הדמיה של פריציטים חיוניים ולא חיוניים במוח בפרוסות מוח לאחר דימום תת-עכבישי

Summary

החקירה הראשונית מאשרת כי דימום תת-עכבישי (SAH) גורם למוות של פריציטים במוח. הערכת התכווצות פריציטים לאחר SAH דורשת הבחנה בין פריציטים חיים ולא קיימא במוח. לפיכך, פותח הליך לסימון פריציטים במוח בני קיימא ושאינם בני קיימא בו זמנית בקטעי מוח, מה שמקל על תצפית באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי ברזולוציה גבוהה.

Abstract

פריציטים הם תאי קיר חיוניים הממוקמים בתוך מיקרוסירקולציה מוחית, חיוניים בוויסות פעיל של זרימת הדם במוח באמצעות התאמות התכווצות. באופן קונבנציונלי, ההתכווצות שלהם נמדדת על ידי התבוננות בתזוזות מורפולוגיות ושינויים בקוטר הנימים הסמוכים בנסיבות ספציפיות. עם זאת, קיבוע לאחר רקמות, הערכת חיוניות והתכווצות פריציטים כתוצאה מכך של פריציטים במוח המודמיים נפגעים. באופן דומה, תיוג גנטי של פריציטים במוח אינו מבחין בין פריציטים בני קיימא ושאינם בני קיימא, במיוחד במצבים נוירולוגיים כמו דימום תת-עכבישי (SAH), שם החקירה הראשונית שלנו מאמתת את מותו של פריציטים במוח. פרוטוקול אמין פותח כדי להתגבר על אילוצים אלה, המאפשר תיוג פלואורסצנטי בו זמנית של פריציטים במוח תפקודיים ולא פונקציונליים באזורי מוח. שיטת תיוג זו מאפשרת הדמיה של מיקרוסקופ קונפוקלי ברזולוציה גבוהה, ובו זמנית מסמנת את פרוסת המוח microvasculature. פרוטוקול חדשני זה מציע אמצעי להערכת התכווצות הפריציטים במוח, השפעתה על קוטר הנימים ומבנה הפריציטים. חקירת התכווצות פריציטים במוח בהקשר SAH מניבה הבנה מעמיקה של השפעותיה על מיקרו-סירקולציה מוחית.

Introduction

פריציטים במוח, המובחנים על ידי הבליטות הדקות שלהם וגופי התא הבולטים, מקיפים את microcirculation ^1,2. בעוד שהגברת זרימת הדם במוח מונעת בעיקר על ידי התרחבות נימית, עורקים קטנים יותר מציגים קצב התרחבות איטי יותר³. התכווצות פריציטים משפיעה על קוטר הנימים ועל המורפולוגיה של הפריציטים, ומשפיעה על דינמיקת כלי הדם⁴. התכווצות של פריציטים במוח מובילה להתכווצות נימית, ובתרחישים פתולוגיים, התכווצות יתר עלולה לעכב את זרימת אריתרוציטים⁵. גורמים שונים, כולל נוראפינפרין המשתחרר מהלוקוס קורולוס, יכולים לגרום להתכווצות פריציטים במוח בתוך נימים⁶. עם תפקיד מווסת בזרימת הדם במוח, פריציטים מציגים סינתזת 20-HETE, ומשמשים כחיישן חמצן במהלך היפראוקסיה⁷. התכווצות המופעלת על ידי מתח חמצוני-חנקני של פריציטים במוח משפיעה לרעה על נימים⁵. למרות מחקרי in vivo ו-ex vivo על התכווצות פריציטים במוח⁸, קיים ידע מוגבל בנוגע לדימות של פריציטים מוחיים בני קיימא ובלתי ברי קיימא בתוך פרוסות מוח.

באופן מכריע, דימות לאחר קיבוע רקמות של פריציטים במוח פוגע בחיוניותם ובהערכת ההתכווצות שלאחר מכן. יתר על כן, בתרחישים כגון הפרעות נוירולוגיות (למשל, דימום תת-עכבישי - SAH), תיוג מהונדס של פריציטים במוח אינו מצליח להבדיל בין פריציטים ברי קיימא ושאינם בני קיימא, כפי שאושר במחקר המוות הראשוני שלנו של פריציטים במוח הנגרם על ידי SAH⁹.

כדי להתגבר על אתגרים אלה, השתמשנו ב-TO-PRO-3 כדי לתייג פריציטים חיים, בעוד שהמתים הוכתמו בפרופידיום יודיד (PI). השתמשנו בטכנולוגיות דימות קונפוקלי ברזולוציה גבוהה כדי להמחיש פריציטים חיים ולא בני קיימא במוח בפרוסות מוח, תוך שמירה על פעילות הפרוסות במהלך ההדמיה. מאמר זה נועד להציג שיטה הניתנת לשחזור לדימות פריציטים ברי קיימא ושאינם בני קיימא במוח בפרוסות מוח, המשמשת ככלי רב ערך לחקירת ההשפעה של פריציטים במוח על מיקרו-סירקולציה מוחית לאחר SAH.

Protocol

פרוטוקול הניסוי אושר על ידי ועדת האתיקה והשימוש בבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית של קונמינג (kmmu20220945). במחקר הנוכחי נעשה שימוש בחולדות Sprague-Dawley (SD) משני המינים, 300-350 גרם.

1. השראת מודל SAH

1. מרדימים את החולדות באמצעות 2% איזופלורן ו-100% חמצן. לשמור על הרדמה על ידי אספקת הרדמה רציפה עם איזופלורן (1%-3%). אבטחו את ראש החולדה באמצעות מנגנון סטריאוטקסי (ראו טבלת חומרים).
2. צור את מודל SAH לפי השלבים הבאים.
   1. הכנס מחט מיקרו-הזרקה לבור המים העל-סלרי. לאחר מכן, הזריקו דם אוטולוגי מעורק הזנב של החולדה (ללא נוגדי קרישה) לבור המים העל-סלרי באמצעות משאבת מזרק (ראו טבלת חומרים).
   2. להשתיל מחט microinjection לתוך החדר המוחי לרוחב ימין באמצעות הקואורדינטות שהוזכרו: bregma, −0.8 מ"מ; לרוחב, 1.4 מ"מ; עומק, 4 מ"מ⁹. עבור קבוצות SAH, להזריק 0.2 מ"ל של דם עורק זנב חולדה. עבור קבוצות דמה, יש לתת את אותו נפח של מי מלח איזוטוניים (איור 1A).

2. הכנת פרוסת המוח וייצוב

1. מרדימים עמוקות את החולדות באמצעות שאיפת איזופלורן 2%. לאחר עריפת הראש, חלצו את כל המוחות וטבלו אותם בנוזל מוחי מלאכותי קר כקרח (ACSF).
   הערה: השתמש בפתרונות ACSF טריים שהוכנו עם ההרכב הבא: 134 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 29 mM NaHCO₃, 1.1 mM NaH 2 PO 4, 1.5 mM MgSO₄, 2.5 mM CaCl₂ו- 10.11 mM D-Glucose (ראה טבלת חומרים). שמור על pH בין 7.3 ל 7.4.
2. השתמשו בוויברטום (ראו טבלת חומרים) כדי להכין פרוסות מוח חריפות בעובי של 200 מיקרומטר מחולדות SD ב-ACSF קר כקרח שמאוורר עם 5% CO 2 ו-95% O 2 (איור 2).
3. הניחו את פרוסות המוח החריפות בעובי 200 מיקרומטר בתא אחסון על רשת ניילון שקועה ב-ACSF. אזנו את תמיסת ACSF עם 95% O 2 ו-5% CO₂, תוך שמירה על טווח טמפרטורות של 35-37°C. אפשרו לפרוסות המוח להתייצב במשך שעתיים, מה שנתן להן זמן להסתגל (איור 3).

3. תיוג פריציטים בפרוסות מוח חריפות עם TO-PRO-3

הערה: פריציטים מפרוסות מוח חריפות סומנו באופן פלואורסצנטי באמצעות נותב TO-PRO-3¹⁰.

1. הוסיפו את הצבע הפלואורסצנטי TO-PRO-3 ל-ACSF והגיעו לריכוז סופי של 1 מיקרומטר. דגרו על פרוסות המוח החריפות בטמפרטורת החדר בסביבה חשוכה עם ACSF המכיל TO-PRO-3 למשך 20 דקות.
   הערה: זכור ללבוש כפפות לטקס בעת הטיפול ב-TO-PRO-3 להגנה.
2. מעבירים את מסננת רשת הניילון, הנושאת את פרוסות המוח, מתא ההעמסה לתא שטיפת צלחות בעל 6 בארות (ראו טבלת חומרים). אפשרו לפרוסות המוח להישאר בתא השטיפה במשך 10 דקות (איור 4D).
   הערה: שלב שטיפה זה מסיים את תהליך הצביעה, מפחית את תיוג הרקע ומונע כתמים לא ספציפיים.
3. שטפו את התכשירים במשך 15 דקות בסך הכל באמצעות תמיסת ACSF המאוזנת לתערובת של 5% CO 2 ו-95% O₂. שלב השטיפה הזה עוצר את ספיגת הצבע וממזער את תיוג הרקע (איור 4C).

4. צביעת פריציטים לא חיוניים של microcirculation מוחי בפרוסות מוח חריפה

1. דגרו פרוסות מוח טעונות מראש ב-TO-PRO-3 בטמפרטורה של 37°C עם איזולקטין B4 מצומד ל-Alexa Fluor 488 (FITC-ISOB4; 5 מיקרוגרם/מ"ל, ראו טבלת חומרים) למשך 30 דקות בסביבה חשוכה. לאחר הדגירה, שטפו את פרוסות המוח במשך 15 דקות ב-ACSF (איור 4E).
2. לדגור על פרוסות המוח בגז ACSF עם 5% CO 2 ו 95% O₂ כרגיל. הוסף פרופידיום יודיד (PI) בריכוז של 37 מיקרומטר לשתי התמיסות ב 37 ° C. זה יתייג פריציטים במוח שאינם חיוניים. דגרו על התכשירים בתמיסת ACSF זו במשך 60 דקות בחושך (איור 4F).
3. לאחר מכן, שטפו את התכשירים במשך 15 דקות עם תמיסות ACSF כדי לעצור את ספיגת הצבע ולמזער את תיוג הרקע.

5. הדמיה של פריציטים חיוניים ולא חיוניים במוח בפרוסות מוח חריפות

1. מעבירים בעדינות פרוסות מוח לכלים קונפוקליים בתחתית זכוכית (ראו טבלת חומרים) בעזרת פיפטות פלסטיק של פסטר. מלאו את הכלים בתמיסת ACSF ששוותה בעבר עם 5% CO 2 ו-95% O₂. השתמשו ברשת ברזל כדי לאבטח פרוסות מוח של חולדות במקומן.
2. מעבירים את הכלים הקונפוקליים בתחתית הזכוכית לשלב של מיקרוסקופ קונפוקלי. מקמו את פרוסת המוח החריפה בתחתית הצלחת^ונתלו 9 אותה בתמיסת ACSF המאוזנת לתערובת של 95% O₂ ו-5%_CO2 במהלך דימות מיקרוסקופ קונפוקלי (איור 5A ואיור 5Ab).
3. דמיינו את תאי הקיר של כלי הדם בקליפת המוח באמצעות מטרה של פי 40. לכוד אוספי תמונות באמצעות תוכנה תואמת (ראה רשימת חומרים). השתמש במסננים מתאימים עבור IB4 (עירור/פליטה 460 ננומטר/520 ננומטר), PI (עירור/פליטה 545 ננומטר/595 ננומטר) ו-TO-PRO-3 (עירור/פליטה 606 ננומטר/666 ננומטר) (איור 5D).
   הערה: צלם תמונות עם הפרטים הבאים: 40× DIC N1 עדשה אובייקטיבית, 3 × 12 סיביות: 512 × 512 פיקסלים (0.22 × 0.22 מ"מ), כיול: 0.42 מיקרומטר/פיקסלים.
4. לזהות microvasculature מוחי ו pericytes מבוסס על הרשת שלהם ואת המורפולוגיה. אתר אזור ספציפי המכיל רשת כלי דם מוחיים על כל פרוסת מוח וצלם תמונות.
5. שימו לב בזהירות למיקום ההדמיה כדי להבטיח עקביות בלכידות הבאות (איור 5B,C). לעיבוד וניתוח נוספים, השתמש בתוכנה לניתוח תמונות (ImageJ) ובתוכנה לעריכת תמונות (ראה טבלת חומרים).

תוצאות

בתנאים פיזיולוגיים רגילים, פריציטים במוח בדרך כלל אינם עוברים מוות תאי. איור 6 ממחיש את התופעה הזו, כאשר צהוב מציין נוכחות של פריציטים חיוניים במוח; פריציטים במוח אינם מראים כתמים עם PI, מה שמצביע על יכולת הקיום שלהם. כדי להמשיך ולחקור אם פריציטים נשארים מחוברים לכלי הדם הזעי...

Discussion

פותחו טכניקות הדמיה קונפוקלית ברזולוציה גבוהה להדמיית פריציטים חיוניים במוח, פריציטים לא חיוניים במוח והמיקרו-כלי דם בפרוסות מוח. בפרוסות מוח חריפות של חולדות, התהליך כרוך בתיוג ראשוני של פריציטים עם TO-PRO-3¹¹, ואחריו תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים עם IB4¹²; לאחר מכן, זיהו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well plate	ABC biochemistry	ABC703006	RT
Adobe Photoshop	Adobe	Adobe Illustrator CS6 16.0.0	RT
Aluminium foil	MIAOJIE	225 mm x 273 mm	RT
CaCl2·2H2O	Sigma-Aldrich	C3881	RT
Confocal imaging software	Nikon	NIS-Elements 4.10.00	RT
Confocal Laser Scanning Microscope	Nikon	N-SIM/C2si	RT
Gas tank (5% CO2, 95% O2)	PENGYIDA	40L	RT
Glass Bottom Confocal Dishes	Beyotime	FCFC020-10pcs	RT
Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	RT
Glue	EVOBOND	KH-502	RT
Ice machine	XUEKE	IMS-20	RT
Image analysis software	National Institutes of Health	Image J	RT
Inhalation anesthesia system	SCIENCE	QAF700	RT
Isolectin B 4-FITC	SIGMA	L2895–2MG	Store aliquots at –20 °C
KCl	Sigma-Aldrich	7447–40–7	RT
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P0662	RT
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506	RT
NaCl	Sigma-Aldrich	7647–14–5	RT
NaH2PO4·H2O	Sigma-Aldrich	10049–21–5	RT
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761	RT
Pasteur pipette	NEST Biotechnology	318314	RT
Peristaltic Pump	Scientific Industries Inc	Model 203	RT
Propidium (Iodide)	Med Chem Express	HY-D0815/CS-7538	Store aliquots at –20 °C
Stereotaxic apparatus	SCIENCE	QA	RT
Syringe pump	Harvard PUMP	PUMP 11 ELITE Nanomite	RT
Thermostatic water bath	OLABO	HH-2	RT
Vibrating microtome	Leica	VT1200	RT