Визуализация витальных и невитальных перицитов головного мозга в срезах мозга после субарахноидального кровоизлияния

Резюме

Предварительное расследование подтверждает, что субарахноидальное кровоизлияние (САК) вызывает гибель перицитов головного мозга. Оценка сократительной способности перицитов после САК требует дифференциации жизнеспособных и нежизнеспособных перицитов головного мозга. В связи с этим была разработана процедура одновременной маркировки жизнеспособных и нежизнеспособных перицитов головного мозга в срезах мозга, что облегчает наблюдение с помощью конфокального микроскопа высокого разрешения.

Аннотация

Перициты являются важнейшими клетками-стенками, расположенными в микроциркуляции головного мозга, которые играют ключевую роль в активной модуляции мозгового кровотока путем регулирования сократительной способности. Обычно их сократительная способность измеряется путем наблюдения морфологических сдвигов и изменений диаметра капилляров в непосредственной близости при определенных обстоятельствах. Тем не менее, посттканевая фиксация, оценка жизнеспособности и последующая сократительная способность перицитов визуализированных перицитов головного мозга оказывается под угрозой. Аналогичным образом, генетическая маркировка перицитов головного мозга не позволяет провести различие между жизнеспособными и нежизнеспособными перицитами, особенно при неврологических состояниях, таких как субарахноидальное кровоизлияние (САК), когда наше предварительное исследование подтверждает гибель перицитов головного мозга. Для преодоления этих ограничений был разработан надежный протокол, позволяющий одновременно флуоресцентно помечать как функциональные, так и нефункциональные перициты мозга в отделах мозга. Этот метод мечения позволяет визуализировать с помощью конфокального микроскопа с высоким разрешением, одновременно отмечая микроциркуляторное русло среза мозга. Этот инновационный протокол позволяет оценить сократительную способность перицитов головного мозга, их влияние на диаметр капилляров и структуру перицитов. Исследование сократительной способности перицитов головного мозга в контексте САК дает глубокое понимание ее влияния на церебральную микроциркуляцию.

Введение

Перициты головного мозга, отличающиеся тонкими выпуклостями и выступающими телами клеток, окружают микроциркуляцию ^1,2. В то время как увеличение мозгового кровотока в основном обусловлено расширением капилляров, более мелкие артерии демонстрируют более медленные темпы расширения³. Сократительная способность перицитов оказывает влияние на диаметр капилляров и морфологию перицитов, влияя на сосудистую динамику⁴. Сокращение перицитов головного мозга приводит к сужению капилляров, а при патологических сценариях чрезмерное сокращение может препятствовать потоку эритр....

протокол

Протокол эксперимента был одобрен Комитетом по этике и использованию животных Куньминского медицинского университета (kmmu20220945). Для настоящего исследования использовались крысы Sprague-Dawley (SD) обоего пола массой 300-350 г.

1. Индукция модели SAH

1. Обезболивайте крыс 2% изофлураном и 100% кислородом. Поддерживайте анестезию, обеспечивая непрерывную ингаляционную анестезию изофлураном (1%-3%). Закрепите голову крысы с помощью стереотаксического аппарата (см. таблицу материалов).
2. Создайте модель SAH, выполнив следующие действия.
   1. Введите иглу для микроинъекций в супраселлярный ....

Результаты

В нормальных физиологических условиях перициты головного мозга, как правило, не подвергаются клеточной гибели. Этот феномен показан на рисунке 6 , где желтый цвет указывает на наличие жизненно важных перицитов головного мозга; перициты головного мозга не показывают окр.......

Обсуждение

Разработаны методы конфокальной визуализации высокого разрешения для визуализации жизненно важных перицитов головного мозга, невитальных перицитов головного мозга и микроциркуляторного русла в срезах мозга. В острых срезах мозга крыс процесс включает в себя первоначальное мечение .......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well plate	ABC biochemistry	ABC703006	RT
Adobe Photoshop	Adobe	Adobe Illustrator CS6 16.0.0	RT
Aluminium foil	MIAOJIE	225 mm x 273 mm	RT
CaCl2·2H2O	Sigma-Aldrich	C3881	RT
Confocal imaging software	Nikon	NIS-Elements 4.10.00	RT
Confocal Laser Scanning Microscope	Nikon	N-SIM/C2si	RT
Gas tank (5% CO2, 95% O2)	PENGYIDA	40L	RT
Glass Bottom Confocal Dishes	Beyotime	FCFC020-10pcs	RT
Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	RT
Glue	EVOBOND	KH-502	RT
Ice machine	XUEKE	IMS-20	RT
Image analysis software	National Institutes of Health	Image J	RT
Inhalation anesthesia system	SCIENCE	QAF700	RT
Isolectin B 4-FITC	SIGMA	L2895–2MG	Store aliquots at –20 °C
KCl	Sigma-Aldrich	7447–40–7	RT
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P0662	RT
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506	RT
NaCl	Sigma-Aldrich	7647–14–5	RT
NaH2PO4·H2O	Sigma-Aldrich	10049–21–5	RT
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761	RT
Pasteur pipette	NEST Biotechnology	318314	RT
Peristaltic Pump	Scientific Industries Inc	Model 203	RT
Propidium (Iodide)	Med Chem Express	HY-D0815/CS-7538	Store aliquots at –20 °C
Stereotaxic apparatus	SCIENCE	QA	RT
Syringe pump	Harvard PUMP	PUMP 11 ELITE Nanomite	RT
Thermostatic water bath	OLABO	HH-2	RT
Vibrating microtome	Leica	VT1200	RT