Subaraknoid Kanama Sonrası Beyin Dilimlerinde Vital ve Non-vital Beyin Perisitlerinin Görüntülenmesi

Özet

Ön araştırma, subaraknoid kanamanın (SAK) beyin perisit ölümüne neden olduğunu doğrulamaktadır. SAK sonrası perisit kontraktilitesinin değerlendirilmesi, canlı ve canlı olmayan beyin perisitleri arasında ayrım yapılmasını gerektirir. Bu nedenle, canlı ve canlı olmayan beyin perisitlerini beyin bölümlerinde aynı anda etiketlemek için bir prosedür geliştirilmiştir ve yüksek çözünürlüklü bir konfokal mikroskop kullanarak gözlemi kolaylaştırmıştır.

Özet

Perisitler, serebral mikrosirkülasyon içinde yer alan ve kasılma ayarlamaları yoluyla serebral kan akışını aktif olarak modüle etmede çok önemli olan çok önemli duvar hücreleridir. Geleneksel olarak, kasılmaları, belirli koşullar altında morfolojik kaymalar ve yakındaki kılcal çap değişiklikleri gözlemlenerek ölçülür. Bununla birlikte, doku fiksasyonu sonrası, canlılığın değerlendirilmesi ve görüntülenen beyin perisitlerinin perisit kontraktilitesi tehlikeye girer. Benzer şekilde, genetik olarak etiketlenen beyin perisitleri, özellikle ön araştırmamızın beyin perisit ölümünü doğruladığı subaraknoid kanama (SAK) gibi nörolojik durumlarda, canlı ve canlı olmayan perisitler arasında ayrım yapmada yetersiz kalmaktadır. Bu kısıtlamaların üstesinden gelmek için güvenilir bir protokol geliştirilmiştir ve beyin bölümlerinde hem fonksiyonel hem de fonksiyonel olmayan beyin perisitlerinin aynı anda floresan etiketlenmesini sağlar. Bu etiketleme yöntemi, aynı anda beyin dilimi mikrovaskülatürünü işaretleyen yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskop görselleştirmesine izin verir. Bu yenilikçi protokol, beyin perisit kontraktilitesini, kılcal damar çapı üzerindeki etkisini ve perisit yapısını değerlendirmek için bir araç sunar. Beyin perisit kontraktilitesinin SAK bağlamında araştırılması, serebral mikrosirkülasyon üzerindeki etkilerinin anlayışlı bir şekilde anlaşılmasını sağlar.

Giriş

İnce çıkıntıları ve çıkıntılı hücre gövdeleri ile ayırt edilen beyin perisitleri, mikrosirkülasyonu^{çevreler 1,2}. Serebral kan akışı artışı ağırlıklı olarak kılcal damar genişlemesi tarafından yönlendirilirken, daha küçük arterler daha yavaş genişleme oranları sergiler³. Perisit kontraktilitesi, kapiller çap ve perisit morfolojisi üzerinde etki göstererek vasküler dinamikleri^{etkiler 4}. Beyin perisitlerinin kasılması kılcal daralmaya yol açar ve patolojik senaryolarda aşırı kasılma eritrosit akışını engelleyebilir⁵. Locus coeruleus'tan salınan norepinefrin de dahil olmak üzere çeşitli faktörler, kılcal damarlarda beyin perisit kasılmasına neden olabilir⁶. Serebral kan akışında düzenleyici bir role sahip olan perisitler, hiperoksi⁷ sırasında bir oksijen sensörü görevi gören 20-HETE sentezi sergiler. Beyin perisitlerinin oksidatif-nitratif stresle tetiklenen kasılması kılcal damarları zararlı bir şekilde etkiler⁵. Beyin perisit kasılması ile ilgili hem in vivo hem de ex vivo araştırmalara rağmen⁸, beyin dilimleri içinde canlı ve canlı olmayan beyin perisitlerinin görüntülenmesi ile ilgili sınırlı bilgi devam etmektedir.

En önemlisi, beyin perisitlerinin doku fiksasyonu sonrası görüntülemesi, canlılıklarını ve müteakip kasılma değerlendirmesini tehlikeye atar. Ayrıca, nörolojik bozukluklar gibi senaryolarda (ör., subaraknoid kanama - SAK), beyin perisitlerinin transgenik etiketlemesi, ön SAK kaynaklı beyin perisit ölümü çalışmamız⁹ tarafından onaylandığı gibi, canlı ve canlı olmayan perisitler arasında ayrım yapamaz.

Bu zorlukların üstesinden gelmek için, canlı perisitleri etiketlemek için TO-PRO-3'ü kullandık, ölenler ise propidyum iyodür (PI) ile boyandı. Görüntüleme sırasında kesit aktivitesini korurken, beyin dilimlerinde canlı ve canlı olmayan beyin perisitlerini görselleştirmek için yüksek çözünürlüklü konfokal görüntüleme teknolojileri kullandık. Bu makale, beyin perisitlerinin SAK sonrası serebral mikrosirkülasyon üzerindeki etkisini araştırmak için değerli bir araç olarak hizmet ederek, beyin dilimlerinde canlı ve canlı olmayan beyin perisitlerini görüntülemek için tekrarlanabilir bir yöntem sunmayı amaçlamaktadır.

Protokol

Deney protokolü, Kunming Tıp Üniversitesi Hayvan Etiği ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı (kmmu20220945). Bu çalışma için her iki cinsiyetten 300-350 g Sprague-Dawley (SD) cinsi sıçanlar kullanıldı.

1. SAH modelini indükleme

1. Sıçanları% 2 izofluran ve% 100 oksijen kullanarak uyuşturun. İzofluran (%1-%3) ile sürekli inhalasyon anestezisi sağlayarak anesteziyi koruyun. Stereotaksik bir aparat kullanarak farenin kafasını sabitleyin (bkz.
2. Aşağıdaki adımları izleyerek SAH modelini oluşturun.
   1. Suprasellar rezervuarın içine bir mikroenjeksiyon iğnesi yerleştirin. Daha sonra, sıçanın kuyruk arterinden (antikoagülan olmadan) bir şırınga pompası kullanarak suprasellar sarnıca otolog kan enjekte edin (bkz.
   2. Belirtilen koordinatları kullanarak sağ lateral serebral ventriküle bir mikroenjeksiyon iğnesi implante edin: bregma, −0.8 mm; yanal, 1,4 mm; derinlik, 4 mm⁹. SAK grupları için 0.2 mL sıçan kuyruğu arter kanı enjekte edin. Sahte gruplar için aynı hacimde izotonik salin uygulayın (Şekil 1A).

2. Beyin dilimi hazırlama ve stabilizasyon

1. % 2 izofluran inhalasyonu kullanarak sıçanları derinlemesine uyuşturun. Dekapitasyondan sonra, tüm beyinleri çıkarın ve buz gibi yapay beyin omurilik sıvısına (ACSF) daldırın.
   NOT: Aşağıdaki bileşime sahip taze hazırlanmış ACSF çözeltileri kullanın: 134 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 29 mM NaHCO₃, 1.1 mM NaH 2 PO 4, 1.5 mM MgSO₄, 2.5 mM CaCl₂ ve 10.11 mM D-Glikoz (Malzeme Tablosuna bakınız). pH'ı 7.3 ile 7.4 arasında tutun.
2. %5_CO2 ve %95_O2 ile havalandırılan buz gibi ACSF'de SD sıçanlardan 200 μm kalınlığında akut beyin dilimleri hazırlamak için bir vibratom kullanın (Malzeme Tablosuna bakınız) (Şekil 2).
3. 200 μm kalınlığındaki akut beyin dilimlerini ACSF'ye batırılmış naylon bir ağ üzerindeki bir saklama odasına yerleştirin. ACSF çözeltisini 35-37 °C sıcaklık aralığını koruyarak %95 O2 ve %5_CO2 ile dengeleyin. Beyin dilimlerinin 2 saat boyunca stabilize olmasına izin verin ve uyum sağlamaları için zaman tanıyın (Şekil 3).

3. Akut beyin dilimlerindeki perisitlerin TO-PRO-3 ile etiketlenmesi

NOT: Akut beyin dilimlerinden elde edilen perisitler, izleyici TO-PRO-3¹⁰ kullanılarak floresan olarak etiketlendi.

1. Floresan boya TO-PRO-3'ü ACSF'ye ekleyin ve 1 μM'lik bir nihai konsantrasyon elde edin. Akut beyin dilimlerini oda sıcaklığında TO-PRO-3 içeren ACSF ile karanlık bir ortamda 20 dakika inkübe edin.
   NOT: Koruma için TO-PRO-3'ü tutarken lateks eldiven giymeyi unutmayın.
2. Beyin dilimlerini taşıyan naylon süzgeci yükleme odasından 6 oyuklu bir plaka durulama odasına aktarın (bkz. Malzeme Tablosu). Beyin dilimlerinin durulama odasında 10 dakika kalmasına izin verin (Şekil 4D).
   NOT: Bu durulama adımı, boyama işlemini sonlandırır, arka plan etiketlemesini azaltır ve spesifik olmayan lekelenmeyi önler.
3. Preparatları% 5 CO 2 ve% 95 O₂ karışımı ile dengelenmiş ACSF solüsyonu kullanarak toplam 15 dakika durulayın. Bu durulama adımı, boya alımını durdurur ve arka plan etiketlemesini en aza indirir (Şekil 4C).

4. Akut beyin dilimlerinde serebral mikrosirkülasyonun hayati olmayan perisitlerinin boyanması

1. TO-PRO-3 ile önceden yüklenmiş beyin dilimlerini 37 ° C'de Alexa Fluor 488'e (FITC-ISOB4; 5 μg / mL, Malzeme Tablosuna bakınız) konjuge edilmiş izolektin B4 ile karanlık bir ortamda 30 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, beyin dilimlerini ACSF'de 15 dakika durulayın (Şekil 4E).
2. Beyin dilimlerini her zamanki gibi %5 CO₂ ve% 95 O₂ ile gazlanmış ACSF'de inkübe edin. 37 °C'de her iki çözeltiye de 37 μM konsantrasyonda propidyum iyodür (PI) ekleyin. Bu, hayati olmayan beyin perisitlerini etiketleyecektir. Preparatları bu ACSF çözeltisinde karanlıkta 60 dakika inkübe edin (Şekil 4F).
3. Ardından, boya alımını durdurmak ve arka plan etiketlemesini en aza indirmek için preparatları ACSF solüsyonlarıyla 15 dakika durulayın.

5. Akut beyin dilimlerinde vital ve vital olmayan beyin perisitlerinin görüntülenmesi

1. Plastik Pasteur pipetleri kullanarak beyin dilimlerini cam tabanlı konfokal kaplara (Malzeme Tablosuna bakın) nazikçe aktarın. Bulaşıkları daha önce% 5 CO₂ ve% 95 O₂ ile dengelenmiş ACSF çözeltisi ile doldurun. Sıçan beyin dilimlerini yerine sabitlemek için demir bir ağ kullanın.
2. Cam tabanlı konfokal tabakları konfokal mikroskop aşamasına aktarın. Akut beyin dilimini çanağın dibine yerleştirin ve konfokal mikroskopi görüntüleme sırasında %95 O2 ve %5_CO2 karışımı ile dengelenmiş ACSF solüsyonu ile^perfüze edin 9 (Şekil 5A ve Şekil 5Ab').
3. Serebral kortikal mikrovaskülatürün duvar hücrelerini 40x objektif kullanarak görselleştirin. Uyumlu yazılımı kullanarak görüntü yığınlarını yakalayın (bkz. IB4 (uyarma/emisyon 460 nm/520 nm), PI (uyarma/emisyon 545 nm/595 nm) ve TO-PRO-3 (uyarma/emisyon 606 nm/666 nm) için uygun filtreler kullanın (Şekil 5D).
   NOT: Aşağıdaki ayrıntılara sahip görüntüler yakalayın: 40× DIC N1 objektif lens, 3 × 12 bit: 512 × 512 piksel (0,22 × 0,22 mm), kalibrasyon: 0,42 μm/piksel.
4. Serebral mikrovasküler sistemi ve perisitleri ağlarına ve morfolojilerine göre tanımlayın. Her beyin diliminde serebral mikrovasküler ağ içeren belirli bir bölgeyi bulun ve görüntü yakalayın.
5. Sonraki çekimlerde tutarlılığı sağlamak için görüntüleme konumunu dikkatlice not edin (Şekil 5B,C). Daha fazla işleme ve analiz için görüntü analiz yazılımı (ImageJ) ve fotoğraf düzenleme yazılımı kullanın (bkz.

Sonuçlar

Normal fizyolojik koşullar altında, beyin perisitleri genellikle hücre ölümüne uğramazlar. Şekil 6 , hayati beyin perisitlerinin varlığını gösteren sarı ile bu fenomeni göstermektedir; beyin perisitleri, PI ile boyanma göstermez, bu da canlılıklarını gösterir. Hücre ölümünü takiben perisitlerin mikrovaskülatüre bağlı kalıp kalmadığını daha fazla araştırmak için, bir SAK sıçan modelinde yöntemler kullanıldı ve daha sonra görüntüleme yapıldı.

...

Tartışmalar

Hayati beyin perisitlerini, hayati olmayan beyin perisitlerini ve beyin dilimlerindeki mikrovaskülatürü görselleştirmek için yüksek çözünürlüklü konfokal görüntüleme teknikleri geliştirilmiştir. Akut sıçan beyin dilimlerinde, işlem perisitlerin TO-PRO-3¹¹ ile ilk etiketlenmesini ve ardından IB4¹² ile mikrovasküler endotel hücrelerini gerektirir; daha sonra, ölen perisitlerin tanımlanması PI kullanılarak gerçekleştirilir. Bu protokol basit, tekr...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well plate	ABC biochemistry	ABC703006	RT
Adobe Photoshop	Adobe	Adobe Illustrator CS6 16.0.0	RT
Aluminium foil	MIAOJIE	225 mm x 273 mm	RT
CaCl2·2H2O	Sigma-Aldrich	C3881	RT
Confocal imaging software	Nikon	NIS-Elements 4.10.00	RT
Confocal Laser Scanning Microscope	Nikon	N-SIM/C2si	RT
Gas tank (5% CO2, 95% O2)	PENGYIDA	40L	RT
Glass Bottom Confocal Dishes	Beyotime	FCFC020-10pcs	RT
Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	RT
Glue	EVOBOND	KH-502	RT
Ice machine	XUEKE	IMS-20	RT
Image analysis software	National Institutes of Health	Image J	RT
Inhalation anesthesia system	SCIENCE	QAF700	RT
Isolectin B 4-FITC	SIGMA	L2895–2MG	Store aliquots at –20 °C
KCl	Sigma-Aldrich	7447–40–7	RT
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P0662	RT
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506	RT
NaCl	Sigma-Aldrich	7647–14–5	RT
NaH2PO4·H2O	Sigma-Aldrich	10049–21–5	RT
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761	RT
Pasteur pipette	NEST Biotechnology	318314	RT
Peristaltic Pump	Scientific Industries Inc	Model 203	RT
Propidium (Iodide)	Med Chem Express	HY-D0815/CS-7538	Store aliquots at –20 °C
Stereotaxic apparatus	SCIENCE	QA	RT
Syringe pump	Harvard PUMP	PUMP 11 ELITE Nanomite	RT
Thermostatic water bath	OLABO	HH-2	RT
Vibrating microtome	Leica	VT1200	RT