Imagem de Pericitos Cerebrais Vitais e Não Vitais em Fatias Cerebrais após Hemorragia Subaracnóidea

Resumo

A investigação preliminar confirma que a hemorragia subaracnóidea (HSA) causa a morte do pericito cerebral. A avaliação da contratilidade dos pericitos pós-HAS requer diferenciação entre pericitos cerebrais viáveis e não viáveis. Assim, um procedimento foi desenvolvido para marcar pericitos cerebrais viáveis e não viáveis simultaneamente em cortes cerebrais, facilitando a observação usando um microscópio confocal de alta resolução.

Resumo

Os pericitos são células murais cruciais situadas dentro da microcirculação cerebral, fundamentais na modulação ativa do fluxo sanguíneo cerebral através de ajustes de contratilidade. Convencionalmente, sua contratilidade é aferida observando-se deslocamentos morfológicos e alterações no diâmetro capilar próximo em circunstâncias específicas. No entanto, a fixação pós-tecidual, avaliando a vitalidade e a consequente contratilidade dos pericitos cerebrais imageados, fica comprometida. Da mesma forma, a marcação genética de pericitos cerebrais é insuficiente na distinção entre pericitos viáveis e não viáveis, particularmente em condições neurológicas como hemorragia subaracnóidea (HSA), onde nossa investigação preliminar valida a morte de pericitos cerebrais. Um protocolo confiável foi desenvolvido para superar essas restrições, permitindo a marcação fluorescente simultânea de pericitos cerebrais funcionais e não funcionais em seções cerebrais. Este método de marcação permite a visualização em microscópio confocal de alta resolução, marcando concomitantemente a microvasculatura do corte cerebral. Este protocolo inovador oferece um meio de avaliar a contratilidade do pericito cerebral, seu impacto no diâmetro capilar e na estrutura do pericito. A investigação da contratilidade dos pericitos cerebrais no contexto da HAS permite uma compreensão perspicaz de seus efeitos na microcirculação cerebral.

Introdução

Os pericitos cerebrais, que se distinguem por suas protuberâncias delgadas e corpos celulares salientes, circundam a microcirculação ^1,2. Enquanto o aumento do fluxo sanguíneo cerebral é predominantemente impulsionado pela dilatação capilar, as artérias menores exibem taxas de dilatação mais lentas³. A contratilidade dos perócitos exerce influência sobre o diâmetro capilar e a morfologia dos pericitos, afetando a dinâmica vascular⁴. A contração dos pericitos cerebrais leva à constrição capilar e, em cenários patológicos, a contração excessiva pode impedir o fluxo eritrocitário⁵. Vários fatores, incluindo a noradrenalina liberada do locus coeruleus, podem induzir a contração do pericícito cerebral dentro dos capilares⁶. Com papel regulador no fluxo sanguíneo cerebral, os pericitos exibem síntese de 20-TETE, servindo como sensor de oxigênio durante a hiperóxia⁷. A contração dos pericitos cerebrais desencadeada pelo estresse oxidativo-nitrativo afeta negativamente os capilares⁵. Apesar das investigações in vivo e ex vivo sobre a contração do pericito cerebral⁸, persiste um conhecimento limitado sobre a obtenção de imagens de pericitos cerebrais viáveis e não viáveis em fatias cerebrais.

Crucialmente, a imagem pós-fixação tecidual dos pericitos cerebrais compromete sua vitalidade e subsequente avaliação da contratilidade. Além disso, em cenários como distúrbios neurológicos (por exemplo, hemorragia subaracnóidea - HSA), a marcação transgênica de pericitos cerebrais falha em diferenciar entre pericitos viáveis e não viáveis, como confirmado por nosso estudo preliminar de morte cerebral induzida por^HAS9.

Para superar esses desafios, empregamos o TO-PRO-3 para marcar pericitos vivos, enquanto os falecidos foram corados com iodeto de propídio (PI). Usamos tecnologias de imagem confocal de alta resolução para visualizar pericitos cerebrais viáveis e não viáveis em cortes cerebrais, preservando a atividade de cortes durante exames de imagem. Este artigo tem como objetivo apresentar um método reprodutível para obtenção de imagens de pericitos cerebrais viáveis e não viáveis em cortes cerebrais, servindo como uma ferramenta valiosa para investigar o impacto dos pericitos cerebrais na microcirculação cerebral pós-HAS.

Protocolo

O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Ética e Uso de Animais da Kunming Medical University (kmmu20220945). Ratos Sprague-Dawley (SD) de ambos os sexos, 300-350 g, foram utilizados para o presente estudo.

1. Indução do modelo de HAS

1. Anestesiar os ratos com isoflurano a 2% e oxigênio a 100%. Manter a anestesia fornecendo anestesia inalatória contínua com isoflurano (1%-3%). Fixe a cabeça do rato utilizando um aparelho estereotáxico (ver Tabela de Materiais).
2. Crie o modelo SAH seguindo as etapas abaixo.
   1. Insira uma agulha de microinjeção na cisterna suprasselar. Em seguida, injete sangue autólogo da artéria caudal do rato (sem anticoagulante) na cisterna suprasselar usando uma bomba de seringa (ver Tabela de Materiais).
   2. Implantar uma agulha de microinjeção no ventrículo cerebral lateral direito usando as coordenadas mencionadas: bregma, −0,8 mm; lateral, 1,4 mm; profundidade, 4 mm⁹. Para os grupos de HAS, injetar 0,2 mL de sangue da artéria caudal do rato. Para grupos sham, administrar o mesmo volume de solução salina isotônica (Figura 1A).

2. Preparação e estabilização de fatias cerebrais

1. Anestesiar profundamente os ratos usando inalação de isoflurano a 2%. Após a decapitação, extraia todo o cérebro e mergulhe-os no líquido cefalorraquidiano artificial gelado (ACSF).
   NOTA: Use soluções ACSF recém-preparadas com a seguinte composição: 134 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 29 mM NaHCO₃, 1,1 mM NaH 2 PO 4, 1,5 mM MgSO₄, 2,5 mM CaCl ₂e 10,11 mM D-Glucose (ver Tabela de Materiais). Manter um pH entre 7,3 e 7,4.
2. Use um vibratomo (ver Tabela de Materiais) para preparar cortes cerebrais agudos com uma espessura de 200 μm dos ratos SD em ACSF gelada que é aerada com 5% CO 2 e 95% O 2 (Figura ₂).
3. Coloque os cortes cerebrais agudos de 200 μm de espessura em uma câmara de armazenamento sobre uma tela de nylon submersa em ACSF. Equilibrar a solução de ACSF com 95% de O 2 e 5% de CO₂, mantendo uma faixa de temperatura de 35-37 °C. Permitir que os cortes cerebrais se estabilizem por 2 h, dando-lhes tempo para se ajustar (Figura 3).

3. Marcação de pericitos em cortes cerebrais agudos com TO-PRO-3

NOTA: Os pericitos dos cortes cerebrais agudos foram marcados fluorescentemente usando o traçador TO-PRO-3¹⁰.

1. Adicione o corante fluorescente TO-PRO-3 à ACSF, obtendo uma concentração final de 1 μM. Incubar as fatias cerebrais agudas à temperatura ambiente em um ambiente escuro com a ACSF contendo TO-PRO-3 por 20 min.
   NOTA: Lembre-se de usar luvas de látex ao manusear TO-PRO-3 para proteção.
2. Transfira o filtro de malha de nylon, carregando as fatias cerebrais, da câmara de carga para uma câmara de enxágue de placa de 6 poços (consulte Tabela de Materiais). Permitir que os cortes cerebrais permaneçam na câmara de enxágue por 10 min (Figura 4D).
   NOTA: Esta etapa de enxágue encerra o processo de coloração, diminui a marcação de fundo e evita manchas inespecíficas.
3. Enxaguar as preparações por um total de 15 min usando solução de ACSF equilibrada com uma mistura de 5% CO 2 e 95% O₂. Essa etapa de enxágue interrompe a absorção do corante e minimiza a marcação de fundo (Figura 4C).

4. Coloração de pericitos não vitais da microcirculação cerebral em cortes cerebrais agudos

1. Incubar fatias cerebrais pré-carregadas com TO-PRO-3 a 37 °C com isolectina B4 conjugada a Alexa Fluor 488 (FITC-ISOB4; 5 μg/mL, ver Tabela de Materiais) por 30 min em um ambiente escuro. Após a incubação, enxaguar os cortes cerebrais por 15 min em ACSF (Figura 4E).
2. Incubar as fatias cerebrais em ACSF gaseadas com 5% CO 2 e 95% O₂ como de costume. Adicionar iodeto de propídio (PI) a uma concentração de 37 μM a ambas as soluções a 37 °C. Isso rotulará os pericitos cerebrais não vitais. Incubar as preparações nesta solução de ACSF por 60 min no escuro (Figura 4F).
3. Em seguida, lave as preparações por 15 minutos com soluções ACSF para interromper a absorção de corante e minimizar a rotulagem de fundo.

5. Imagem de pericitos cerebrais vitais e não vitais em cortes cerebrais agudos

1. Transfira suavemente fatias cerebrais para pratos confocais com fundo de vidro (ver Tabela de Materiais) usando pipetas plásticas Pasteur. Recheie os pratos com solução de ACSF previamente equilibrada com 5% de CO 2 e 95% de O₂. Use uma malha de ferro para fixar fatias de cérebro de rato no lugar.
2. Transfira as placas confocais de fundo de vidro para o estágio de um microscópio confocal. Posicionar o corte cerebral agudo no fundo da placa e perfundi-lo⁹ com solução de ACSF equilibrada com uma mistura de O₂ a 95% e CO₂ a 5% durante a microscopia confocal (Figura 5A e Figura 5Ab').
3. Visualize as células da parede da microvasculatura cortical cerebral usando uma objetiva de 40x. Capture pilhas de imagens usando software compatível (consulte Tabela de Materiais). Utilizar filtros apropriados para IB4 (excitação/emissão 460 nm/520 nm), PI (excitação/emissão 545 nm/595 nm) e TO-PRO-3 (excitação/emissão 606 nm/666 nm) (Figura 5D).
   NOTA: Capture imagens com os seguintes detalhes: lente objetiva DIC N1 de 40×, 3 × 12 bits: 512 × 512 pixels (0,22 × 0,22 mm), calibração: 0,42 μm/px.
4. Identificar microvasculatura e pericitos cerebrais com base em sua rede e morfologia. Localize uma região específica contendo uma rede de microvasculatura cerebral em cada fatia cerebral e capture imagens.
5. Observe cuidadosamente a localização das imagens para garantir a consistência nas capturas subsequentes (Figura 5B,C). Para processamento e análise posteriores, use software de análise de imagem (ImageJ) e software de edição de fotos (consulte Tabela de Materiais).

Resultados

Em condições fisiológicas normais, os pericitos cerebrais geralmente não sofrem morte celular. A Figura 6 ilustra esse fenômeno, com amarelo indicando a presença de pericitos cerebrais vitais; os pericitos cerebrais não apresentam coloração com IP, indicando sua viabilidade. Para investigar melhor se os pericitos permanecem aderidos à microvasculatura após a morte celular, métodos foram empregados em um modelo de HAS em ratos, e imagens subsequentes foram conduzidas.

Discussão

São desenvolvidas técnicas de imagem confocal de alta resolução para visualização de pericitos cerebrais vitais, pericitos cerebrais não vitais e microvasculatura em fatias cerebrais. Em cortes agudos de cérebro de ratos, o processo envolve a marcação inicial dos pericitos com TO-PRO-3¹¹, seguida por células endoteliais microvasculares com IB4¹²; posteriormente, a identificação dos pericitos falecidos é realizada por meio do IP. Este protocolo é simples, repr...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well plate	ABC biochemistry	ABC703006	RT
Adobe Photoshop	Adobe	Adobe Illustrator CS6 16.0.0	RT
Aluminium foil	MIAOJIE	225 mm x 273 mm	RT
CaCl2·2H2O	Sigma-Aldrich	C3881	RT
Confocal imaging software	Nikon	NIS-Elements 4.10.00	RT
Confocal Laser Scanning Microscope	Nikon	N-SIM/C2si	RT
Gas tank (5% CO2, 95% O2)	PENGYIDA	40L	RT
Glass Bottom Confocal Dishes	Beyotime	FCFC020-10pcs	RT
Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	RT
Glue	EVOBOND	KH-502	RT
Ice machine	XUEKE	IMS-20	RT
Image analysis software	National Institutes of Health	Image J	RT
Inhalation anesthesia system	SCIENCE	QAF700	RT
Isolectin B 4-FITC	SIGMA	L2895–2MG	Store aliquots at –20 °C
KCl	Sigma-Aldrich	7447–40–7	RT
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P0662	RT
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506	RT
NaCl	Sigma-Aldrich	7647–14–5	RT
NaH2PO4·H2O	Sigma-Aldrich	10049–21–5	RT
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761	RT
Pasteur pipette	NEST Biotechnology	318314	RT
Peristaltic Pump	Scientific Industries Inc	Model 203	RT
Propidium (Iodide)	Med Chem Express	HY-D0815/CS-7538	Store aliquots at –20 °C
Stereotaxic apparatus	SCIENCE	QA	RT
Syringe pump	Harvard PUMP	PUMP 11 ELITE Nanomite	RT
Thermostatic water bath	OLABO	HH-2	RT
Vibrating microtome	Leica	VT1200	RT