تصوير خلايا الدماغ الحيوية وغير الحيوية في شرائح الدماغ بعد النزف تحت العنكبوتية

Summary

يؤكد التحقيق الأولي أن النزف تحت العنكبوتية (SAH) يسبب زوال الخلايا المحيطة بالدماغ. يتطلب تقييم انقباض الخلايا المحيطة بعد SAH التمييز بين خلايا الدماغ القابلة للحياة وغير القابلة للحياة. ومن ثم ، تم تطوير إجراء لتسمية pericytes الدماغ قابلة للحياة وغير قابلة للحياة في وقت واحد في أقسام الدماغ ، مما يسهل الملاحظة باستخدام مجهر متحد البؤر عالي الدقة.

Abstract

الخلايا المحيطة هي خلايا جدارية حاسمة تقع داخل دوران الأوعية الدقيقة الدماغية ، وهي محورية في تعديل تدفق الدم الدماغي بنشاط عن طريق تعديلات الانقباض. تقليديا ، يتم قياس انقباضها من خلال مراقبة التحولات المورفولوجية وتغيرات قطر الشعيرات الدموية القريبة في ظل ظروف محددة. ومع ذلك ، فإن تثبيت ما بعد الأنسجة ، وتقييم الحيوية وما يترتب على ذلك من انقباض pericyte للخلايا المحيطة بالدماغ المصورة يصبح معرضا للخطر. وبالمثل ، فإن وضع العلامات الوراثية على الخلايا المحيطة بالدماغ يقصر في التمييز بين الخلايا المحيطة القابلة للحياة وغير القابلة للحياة ، لا سيما في الحالات العصبية مثل النزف تحت العنكبوتية (SAH) ، حيث يتحقق تحقيقنا الأولي من صحة زوال الخلايا المحيطة بالدماغ. تم وضع بروتوكول موثوق للتغلب على هذه القيود ، مما يتيح وضع علامات الفلورسنت في وقت واحد لكل من pericytes الدماغ الوظيفية وغير الوظيفية في أقسام الدماغ. تسمح طريقة وضع العلامات هذه بتصور مجهر متحد البؤر عالي الدقة ، مع وضع علامة متزامنة على الأوعية الدموية الدقيقة لشريحة الدماغ. يوفر هذا البروتوكول المبتكر وسيلة لتقييم انقباض pericyte في الدماغ ، وتأثيره على قطر الشعيرات الدموية ، وهيكل pericyte. إن التحقيق في انقباض الخلايا المحيطة بالدماغ في سياق SAH يعطي فهما ثاقبا لآثاره على دوران الأوعية الدقيقة الدماغية.

Introduction

تحيط الخلايا المحيطة بالدماغ ، التي تتميز بنتوءاتها النحيلة وأجسام الخلايا البارزة ، دوران الأوعية الدقيقة ^1,2. في حين أن زيادة تدفق الدم الدماغي مدفوعة في الغالب بتمدد الشعيرات الدموية ، فإن الشرايين الأصغر تظهر معدلات تمدد أبطأ³. يمارس انقباض Pericyte تأثيرا على قطر الشعيرات الدموية ومورفولوجيا pericyte ، مما يؤثر على ديناميكيات الأوعية الدموية⁴. يؤدي تقلص الخلايا المحيطة بالدماغ إلى انقباض الشعيرات الدموية ، وفي السيناريوهات المرضية ، قد يعيق الانكماش المفرط تدفق كرات الدم الحمراء⁵. يمكن لعوامل مختلفة ، بما في ذلك النورإبينفرين المنطلق من الموضع الأزرق ، أن تحفز تقلص الخلايا المحيطة بالدماغ داخل الشعيرات الدموية⁶. مع دور تنظيمي في تدفق الدم الدماغي ، تظهر pericytes تخليق 20-HETE ، وتعمل كمستشعر للأكسجين أثناء فرط التأكسج⁷. يؤثر الانقباض التأكسدي النترجي الناجم عن الإجهاد في خلايا الدماغ بشكل ضار على الشعيرات الدموية⁵. على الرغم من التحقيقات داخل الجسم الحي وخارج الجسم الحي في تقلص الخلايا المحيطة بالدماغ 8 ، لا تزال المعرفة محدودة فيما يتعلق^بتصوير خلايا الدماغ القابلة للحياة وغير القابلة للحياة داخل شرائح الدماغ.

بشكل حاسم ، فإن التصوير بعد تثبيت الأنسجة للخلايا المحيطة بالدماغ يضر بحيويتها وتقييم الانقباض اللاحق. علاوة على ذلك ، في سيناريوهات مثل الاضطرابات العصبية (على سبيل المثال ، نزيف تحت العنكبوتية - SAH) ، يفشل وضع العلامات المعدلة وراثيا للخلايا المحيطة بالدماغ في التمييز بين الخلايا المحيطة القابلة للحياة وغير القابلة للحياة ، كما أكدت دراستنا الأولية لموت الخلايا المحيطة بالدماغ التي يسببها^{SAH 9}.

للتغلب على هذه التحديات ، استخدمنا TO-PRO-3 لتسمية الخلايا المحيطة الحية ، بينما تم تلطيخ المتوفين بيوديد البروبيديوم (PI). استخدمنا تقنيات التصوير متحد البؤر عالية الدقة لتصور خلايا الدماغ القابلة للحياة وغير القابلة للحياة في شرائح الدماغ مع الحفاظ على نشاط الشريحة أثناء التصوير. تهدف هذه المقالة إلى تقديم طريقة قابلة للتكرار لتصوير خلايا الدماغ القابلة للحياة وغير القابلة للحياة في شرائح الدماغ ، والتي تعمل كأداة قيمة للتحقيق في تأثير pericytes الدماغ على دوران الأوعية الدقيقة الدماغية بعد SAH.

Protocol

تمت الموافقة على البروتوكول التجريبي من قبل لجنة أخلاقيات واستخدام بجامعة كونمينغ الطبية (kmmu20220945). تم استخدام فئران Sprague-Dawley (SD) من كلا الجنسين ، 300-350 جم ، في هذه الدراسة.

1. تحفيز نموذج SAH

1. تخدير الفئران باستخدام 2٪ إيزوفلوران و 100٪ أكسجين. الحفاظ على التخدير عن طريق توفير التخدير المستمر بالاستنشاق مع الأيزوفلوران (1٪ -3٪). تأمين رأس الجرذ باستخدام جهاز تجسيمي (انظر جدول المواد).
2. قم بإنشاء نموذج SAH باتباع الخطوات أدناه.
   1. أدخل إبرة الحقن المجهري في الصهريج فوق السيلار. بعد ذلك ، قم بحقن الدم الذاتي من شريان ذيل الفئران (بدون مضادات التخثر) في الخزان فوق السيلار باستخدام مضخة حقنة (انظر جدول المواد).
   2. زرع إبرة حقن مجهري في البطين الدماغي الجانبي الأيمن باستخدام الإحداثيات المذكورة: bregma ، −0.8 مم ؛ جانبي ، 1.4 مم ؛ العمق ، 4 مم⁹. بالنسبة لمجموعات SAH ، قم بحقن 0.2 مل من دم شريان ذيل الفئران. بالنسبة للمجموعات الوهمية ، يتم تطبيق نفس الحجم من محلول ملحي متساوي التوتر (الشكل 1 أ).

2. إعداد شريحة الدماغ وتحقيق الاستقرار

1. تخدير الفئران بعمق باستخدام استنشاق إيزوفلوران 2٪. بعد قطع الرأس ، استخرج الأدمغة بأكملها واغمرها في السائل النخاعي الاصطناعي المثلج (ACSF).
   ملاحظة: استخدم محاليل ACSF المحضرة حديثا بالتركيب التالي: 134 مللي مول كلوريد الصوديوم ، 2.8 مللي مول KCl ، 29 مللي متر NaHCO₃ ، 1.1 مللي متر NaH 2 PO 4 ، 1.5 mM MgSO₄ ، 2.5 mM CaCl₂ ، و 10.11 mM D-Glucose (انظر جدول المواد). الحفاظ على درجة الحموضة بين 7.3 و 7.4.
2. استخدم اهتزازا (انظر جدول المواد) لتحضير شرائح الدماغ الحادة بسمك 200 ميكرومتر من فئران SD في ACSF المثلج البارد الذي يتم تهويته بنسبة 5٪ CO 2 و 95٪ O 2 (الشكل 2).
3. ضع شرائح الدماغ الحادة التي يبلغ سمكها 200 ميكرومتر في غرفة تخزين على شبكة نايلون مغمورة في ACSF. قم بموازنة محلول ACSF مع 95٪ O 2 و 5٪ CO₂ ، مع الحفاظ على نطاق درجة حرارة 35-37 درجة مئوية. اسمح لشرائح الدماغ بالاستقرار لمدة 2 ساعة ، مما يمنحها الوقت للتكيف (الشكل 3).

3. وضع العلامات على pericytes في شرائح الدماغ الحادة باستخدام TO-PRO-3

ملاحظة: تم تصنيف الخلايا المحيطة من شرائح الدماغ الحادة بشكل فلوري باستخدام التتبع TO-PRO-3¹⁰.

1. أضف صبغة الفلورسنت TO-PRO-3 إلى ACSF ، وتحقيق تركيز نهائي قدره 1 ميكرومتر. احتضان شرائح الدماغ الحادة في درجة حرارة الغرفة في بيئة مظلمة باستخدام ACSF المحتوي على TO-PRO-3 لمدة 20 دقيقة.
   ملاحظة: تذكر ارتداء قفازات اللاتكس أثناء التعامل مع TO-PRO-3 للحماية.
2. انقل مصفاة شبكة النايلون ، التي تحمل شرائح الدماغ ، من غرفة التحميل إلى غرفة شطف الألواح المكونة من 6 آبار (انظر جدول المواد). اترك شرائح الدماغ تبقى في غرفة الشطف لمدة 10 دقائق (الشكل 4 د).
   ملاحظة: تنهي خطوة الشطف هذه عملية التلوين ، وتقلل من وضع العلامات على الخلفية ، وتمنع تلطيخ غير محدد.
3. اشطف المستحضرات لمدة 15 دقيقة باستخدام محلول ACSF المتوازن مع خليط من 5٪ CO 2 و 95٪ O₂. توقف خطوة الشطف هذه امتصاص الصبغة وتقلل من وضع العلامات على الخلفية (الشكل 4C).

4. تلطيخ الخلايا غير الحيوية من دوران الأوعية الدقيقة الدماغية في شرائح الدماغ الحادة

1. احتضان شرائح الدماغ محملة مسبقا ب TO-PRO-3 عند 37 درجة مئوية مع إيزولكتين B4 مترافق مع Alexa Fluor 488 (FITC-ISOB4 ؛ 5 ميكروغرام / مل ، انظر جدول المواد) لمدة 30 دقيقة في بيئة مظلمة. بعد الحضانة ، شطف شرائح الدماغ لمدة 15 دقيقة في ACSF (الشكل 4E).
2. احتضان شرائح الدماغ في ACSF بالغاز مع 5٪ CO 2 و 95٪ O₂ كالمعتاد. أضف يوديد البروبيديوم (PI) بتركيز 37 ميكرومتر إلى كلا المحلولين عند 37 درجة مئوية. سيؤدي ذلك إلى تسمية خلايا الدماغ غير الحيوية. احتضن المستحضرات في محلول ACSF لمدة 60 دقيقة في الظلام (الشكل 4F).
3. بعد ذلك ، اشطف المستحضرات لمدة 15 دقيقة باستخدام محاليل ACSF لوقف امتصاص الصبغة وتقليل وضع العلامات على الخلفية.

5. تصوير خلايا الدماغ الحيوية وغير الحيوية في شرائح الدماغ الحادة

1. انقل شرائح الدماغ برفق إلى أطباق متحدة البؤر ذات قاع زجاجي (انظر جدول المواد) باستخدام ماصات باستور البلاستيكية. املأ الأطباق بمحلول ACSF تمت موازنته مسبقا مع 5٪ CO 2 و 95٪ O₂. استخدم شبكة حديدية لتثبيت شرائح دماغ الفئران في مكانها.
2. نقل الأطباق البؤرية ذات القاع الزجاجي إلى مرحلة المجهر متحد البؤر. ضع شريحة الدماغ الحادة في قاع الطبق وقم بإعطائها⁹ بمحلول ACSF متوازن بمزيج من 95٪ O 2 و 5٪ CO₂ أثناء التصوير المجهري متحد البؤر (الشكل 5A والشكل 5Ab).
3. تصور خلايا جدار الأوعية الدموية الدماغية القشرية باستخدام هدف 40x. التقط حزم الصور باستخدام برامج متوافقة (انظر جدول المواد). استخدم المرشحات المناسبة ل IB4 (الإثارة / الانبعاث 460 نانومتر / 520 نانومتر) ، PI (الإثارة / الانبعاث 545 نانومتر / 595 نانومتر) ، و TO-PRO-3 (الإثارة / الانبعاث 606 نانومتر / 666 نانومتر) (الشكل 5D).
   ملاحظة: التقط صورا بالتفاصيل التالية: عدسة DIC N1 موضوعية 40× ، 3 × 12 بت: 512 × 512 بكسل (0.22 × 0.22 مم) ، المعايرة: 0.42 ميكرومتر / بكسل.
4. تحديد الأوعية الدموية الدماغية الدقيقة والخلايا المحيطة بناء على شبكتها ومورفولوجيتها. حدد موقع منطقة معينة تحتوي على شبكة الأوعية الدموية الدماغية الدقيقة على كل شريحة دماغية والتقط الصور.
5. لاحظ بعناية موقع التصوير لضمان الاتساق في اللقطات اللاحقة (الشكل 5B ، C). لمزيد من المعالجة والتحليل ، استخدم برنامج تحليل الصور (ImageJ) وبرنامج تحرير الصور (انظر جدول المواد).

النتائج

في ظل الظروف الفسيولوجية الطبيعية ، لا تخضع خلايا الدماغ عموما لموت الخلايا. يوضح الشكل 6 هذه الظاهرة ، حيث يشير اللون الأصفر إلى وجود خلايا محيطية حيوية في الدماغ. لا تظهر الخلايا المحيطة بالدماغ أي تلطيخ مع PI ، مما يشير إلى صلاحيتها. لمزيد من التحقيق فيما إذا كانت الخلايا ?...

Discussion

تم تطوير تقنيات تصوير متحدة البؤر عالية الدقة لتصور خلايا الدماغ الحيوية ، وخلايا الدماغ غير الحيوية ، والأوعية الدموية الدقيقة في شرائح الدماغ. في شرائح دماغ الفئران الحادة ، تستلزم العملية وضع العلامات الأولية على الخلايا المحيطة ب TO-PRO-3¹¹ ، تليها الخلايا البطانية الوعائية ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well plate	ABC biochemistry	ABC703006	RT
Adobe Photoshop	Adobe	Adobe Illustrator CS6 16.0.0	RT
Aluminium foil	MIAOJIE	225 mm x 273 mm	RT
CaCl2·2H2O	Sigma-Aldrich	C3881	RT
Confocal imaging software	Nikon	NIS-Elements 4.10.00	RT
Confocal Laser Scanning Microscope	Nikon	N-SIM/C2si	RT
Gas tank (5% CO2, 95% O2)	PENGYIDA	40L	RT
Glass Bottom Confocal Dishes	Beyotime	FCFC020-10pcs	RT
Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	RT
Glue	EVOBOND	KH-502	RT
Ice machine	XUEKE	IMS-20	RT
Image analysis software	National Institutes of Health	Image J	RT
Inhalation anesthesia system	SCIENCE	QAF700	RT
Isolectin B 4-FITC	SIGMA	L2895–2MG	Store aliquots at –20 °C
KCl	Sigma-Aldrich	7447–40–7	RT
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P0662	RT
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506	RT
NaCl	Sigma-Aldrich	7647–14–5	RT
NaH2PO4·H2O	Sigma-Aldrich	10049–21–5	RT
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761	RT
Pasteur pipette	NEST Biotechnology	318314	RT
Peristaltic Pump	Scientific Industries Inc	Model 203	RT
Propidium (Iodide)	Med Chem Express	HY-D0815/CS-7538	Store aliquots at –20 °C
Stereotaxic apparatus	SCIENCE	QA	RT
Syringe pump	Harvard PUMP	PUMP 11 ELITE Nanomite	RT
Thermostatic water bath	OLABO	HH-2	RT
Vibrating microtome	Leica	VT1200	RT