Gibco	16140089
gentleMACS C Tubes	Miltenyi	130-093-237
Graphpad Prism	GraphPad, La Jolla, CA		Graphing and statistical analysis software
Hall effect sensor Dimensions : 0.79 x 0.79x 0.39 inches	SunFounder	43237-2
Hex Coupler 6 mm Bore Motor Brass x 2 x 12	Uxcell	N/A
Hex head bolts (M4-.70 X 12 Hex Head Cap Screw) x 12	FAS	N/A
Jumper wires (for Arduino Nano)	ELEGOO	EL-CP-004
LCD screen	JANSANE	N/A
M3 Hex Socket Head Cap Screws x 12	Shenzhen Baishichuangyou Technology co.Ltd	310luosditaozhuang
M3 Stainless SteelMachine screws Flat Head Hex Socket Cap Screws (30 mm) x 36	Still Awake	a52400001
Quick disconnect terminal connectors	IEUYO	22010064
Red Blood Cell Lysis Buffer (10x)	Cell Signaling	46232
Terminal adapter shield Expansion board for Arduino Nano  12" x 24"	Shenzhen Weiyapuhua Technology	60-026-3