Subaraknoid Kanama Sonrası Beyin Dilimlerinde Vital ve Non-vital Beyin Perisitlerinin Görüntülenmesi

Özet

Ön araştırma, subaraknoid kanamanın (SAK) beyin perisit ölümüne neden olduğunu doğrulamaktadır. SAK sonrası perisit kontraktilitesinin değerlendirilmesi, canlı ve canlı olmayan beyin perisitleri arasında ayrım yapılmasını gerektirir. Bu nedenle, canlı ve canlı olmayan beyin perisitlerini beyin bölümlerinde aynı anda etiketlemek için bir prosedür geliştirilmiştir ve yüksek çözünürlüklü bir konfokal mikroskop kullanarak gözlemi kolaylaştırmıştır.

Özet

Perisitler, serebral mikrosirkülasyon içinde yer alan ve kasılma ayarlamaları yoluyla serebral kan akışını aktif olarak modüle etmede çok önemli olan çok önemli duvar hücreleridir. Geleneksel olarak, kasılmaları, belirli koşullar altında morfolojik kaymalar ve yakındaki kılcal çap değişiklikleri gözlemlenerek ölçülür. Bununla birlikte, doku fiksasyonu sonrası, canlılığın değerlendirilmesi ve görüntülenen beyin perisitlerinin perisit kontraktilitesi tehlikeye girer. Benzer şekilde, genetik olarak etiketlenen beyin perisitleri, özellikle ön araştırmamızın beyin perisit ölümünü doğruladığı subaraknoid kanama (SAK) gibi nörolojik durumlarda, canlı ve canlı olmayan perisitler arasında ayrım yapmada yetersiz kalmaktadır. Bu kısıtlamaların üstesinden gelmek için güvenilir bir protokol geliştirilmiştir ve beyin bölümlerinde hem fonksiyonel hem de fonksiyonel olmayan beyin perisitlerinin aynı anda floresan etiketlenmesini sağlar. Bu etiketleme yöntemi, aynı anda beyin dilimi mikrovaskülatürünü işaretleyen yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskop görselleştirmesine izin verir. Bu yenilikçi protokol, beyin perisit kontraktilitesini, kılcal damar çapı üzerindeki etkisini ve perisit yapısını değerlendirmek için bir araç sunar. Beyin perisit kontraktilitesinin SAK bağlamında araştırılması, serebral mikrosirkülasyon üzerindeki etkilerinin anlayışlı bir şekilde anlaşılmasını sağlar.

Giriş

İnce çıkıntıları ve çıkıntılı hücre gövdeleri ile ayırt edilen beyin perisitleri, mikrosirkülasyonu^{çevreler 1,2}. Serebral kan akışı artışı ağırlıklı olarak kılcal damar genişlemesi tarafından yönlendirilirken, daha küçük arterler daha yavaş genişleme oranları sergiler³. Perisit kontraktilitesi, kapiller çap ve perisit morfolojisi üzerinde etki göstererek vasküler dinamikleri^{etkiler 4}. Beyin perisitlerinin kasılması kılcal daralmaya yol açar ve patolojik senaryolarda aşırı kasılma eritrosit akışını engelleyebilir⁵. Locus coeruleus'tan salın....

Protokol

Deney protokolü, Kunming Tıp Üniversitesi Hayvan Etiği ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı (kmmu20220945). Bu çalışma için her iki cinsiyetten 300-350 g Sprague-Dawley (SD) cinsi sıçanlar kullanıldı.

1. SAH modelini indükleme

1. Sıçanları% 2 izofluran ve% 100 oksijen kullanarak uyuşturun. İzofluran (%1-%3) ile sürekli inhalasyon anestezisi sağlayarak anesteziyi koruyun. Stereotaksik bir aparat kullanarak farenin kafasını sabitleyin (bkz.
2. Aşağıdaki adımları izleyerek SAH modelini oluşturun.
   1. Suprasellar rezervuarın içine bir mikroenjeksiyon iğnesi yerleştirin. Daha sonra, sıçanı....

Tartışmalar

Hayati beyin perisitlerini, hayati olmayan beyin perisitlerini ve beyin dilimlerindeki mikrovaskülatürü görselleştirmek için yüksek çözünürlüklü konfokal görüntüleme teknikleri geliştirilmiştir. Akut sıçan beyin dilimlerinde, işlem perisitlerin TO-PRO-3¹¹ ile ilk etiketlenmesini ve ardından IB4¹² ile mikrovasküler endotel hücrelerini gerektirir; daha sonra, ölen perisitlerin tanımlanması PI kullanılarak gerçekleştirilir. Bu protokol basit, tekr.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well plate	ABC biochemistry	ABC703006	RT
Adobe Photoshop	Adobe	Adobe Illustrator CS6 16.0.0	RT
Aluminium foil	MIAOJIE	225 mm x 273 mm	RT
CaCl2·2H2O	Sigma-Aldrich	C3881	RT
Confocal imaging software	Nikon	NIS-Elements 4.10.00	RT
Confocal Laser Scanning Microscope	Nikon	N-SIM/C2si	RT
Gas tank (5% CO2, 95% O2)	PENGYIDA	40L	RT
Glass Bottom Confocal Dishes	Beyotime	FCFC020-10pcs	RT
Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	RT
Glue	EVOBOND	KH-502	RT
Ice machine	XUEKE	IMS-20	RT
Image analysis software	National Institutes of Health	Image J	RT
Inhalation anesthesia system	SCIENCE	QAF700	RT
Isolectin B 4-FITC	SIGMA	L2895–2MG	Store aliquots at –20 °C
KCl	Sigma-Aldrich	7447–40–7	RT
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P0662	RT
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506	RT
NaCl	Sigma-Aldrich	7647–14–5	RT
NaH2PO4·H2O	Sigma-Aldrich	10049–21–5	RT
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761	RT
Pasteur pipette	NEST Biotechnology	318314	RT
Peristaltic Pump	Scientific Industries Inc	Model 203	RT
Propidium (Iodide)	Med Chem Express	HY-D0815/CS-7538	Store aliquots at –20 °C
Stereotaxic apparatus	SCIENCE	QA	RT
Syringe pump	Harvard PUMP	PUMP 11 ELITE Nanomite	RT
Thermostatic water bath	OLABO	HH-2	RT
Vibrating microtome	Leica	VT1200	RT