АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Предварительное расследование подтверждает, что субарахноидальное кровоизлияние (САК) вызывает гибель перицитов головного мозга. Оценка сократительной способности перицитов после САК требует дифференциации жизнеспособных и нежизнеспособных перицитов головного мозга. В связи с этим была разработана процедура одновременной маркировки жизнеспособных и нежизнеспособных перицитов головного мозга в срезах мозга, что облегчает наблюдение с помощью конфокального микроскопа высокого разрешения.

Аннотация

Перициты являются важнейшими клетками-стенками, расположенными в микроциркуляции головного мозга, которые играют ключевую роль в активной модуляции мозгового кровотока путем регулирования сократительной способности. Обычно их сократительная способность измеряется путем наблюдения морфологических сдвигов и изменений диаметра капилляров в непосредственной близости при определенных обстоятельствах. Тем не менее, посттканевая фиксация, оценка жизнеспособности и последующая сократительная способность перицитов визуализированных перицитов головного мозга оказывается под угрозой. Аналогичным образом, генетическая маркировка перицитов головного мозга не позволяет провести различие между жизнеспособными и нежизнеспособными перицитами, особенно при неврологических состояниях, таких как субарахноидальное кровоизлияние (САК), когда наше предварительное исследование подтверждает гибель перицитов головного мозга. Для преодоления этих ограничений был разработан надежный протокол, позволяющий одновременно флуоресцентно помечать как функциональные, так и нефункциональные перициты мозга в отделах мозга. Этот метод мечения позволяет визуализировать с помощью конфокального микроскопа с высоким разрешением, одновременно отмечая микроциркуляторное русло среза мозга. Этот инновационный протокол позволяет оценить сократительную способность перицитов головного мозга, их влияние на диаметр капилляров и структуру перицитов. Исследование сократительной способности перицитов головного мозга в контексте САК дает глубокое понимание ее влияния на церебральную микроциркуляцию.

Введение

Перициты головного мозга, отличающиеся тонкими выпуклостями и выступающими телами клеток, окружают микроциркуляцию 1,2. В то время как увеличение мозгового кровотока в основном обусловлено расширением капилляров, более мелкие артерии демонстрируют более медленные темпы расширения3. Сократительная способность перицитов оказывает влияние на диаметр капилляров и морфологию перицитов, влияя на сосудистую динамику4. Сокращение перицитов головного мозга приводит к сужению капилляров, а при патологических сценариях чрезмерное сокращение может препятствовать потоку эритроцитов5. Различные факторы, в том числе норадреналин, высвобождаемый из locus coeruleus, могут индуцировать сокращение перицитов головного мозга в капиллярах6. Выполняя регуляторную роль в мозговом кровотоке, перициты проявляют синтез 20-HETE, выступая в качестве датчика кислорода во время гипероксии7. Вызванное окислительно-нитративным стрессом сокращение перицитов головного мозга пагубно влияет на капилляры5. Несмотря на исследования сокращения перицитов головного мозга как in vivo, так и ex vivo, сохраняются ограниченные знания относительно визуализации жизнеспособных и нежизнеспособных перицитовмозга в срезах мозга.

Важно отметить, что посттканевая фиксация перицитов головного мозга ставит под угрозу их жизнеспособность и последующую оценку сократительной способности. Более того, в таких сценариях, как неврологические расстройства (например, субарахноидальное кровоизлияние - САК), трансгенное мечение перицитов головного мозга не позволяет дифференцировать жизнеспособные и нежизнеспособные перициты, что подтверждается нашим предварительным исследованием САК-индуцированной смерти перицитов головного мозга9.

Чтобы преодолеть эти трудности, мы использовали TO-PRO-3 для маркировки живых перицитов, в то время как умершие были окрашены йодидом пропидия (PI). Мы использовали технологии конфокальной визуализации высокого разрешения для визуализации жизнеспособных и нежизнеспособных перицитов мозга в срезах мозга, сохраняя активность срезов во время визуализации. Целью данной статьи является представление воспроизводимого метода визуализации жизнеспособных и нежизнеспособных перицитов головного мозга в срезах мозга, служащего ценным инструментом для исследования влияния перицитов головного мозга на церебральную микроциркуляцию после САК.

протокол

Протокол эксперимента был одобрен Комитетом по этике и использованию животных Куньминского медицинского университета (kmmu20220945). Для настоящего исследования использовались крысы Sprague-Dawley (SD) обоего пола массой 300-350 г.

1. Индукция модели SAH

  1. Обезболивайте крыс 2% изофлураном и 100% кислородом. Поддерживайте анестезию, обеспечивая непрерывную ингаляционную анестезию изофлураном (1%-3%). Закрепите голову крысы с помощью стереотаксического аппарата (см. таблицу материалов).
  2. Создайте модель SAH, выполнив следующие действия.
    1. Введите иглу для микроинъекций в супраселлярный бачок. Затем с помощью шприцевого насоса вводят аутологичную кровь из хвостовой артерии крысы (без антикоагулянта) в супраселлярную цистерну (см. таблицу материалов).
    2. Имплантировать иглу для микроинъекций в правый боковой желудочек головного мозга по указанным координатам: брегма, −0,8 мм; боковой, 1,4 мм; глубина, 4 мм9. Для групп САК вводят 0,2 мл крови из хвостовой артерии крысы. Для фиктивных групп вводят тот же объем изотонического физиологического раствора (рис. 1А).

2. Подготовка и стабилизация среза мозга

  1. Глубоко обезболивайте крыс с помощью 2% ингаляций изофлурана. После обезглавливания извлеките весь мозг и погрузите его в ледяную искусственную спинномозговую жидкость (ACSF).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте свежеприготовленные растворы ACSF со следующим составом: 134 мМ NaCl, 2,8 мМ KCl, 29 мМ NaHCO3, 1,1 мМ 2 PO4, 1,5 мМ MgSO4, 2,5 мМ CaCl 2и 10,11 мМ D-глюкозы (см. Таблицу материалов). Поддерживайте рН в пределах от 7,3 до 7,4.
  2. Используйте вибратом (см. Таблицу материалов) для получения острых срезов мозга толщиной 200 мкм от крыс SD в ледяной ACSF, аэрированной 5% CO2 и 95%O2 (рис. 2).
  3. Поместите острые срезы мозга толщиной 200 мкм в камеру хранения на нейлоновую сетку, погруженную в ACSF. Уравновешивают раствор ACSF с 95% O2 и 5%CO2, поддерживая температурный диапазон 35-37 °C. Дайте срезам мозга стабилизироваться в течение 2 часов, дав им время приспособиться (рисунок 3).

3. Мечение перицитов в острых срезах головного мозга с помощью TO-PRO-3

ПРИМЕЧАНИЕ: Перициты из острых срезов головного мозга флуоресцентно мечили с помощью индикатора TO-PRO-310.

  1. Добавьте флуоресцентный краситель TO-PRO-3 в ACSF, достигнув конечной концентрации 1 мкМ. Инкубируйте острые срезы мозга при комнатной температуре в темной среде с ACSF, содержащим TO-PRO-3, в течение 20 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не забывайте надевать латексные перчатки при работе с TO-PRO-3 для защиты.
  2. Переместите сетчатое ситечко из нейлоновой сетки, несущее срезы мозга, из загрузочной камеры в 6-луночную камеру промывки пластин (см. Таблицу материалов). Оставьте ломтики мозга в промывочной камере в течение 10 минут (Рисунок 4D).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап ополаскивания прекращает процесс окрашивания, уменьшает фоновую маркировку и предотвращает неспецифическое окрашивание.
  3. Промывайте препараты в течение 15 минут раствором ACSF, уравновешенным смесью 5% CO 2 и 95% O2. Этот этап промывки останавливает поглощение красителя и сводит к минимуму фоновую маркировку (Рисунок 4C).

4. Окрашивание невитальных перицитов мозговой микроциркуляции в острых срезах головного мозга

  1. Инкубируют срезы мозга, предварительно загруженные TO-PRO-3 при 37 °C изолектином B4, конъюгированным с Alexa Fluor 488 (FITC-ISOB4; 5 мкг/мл, см. таблицу материалов), в течение 30 мин в темной среде. После инкубации промывают срезы мозга в течение 15 мин в ACSF (рис. 4E).
  2. Инкубируют срезы мозга в ACSF с 5% CO2 и 95%O2, как обычно. Добавьте йодид пропидия (PI) в концентрации 37 мкМ к обоим растворам при 37 °C. Это позволит пометить нежизненно важные перициты головного мозга. Инкубируйте препараты в этом растворе ACSF в течение 60 мин в темноте (Рисунок 4F).
  3. Затем промойте препараты в течение 15 минут растворами ACSF, чтобы остановить поглощение красителя и свести к минимуму фоновую маркировку.

5. Визуализация витальных и невитальных перицитов головного мозга в острых срезах головного мозга

  1. Аккуратно перенесите кусочки мозга в конфокальную чашку со стеклянным дном (см. Таблицу материалов) с помощью пластиковых пипеток Пастера. Наполните посуду раствором АКСФ, предварительно уравновешенным 5%СО2 и 95%О2. Используйте железную сетку, чтобы закрепить срезы мозга крысы на месте.
  2. Перенесите конфокальную посуду со стеклянным дном на предмет конфокального микроскопа. Расположите острый срез мозга на дне чашки и пропитайтеего раствором ACSF, уравновешенным смесью 95%O2 и 5%CO2 во время конфокальной микроскопии (рис. 5A и рис. 5Ab').
  3. Визуализируйте клетки стенки коры головного мозга с помощью 40-кратного объектива. Захват стопок изображений с помощью совместимого программного обеспечения (см. Таблицу материалов). Используйте соответствующие фильтры для IB4 (возбуждение/излучение 460 нм/520 нм), PI (возбуждение/излучение 545 нм/595 нм) и TO-PRO-3 (возбуждение/излучение 606 нм/666 нм) (рисунок 5D).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Снимайте изображения со следующими деталями: объектив DIC N1 40×, 3 × 12 бит: 512 × 512 пикселей (0,22 × 0,22 мм), калибровка: 0,42 мкм/пиксель.
  4. Идентификация микроциркуляторного русла головного мозга и перицитов на основе их сети и морфологии. Найдите определенную область, содержащую сеть микроциркуляторного русла головного мозга, на каждом срезе мозга и сделайте снимки.
  5. Внимательно запишите местоположение изображения, чтобы обеспечить согласованность при последующих снимках (рис. 5B, C). Для дальнейшей обработки и анализа используйте программное обеспечение для анализа изображений (ImageJ) и программное обеспечение для редактирования фотографий (см. Таблицу материалов).

Результаты

В нормальных физиологических условиях перициты головного мозга, как правило, не подвергаются клеточной гибели. Этот феномен показан на рисунке 6 , где желтый цвет указывает на наличие жизненно важных перицитов головного мозга; перициты головного мозга не показывают окр...

Обсуждение

Разработаны методы конфокальной визуализации высокого разрешения для визуализации жизненно важных перицитов головного мозга, невитальных перицитов головного мозга и микроциркуляторного русла в срезах мозга. В острых срезах мозга крыс процесс включает в себя первоначальное мечение ...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Исследование поддержано грантами Национального фонда естественных наук Китая (81960226,81760223); Фонд естественных наук провинции Юньнань (202001AS070045,202301AY070001-011)

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
6-well plateABC biochemistryABC703006RT
Adobe PhotoshopAdobeAdobe Illustrator CS6 16.0.0RT
Aluminium foilMIAOJIE225 mm x 273 mmRT
CaCl2·2H2OSigma-AldrichC3881RT
Confocal imaging softwareNikonNIS-Elements 4.10.00RT
Confocal Laser Scanning MicroscopeNikonN-SIM/C2siRT
Gas tank (5% CO2, 95% O2)PENGYIDA40LRT
Glass Bottom Confocal DishesBeyotimeFCFC020-10pcsRT
GlucoseSigma-AldrichG5767RT
GlueEVOBONDKH-502RT
Ice machineXUEKEIMS-20RT
Image analysis softwareNational Institutes of HealthImage JRT
Inhalation anesthesia systemSCIENCEQAF700RT
Isolectin B 4-FITCSIGMAL2895–2MGStore aliquots at –20 °C
KClSigma-Aldrich7447–40–7RT
KH2PO4Sigma-AldrichP0662RT
MgSO4Sigma-AldrichM7506RT
NaClSigma-Aldrich7647–14–5RT
NaH2PO4·H2OSigma-Aldrich10049–21–5RT
NaHCO3Sigma-AldrichS5761RT
Pasteur pipetteNEST Biotechnology318314RT
Peristaltic PumpScientific Industries IncModel 203RT
Propidium (Iodide)Med Chem ExpressHY-D0815/CS-7538Store aliquots at –20 °C
Stereotaxic apparatusSCIENCEQART
Syringe pumpHarvard PUMPPUMP 11 ELITE NanomiteRT
Thermostatic water bathOLABOHH-2RT
Vibrating microtomeLeicaVT1200RT

Ссылки

  1. Dalkara, T., Gursoy-Ozdemir, Y., Yemisci, M. Brain microvascular pericytes in health and disease. Acta Neuropathologica. 122 (1), 1-9 (2011).
  2. Dore-Duffy, P., Cleary, K. Morphology and properties of pericytes. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 686, 49-68 (2011).
  3. Peppiatt, C. M., Howarth, C., Mobbs, P., Attwell, D. Bidirectional control of CNS capillary diameter by pericytes. Nature. 443 (7112), 700-704 (2006).
  4. Attwell, D., Mishra, A., Hall, C. N., O'Farrell, F. M., Dalkara, T. What is a pericyte. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (2), 451-455 (2016).
  5. Yemisci, M., Gursoy-Ozdemir, Y., Vural, A., Can, A., Topalkara, K., Dalkara, T. Pericyte contraction induced by oxidative-nitrative stress impairs capillary reflow despite successful opening of an occluded cerebral artery. Nature Medicine. 15 (9), 1031-1037 (2009).
  6. Korte, N., et al. Noradrenaline released from locus coeruleus axons contracts cerebral capillary pericytes via α2 adrenergic receptors. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2023).
  7. Hirunpattarasilp, C., Barkaway, A., Davis, H., Pfeiffer, T., Sethi, H., Attwell, D. Hyperoxia evokes pericyte-mediated capillary constriction. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 42 (11), 2032-2047 (2022).
  8. Neuhaus, A. A., Couch, Y., Sutherland, B. A., Buchan, A. M. Novel method to study pericyte contractility and responses to ischaemia in vitro using electrical impedance. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2013-2024 (2017).
  9. Gong, Y., et al. Increased TRPM4 Activity in cerebral artery myocytes contributes to cerebral blood flow reduction after subarachnoid hemorrhage in rats. Neurotherapeutics: The Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 16 (3), 901-911 (2019).
  10. Mai-Morente, S. P., et al. Pericyte mapping in cerebral slices with the far-red fluorophore TO-PRO-3. Bio-protocol. 11 (22), e4222 (2021).
  11. Mai-Morente, S. P., Marset, V. M., Blanco, F., Isasi, E. E., Abudara, V. A nuclear fluorescent dye identifies pericytes at the neurovascular unit. Journal of Neurochemistry. 157 (4), 1377-1391 (2021).
  12. Zhao, H., et al. Rationale for the real-time and dynamic cell death assays using propidium iodide. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (4), 399-405 (2010).
  13. Van Hooijdonk, C. A., Glade, C. P., Van Erp, P. E. TO-PRO-3 iodide: A novel HeNe laser-excitable DNA stain as an alternative for propidium iodide in multiparameter flow cytometry. Cytometry. 17 (2), 185-189 (1994).
  14. Lacar, B., Herman, P., Platel, J. C., Kubera, C., Hyder, F., Bordey, A. Neural progenitor cells regulate capillary blood flow in the postnatal subventricular zone. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32 (46), 16435-16448 (2012).
  15. Mai-Morente, S. P., Marset, V. M., Blanco, F., Isasi, E. E., Abudara, V. A nuclear fluorescent dye identifies pericytes at the neurovascular unit. Journal of Neurochemistry. 157 (4), 1377-1391 (2021).
  16. Hezel, M., Ebrahimi, F., Koch, M., Dehghani, F. Propidium iodide staining: a new application in fluorescence microscopy for analysis of cytoarchitecture in adult and developing rodent brain. Micron (Oxford, England). 43 (10), 1031-1038 (2012).
  17. Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. The perivascular astroglial sheath provides a complete covering of the brain microvessels: An electron microscopic 3D reconstruction. Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены