지주막하 출혈 후 뇌 절편에서 Vital and Non-vital Brain Pericytes 이미징

요약

예비 조사 결과 지주막하 출혈(SAH)이 뇌 주위 세포 사멸을 유발한다는 사실이 확인되었습니다. SAH 후 세포주위 수축성을 평가하려면 생존 가능한 뇌 주피세포와 생존 불가능한 뇌 주피를 구별해야 합니다. 따라서 뇌 절편에서 생존 가능한 뇌 주피세포와 생존 불가능한 뇌 주위 세포를 동시에 라벨링하는 절차가 개발되어 고해상도 컨포칼 현미경을 사용하여 관찰을 용이하게 합니다.

초록

주위 세포는 대뇌 미세 순환 내에 위치한 중요한 벽화 세포로, 수축성 조절을 통해 대뇌 혈류를 능동적으로 조절하는 데 중추적인 역할을 합니다. 일반적으로 수축성은 특정 상황에서 형태학적 변화와 인근 모세관 직경 변화를 관찰하여 측정됩니다. 그러나 조직 후 고정, 활력 평가 및 이미징된 뇌 주위 세포의 주위 세포 수축성이 손상됩니다. 마찬가지로, 뇌 주위 세포를 유전적으로 표지하는 것은 생존 가능한 주위 세포와 생존 불가능한 주위 세포를 구별하는 데 부족하며, 특히 지주막하 출혈(SAH)과 같은 신경학적 상태에서는 예비 조사에서 뇌 주위 세포의 사멸을 입증합니다. 이러한 제약을 극복하기 위해 신뢰할 수 있는 프로토콜이 고안되어 뇌 절편에서 기능적 및 비기능적 뇌 주위 세포의 동시 형광 태깅을 가능하게 합니다. 이 표지 방법을 사용하면 고해상도 컨포칼 현미경을 시각화하여 뇌 절편 미세혈관을 동시에 표시할 수 있습니다. 이 혁신적인 프로토콜은 뇌 주위 세포 수축성, 모세혈관 직경에 미치는 영향 및 주위 세포 구조를 평가할 수 있는 수단을 제공합니다. SAH 맥락에서 뇌 주위 세포 수축성을 조사하면 대뇌 미세 순환에 미치는 영향을 통찰력 있게 이해할 수 있습니다.

서문

가느다란 돌기와 돌출된 세포체로 구별되는 뇌 주피세포는 미세순환 ^1,2를 둘러싸고 있습니다. 대뇌 혈류 확대는 주로 모세혈관 확장에 의해 이루어지지만, 동맥이 작을수록 확장 속도가 느려진다³. 주위 수축력은 모세혈관 직경과 주위 세포 형태에 영향을 미쳐 혈관 역학에 영향을 미친다⁴. 뇌 주위세포의 수축은 모세혈관 수축을 유발하며, 병리학적 시나리오에서 과도한 수축은 적혈구 흐름을 방해할 수 있다⁵. 유전자좌(locus coeruleus)에서 분비되는 노르에피네프린(norepinephrine)을 포함한 다양한 요인이 모세혈관 내에서 뇌주위 세포 수축을 유도할 수 있다⁶. 대뇌 혈류를 조절하는 역할을 하는 pericyte는 20-HETE 합성을 나타내며 과산소증⁷ 동안 산소 센서 역할을 한다. 산화-질화 스트레스로 유발된 뇌 주위 세포의 수축은 모세혈관에 해로운 영향을 미친다⁵. 뇌 주위 세포 수축에 대한 생체 내 및 생체 외 연구에도^{불구하고8,} 뇌 절편 내에서 생존 가능한 뇌 주위 세포와 생존 불가능한 뇌 주위 세포의 이미징에 관한 제한된 지식은 여전히 남아 있다.

결정적으로, 뇌 주위의 조직 고정 후 영상은 활력과 후속 수축성 평가를 손상시킵니다. 또한, 신경학적 장애(예: 지주막하 출혈 - SAH)와 같은 시나리오에서 뇌 주피세포의 형질전환 표지는 예비 SAH 유도 뇌주위 세포 사멸 연구에서 확인된 바와 같이 생존 가능한 주위세포와 생존 불가능한 주위를 구별하지 못합니다⁹.

이러한 문제를 극복하기 위해 TO-PRO-3를 사용하여 살아있는 pericyte를 라벨링하고 죽은 pericyte는 propidium iodide (PI)로 염색했습니다. 고해상도 컨포칼 이미징 기술을 사용하여 뇌 절편에서 생존 가능한 뇌 주위 세포와 생존 불가능한 뇌 주위 세포를 시각화하는 동시에 이미징 중 절편 활성을 보존했습니다. 이 논문은 뇌 절편에서 생존 가능한 뇌 주위 세포와 생존 불가능한 뇌 주위 세포를 이미징하기 위한 재현 가능한 방법을 제시하는 것을 목표로 하며, SAH 후 뇌 미세 순환에 대한 뇌 주위 세포의 영향을 조사하는 귀중한 도구 역할을 합니다.

프로토콜

실험 프로토콜은 쿤밍 의과대학 동물 윤리 및 사용 위원회(kmmu20220945)의 승인을 받았습니다. 본 연구에는 남녀 모두의 Sprague-Dawley (SD) 쥐 (300-350 g)가 사용되었습니다.

1. SAH 모델 유도

1. 2% 이소플루란과 100% 산소를 사용하여 쥐를 마취합니다. 연속 흡입 마취에 이소플루란(1%-3%)을 공급하여 마취를 유지합니다. 입체 장치를 사용하여 쥐의 머리를 고정합니다( 재료 표 참조).
2. 아래 단계에 따라 SAH 모델을 만듭니다.
   1. 미세 주사 바늘을 suprasellar 수조에 삽입합니다. 그런 다음 주사기 펌프를 사용하여 쥐의 꼬리 동맥(항응고제 없음)에서 자가 혈액을 suprasellar 수조에 주입합니다( 재료 표 참조).
   2. 언급된 좌표를 사용하여 오른쪽 외측 뇌실에 미세 주입 바늘을 이식합니다: 브레그마, -0.8mm; 측면, 1.4mm; 깊이, 4mm⁹. SAH 그룹의 경우 쥐 꼬리 동맥혈 0.2mL를 주사합니다. 가짜 그룹의 경우 동일한 양의 등장성 식염수를 투여합니다(그림 1A).

2. 뇌 절편 준비 및 안정화

1. 2% 이소플루란 흡입을 사용하여 쥐를 깊이 마취시킵니다. 참수 후 뇌 전체를 적출하여 얼음처럼 차가운 인공 뇌척수액(ACSF)에 담그십시오.
   참고: 134mM NaCl, 2.8mM KCl, 29mM NaHCO3, 1.1mM NaH2PO4, 1.5mMMgSO4, 2.5mM CaCl2 및 10.11mM D-Glucose(재료 표 참조). pH를 7.3에서 7.4 사이로 유지하십시오.
2. 비브라톰(재료 표 참조)을 사용하여 5% CO2 및 95%_O2로 폭기된 얼음처럼 차가운 ACSF에서 SD 쥐로부터 200μm 두께의 급성 뇌 절편을 준비합니다(그림 2).
3. 200μm 두께의 급성 뇌 절편을 ACSF에 잠긴 나일론 메쉬의 보관실에 넣습니다. 35-37 °C의 온도 범위를 유지하면서 ACSF 용액을 95 % O 2 및 5 % CO₂ 와 평형을 이룹니다. 뇌 절편이 2시간 동안 안정화되도록 하여 적응할 시간을 줍니다(그림 3).

3. TO-PRO-3를 이용한 급성 뇌절편의 주위 세포 표지

참고: 급성 뇌 절편의 주위 세포는 추적자 TO-PRO-3¹⁰을 사용하여 형광 표지되었습니다.

1. 형광 염료 TO-PRO-3을 ACSF에 첨가하여 최종 농도 1μM를 달성합니다. TO-PRO-3 함유 ACSF를 사용하여 어두운 환경의 실온에서 20분 동안 급성 뇌 절편을 배양합니다.
   알림: 보호를 위해 TO-PRO-3을 취급하는 동안 라텍스 장갑을 착용하는 것을 잊지 마십시오.
2. 브레인 슬라이스를 운반하는 나일론 메쉬 스트레이너를 로딩 챔버에서 6웰 플레이트 헹굼 챔버로 옮깁니다( 재료 표 참조). 뇌 절편을 헹굼실에 10분 동안 그대로 둡니다(그림 4D).
   알림: 이 헹굼 단계는 염색 과정을 종료하고 배경 라벨링을 줄이며 비특이적 염색을 방지합니다.
3. 15 % CO 2 및 5 % O₂의 혼합물로 평형을 이루는 ACSF 용액을 사용하여 총 95 분 동안 제제를 헹굽니다. 이 헹굼 단계는 염료 흡수를 중단하고 배경 라벨링을 최소화합니다(그림 4C).

4. 급성 뇌 절편에서 대뇌 미세 순환의 비생명 주위 세포 염색

1. 어두운 환경에서 30분 동안 Alexa Fluor 488(FITC-ISOB4, 5μg/mL, 재료 표 참조)에 접합된 이솔렉틴 B4를 사용하여 37°C에서 TO-PRO-3이 사전 로드된 뇌 절편을 배양합니다. 배양 후 뇌 절편을 ACSF에서 15분 동안 헹굽니다(그림 4E).
2. 평소와 같이 5 % CO 2 및 95 % O₂ 로 가스 처리 된 ACSF에서 뇌 절편을 배양합니다. 37μM 농도의 프로피듐 요오드화물(PI)을 37°C의 두 용액에 모두 첨가합니다. 이것은 중요하지 않은 뇌 주위 세포에 라벨을 붙일 것입니다. 이 ACSF 용액에서 어두운 곳에서 60분 동안 제제를 배양합니다(그림 4F).
3. 그런 다음 ACSF 용액으로 15분 동안 준비물을 헹구어 염료 흡수를 중단하고 배경 라벨링을 최소화합니다.

5. 급성 뇌 절편에서 중요한 뇌 주위 세포와 비생명 뇌 주위의 이미징

1. 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 뇌 절편을 유리 바닥 공초점 접시(재료 표 참조)로 부드럽게 옮깁니다. 이전에 5 % CO 2 및 95 % O₂ 로 평형을 이룬 ACSF 용액으로 접시를 채웁니다. 철망을 사용하여 쥐의 뇌 조각을 제자리에 고정합니다.
2. 유리 바닥 컨포칼 접시를 컨포칼 현미경의 스테이지로 옮깁니다. 급성 뇌 절편을 접시 바닥에 놓고 컨포칼 현미경 이미징 중에 95% O2 및 5%_CO2의 혼합물로 평형화된 ACSF 용액으로⁹를 관류합니다(그림 5A 및 그림 5Ab').
3. 40x 대물렌즈를 사용하여 대뇌 피질 미세혈관의 벽 세포를 시각화합니다. 호환되는 소프트웨어를 사용하여 이미지 스택을 캡처합니다( 재료 표 참조). IB4(여기/방출 460nm/520nm), PI(여기/방출 545nm/595nm) 및 TO-PRO-3(여기/방출 606nm/666nm)에 적합한 필터를 사용합니다(그림 5D).
   참고: 40× DIC N1 대물 렌즈, 3 × 12비트: 512 × 512픽셀(0.22 × 0.22mm), 보정: 0.42μm/px.
4. 대뇌 미세혈관과 주위세포를 네트워크와 형태에 따라 식별합니다. 각 뇌 절편에서 대뇌 미세혈관 네트워크를 포함하는 특정 영역을 찾아 이미지를 캡처합니다.
5. 후속 캡처에서 일관성을 보장하기 위해 이미징 위치를 주의 깊게 기록해 둡니다(그림 5B,C). 추가 처리 및 분석을 위해 이미지 분석 소프트웨어(ImageJ) 및 사진 편집 소프트웨어를 사용하십시오(재료 표 참조).

결과

정상적인 생리학적 조건에서 뇌 주위세포는 일반적으로 세포 사멸을 겪지 않습니다. 그림 6 은 이 현상을 보여주며, 노란색은 중요한 뇌 주위 세포의 존재를 나타냅니다. 뇌 주위 세포는 PI로 염색되지 않아 생존 가능성을 나타냅니다. 세포 사멸 후 pericyte가 미세혈관에 부착된 상태로 남아 있는지 여부를 추가로 조사하기 위해 SAH 쥐 모델에 방법을 사용하고 후속 이미징을 수...

토론

중요한 뇌 주위 세포, 비필수 뇌 주위 세포 및 뇌 절편의 미세혈관을 시각화하기 위한 고해상도 공초점 이미징 기술이 개발되었습니다. 급성 쥐 뇌 절편에서, 이 과정은 TO-PRO-3¹¹을 사용한 주위 세포의 초기 표지를 수반한 후 IB4¹²를 사용한 미세혈관 내피 세포를 수반합니다. 그 후, PI를 사용하여 죽은 pericyte의 식별이 수행됩니다. 이 프로토콜은 간단하고 재현 가...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well plate	ABC biochemistry	ABC703006	RT
Adobe Photoshop	Adobe	Adobe Illustrator CS6 16.0.0	RT
Aluminium foil	MIAOJIE	225 mm x 273 mm	RT
CaCl2·2H2O	Sigma-Aldrich	C3881	RT
Confocal imaging software	Nikon	NIS-Elements 4.10.00	RT
Confocal Laser Scanning Microscope	Nikon	N-SIM/C2si	RT
Gas tank (5% CO2, 95% O2)	PENGYIDA	40L	RT
Glass Bottom Confocal Dishes	Beyotime	FCFC020-10pcs	RT
Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	RT
Glue	EVOBOND	KH-502	RT
Ice machine	XUEKE	IMS-20	RT
Image analysis software	National Institutes of Health	Image J	RT
Inhalation anesthesia system	SCIENCE	QAF700	RT
Isolectin B 4-FITC	SIGMA	L2895–2MG	Store aliquots at –20 °C
KCl	Sigma-Aldrich	7447–40–7	RT
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P0662	RT
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506	RT
NaCl	Sigma-Aldrich	7647–14–5	RT
NaH2PO4·H2O	Sigma-Aldrich	10049–21–5	RT
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761	RT
Pasteur pipette	NEST Biotechnology	318314	RT
Peristaltic Pump	Scientific Industries Inc	Model 203	RT
Propidium (Iodide)	Med Chem Express	HY-D0815/CS-7538	Store aliquots at –20 °C
Stereotaxic apparatus	SCIENCE	QA	RT
Syringe pump	Harvard PUMP	PUMP 11 ELITE Nanomite	RT
Thermostatic water bath	OLABO	HH-2	RT
Vibrating microtome	Leica	VT1200	RT