Imaging di periciti cerebrali vitali e non vitali in fette di cervello dopo emorragia subaracnoidea

Riepilogo

L'indagine preliminare conferma che l'emorragia subaracnoidea (SAH) provoca la morte dei periciti cerebrali. La valutazione della contrattilità dei periciti post-SAH richiede la differenziazione tra periciti cerebrali vitali e non vitali. Pertanto, è stata sviluppata una procedura per etichettare i periciti cerebrali vitali e non vitali contemporaneamente nelle sezioni cerebrali, facilitando l'osservazione utilizzando un microscopio confocale ad alta risoluzione.

Abstract

I periciti sono cellule murali cruciali situate all'interno della microcircolazione cerebrale, fondamentali per modulare attivamente il flusso sanguigno cerebrale attraverso aggiustamenti della contrattilità. Convenzionalmente, la loro contrattilità viene misurata osservando i cambiamenti morfologici e i cambiamenti del diametro capillare nelle vicinanze in circostanze specifiche. Tuttavia, la fissazione post-tissutale, la valutazione della vitalità e la conseguente contrattilità dei periciti cerebrali vengono compromessi. Allo stesso modo, l'etichettatura genetica dei periciti cerebrali non è in grado di distinguere tra periciti vitali e non vitali, in particolare in condizioni neurologiche come l'emorragia subaracnoidea (SAH), dove la nostra indagine preliminare convalida la morte dei periciti cerebrali. È stato messo a punto un protocollo affidabile per superare questi vincoli, consentendo l'etichettatura fluorescente simultanea di periciti cerebrali funzionali e non funzionali nelle sezioni cerebrali. Questo metodo di marcatura consente la visualizzazione al microscopio confocale ad alta risoluzione, marcando contemporaneamente la microvascolarizzazione della fetta di cervello. Questo protocollo innovativo offre un mezzo per valutare la contrattilità dei periciti cerebrali, il suo impatto sul diametro capillare e sulla struttura dei periciti. Lo studio della contrattilità dei periciti cerebrali all'interno del contesto SAH fornisce una comprensione approfondita dei suoi effetti sulla microcircolazione cerebrale.

Introduzione

I periciti cerebrali, che si distinguono per le loro sottili protuberanze e corpi cellulari sporgenti, circondano il microcircolo ^1,2. Mentre l'aumento del flusso sanguigno cerebrale è prevalentemente guidato dalla dilatazione capillare, le arterie più piccole mostrano tassi di dilatazione più lenti³. La contrattilità dei periciti esercita un'influenza sul diametro dei capillari e sulla morfologia dei periciti, influenzando la dinamica vascolare⁴. La contrazione dei periciti cerebrali porta alla costrizione capillare e, in scenari patologici, una contrazione eccessiva può ostacolare il flusso eritrocitario⁵. Vari fattori, tra cui la noradrenalina rilasciata dal locus coeruleus, possono indurre la contrazione dei periciti cerebrali all'interno dei capillari⁶. Con un ruolo regolatore nel flusso sanguigno cerebrale, i periciti mostrano la sintesi di 20-HETE, fungendo da sensore di ossigeno durante l'iperossia⁷. La contrazione dei periciti cerebrali innescata dallo stress ossidativo-nitrativo influisce negativamente sui capillari⁵. Nonostante le indagini sia in vivo che ex vivo sulla contrazione dei periciti cerebrali⁸, persistono conoscenze limitate per quanto riguarda l'imaging dei periciti cerebrali vitali e non vitali all'interno di fette di cervello.

Fondamentalmente, l'imaging post-fissazione tissutale dei periciti cerebrali compromette la loro vitalità e la successiva valutazione della contrattilità. Inoltre, in scenari come i disturbi neurologici (ad esempio, l'emorragia subaracnoidea - SAH), la marcatura transgenica dei periciti cerebrali non riesce a distinguere tra periciti vitali e non vitali, come confermato dal nostro studio preliminare sulla morte dei periciti cerebrali indotta da SAH⁹.

Per superare queste sfide, abbiamo impiegato TO-PRO-3 per marcare i periciti vivi, mentre quelli deceduti sono stati colorati con ioduro di propidio (PI). Abbiamo utilizzato tecnologie di imaging confocale ad alta risoluzione per visualizzare i periciti cerebrali vitali e non vitali nelle fette di cervello, preservando l'attività della fetta durante l'imaging. Questo articolo ha lo scopo di presentare un metodo riproducibile per l'imaging di periciti cerebrali vitali e non vitali in fette di cervello, fungendo da prezioso strumento per sondare l'impatto dei periciti cerebrali sulla microcircolazione cerebrale dopo SAH.

Protocollo

Il protocollo sperimentale è stato approvato dall'Animal Ethics and Use Committee della Kunming Medical University (kmmu20220945). Per il presente studio sono stati utilizzati ratti Sprague-Dawley (SD) di entrambi i sessi, 300-350 g.

1. Induzione del modello SAH

1. Anestetizzare i ratti usando il 2% di isoflurano e il 100% di ossigeno. Mantenere l'anestesia somministrando un'anestesia inalatoria continua con isoflurano (1%-3%). Fissare la testa del ratto con un apparecchio stereotassico (vedi Tabella dei materiali).
2. Creare il modello SAH attenendosi alla procedura riportata di seguito.
   1. Inserire un ago per microiniezione nella cisterna soprasellare. Quindi, iniettare sangue autologo dall'arteria caudale del ratto (senza anticoagulante) nella cisterna soprasellare utilizzando una pompa a siringa (vedere Tabella dei materiali).
   2. Impiantare un ago per microiniezione nel ventricolo cerebrale laterale destro utilizzando le coordinate menzionate: bregma, −0,8 mm; laterale, 1,4 mm; profondità, 4 mm⁹. Per i gruppi SAH, iniettare 0,2 mL di sangue dell'arteria caudale di ratto. Per i gruppi fittizi, somministrare lo stesso volume di soluzione fisiologica isotonica (Figura 1A).

2. Preparazione e stabilizzazione della fetta di cervello

1. Anestetizzare in profondità i ratti usando l'inalazione di isoflurano al 2%. Dopo la decapitazione, estrarre l'intero cervello e immergerlo in liquido cerebrospinale artificiale ghiacciato (ACSF).
   NOTA: Utilizzare soluzioni ACSF appena preparate con la seguente composizione: 134 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 29 mM NaHCO₃, 1,1 mM NaH 2 PO₄, 1,5 mM MgSO₄, 2,5 mM CaCl₂e 10,11 mM D-Glucosio (vedere la tabella dei materiali). Mantenere un pH compreso tra 7,3 e 7,4.
2. Utilizzare un vibratomo (vedere la tabella dei materiali) per preparare fette di cervello acuto con uno spessore di 200 μm dai ratti SD in ACSF ghiacciato aerato con il 5% di CO 2 e il 95% di O 2 (Figura 2).
3. Posizionare le fette di cervello acuto spesse 200 μm in una camera di conservazione su una rete di nylon immersa in ACSF. Equilibrare la soluzione ACSF con il 95% di O 2 e il 5% di CO₂ mantenendo un intervallo di temperatura di 35-37 °C. Lasciare che le fette di cervello si stabilizzino per 2 ore, dando loro il tempo di adattarsi (Figura 3).

3. Marcatura dei periciti in fette di cervello acuto con TO-PRO-3

NOTA: I periciti provenienti da fette di cervello acuto sono stati marcati in fluorescenza utilizzando il tracciante TO-PRO-3¹⁰.

1. Aggiungere il colorante fluorescente TO-PRO-3 all'ACSF, ottenendo una concentrazione finale di 1 μM. Incubare le fette di cervello acuto a temperatura ambiente in un ambiente buio con l'ACSF contenente TO-PRO-3 per 20 minuti.
   NOTA: Ricordarsi di indossare guanti in lattice durante la manipolazione di TO-PRO-3 per protezione.
2. Trasferire il filtro a rete di nylon, che trasporta le fette di cervello, dalla camera di carico a una camera di risciacquo a piastre a 6 pozzetti (vedi Tabella dei materiali). Lasciare che le fette di cervello rimangano nella camera di risciacquo per 10 minuti (Figura 4D).
   NOTA: Questa fase di risciacquo termina il processo di colorazione, riduce l'etichettatura di fondo e previene le macchie non specifiche.
3. Risciacquare i preparati per un totale di 15 minuti utilizzando una soluzione di ACSF bilanciata con una miscela di 5% CO 2 e 95% O_{2 .} Questa fase di risciacquo arresta l'assorbimento del colorante e riduce al minimo l'etichettatura di fondo (Figura 4C).

4. Colorazione dei periciti non vitali della microcircolazione cerebrale in fette di cervello acuto

1. Incubare fette di cervello precaricate con TO-PRO-3 a 37 °C con isolectina B4 coniugata ad Alexa Fluor 488 (FITC-ISOB4; 5 μg/mL, vedere la tabella dei materiali) per 30 minuti in un ambiente buio. Dopo l'incubazione, sciacquare le fette di cervello per 15 minuti in ACSF (Figura 4E).
2. Incubare le fette di cervello in ACSF gassate con il 5% di CO 2 e il 95% di O₂ come di consueto. Aggiungere ioduro di propidio (PI) a una concentrazione di 37 μM a entrambe le soluzioni a 37 °C. Questo etichetterà i periciti cerebrali non vitali. Incubare i preparati in questa soluzione di ACSF per 60 minuti al buio (Figura 4F).
3. Successivamente, risciacquare i preparati per 15 minuti con soluzioni ACSF per arrestare l'assorbimento del colorante e ridurre al minimo l'etichettatura di fondo.

5. Imaging di periciti cerebrali vitali e non vitali in fette cerebrali acute

1. Trasferire delicatamente le fette di cervello in piastre confocali con fondo di vetro (vedere Tabella dei materiali) utilizzando pipette Pasteur in plastica. Riempire le piastre con una soluzione di ACSF precedentemente bilanciata con il 5% di CO 2 e il 95% di O_{2 .} Usa una rete di ferro per fissare le fette di cervello di ratto in posizione.
2. Trasferire le piastre confocali con fondo di vetro sul tavolino di un microscopio confocale. Posizionare la fetta di cervello acuto sul fondo del piatto e perfonderla⁹ con una soluzione di ACSF bilanciata con una miscela di 95% O 2 e 5% CO₂ durante l'imaging al microscopio confocale (Figura 5A e Figura 5Ab').
3. Visualizza le cellule di parete della microvascolarizzazione corticale cerebrale utilizzando un obiettivo 40x. Acquisisci pile di immagini utilizzando un software compatibile (vedi Tabella dei materiali). Utilizzare filtri appropriati per IB4 (eccitazione/emissione 460 nm/520 nm), PI (eccitazione/emissione 545 nm/595 nm) e TO-PRO-3 (eccitazione/emissione 606 nm/666 nm) (Figura 5D).
   NOTA: Acquisire immagini con i seguenti dettagli: obiettivo DIC N1 da 40×, 3 × 12 bit: 512 × 512 pixel (0,22 × 0,22 mm), calibrazione: 0,42 μm/px.
4. Identificare la microvascolarizzazione cerebrale e i periciti in base alla loro rete e morfologia. Individua una regione specifica contenente una rete di microvascolarizzazione cerebrale su ogni fetta di cervello e acquisisci immagini.
5. Annotare attentamente la posizione dell'imaging per garantire l'uniformità nelle acquisizioni successive (Figura 5B,C). Per ulteriori elaborazioni e analisi, utilizzare un software di analisi delle immagini (ImageJ) e un software di fotoritocco (vedere la tabella dei materiali).

Risultati

In condizioni fisiologiche normali, i periciti cerebrali generalmente non subiscono la morte cellulare. La figura 6 illustra questo fenomeno, con il giallo che indica la presenza di periciti cerebrali vitali; I periciti cerebrali non mostrano alcuna colorazione con PI, indicando la loro vitalità. Per indagare ulteriormente se i periciti rimangono attaccati alla microvascolarizzazione dopo la morte cellulare, sono stati impiegati metodi in un modello di ratto SAH e sono state condotte succes...

Discussione

Sono state sviluppate tecniche di imaging confocale ad alta risoluzione per la visualizzazione dei periciti cerebrali vitali, dei periciti cerebrali non vitali e della microvascolarizzazione in fette di cervello. Nelle fette acute di cervello di ratto, il processo comporta la marcatura iniziale dei periciti con TO-PRO-3¹¹, seguita da cellule endoteliali microvascolari con IB4¹²; successivamente, l'identificazione dei periciti deceduti viene condotta utilizzando PI. Questo p...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well plate	ABC biochemistry	ABC703006	RT
Adobe Photoshop	Adobe	Adobe Illustrator CS6 16.0.0	RT
Aluminium foil	MIAOJIE	225 mm x 273 mm	RT
CaCl2·2H2O	Sigma-Aldrich	C3881	RT
Confocal imaging software	Nikon	NIS-Elements 4.10.00	RT
Confocal Laser Scanning Microscope	Nikon	N-SIM/C2si	RT
Gas tank (5% CO2, 95% O2)	PENGYIDA	40L	RT
Glass Bottom Confocal Dishes	Beyotime	FCFC020-10pcs	RT
Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	RT
Glue	EVOBOND	KH-502	RT
Ice machine	XUEKE	IMS-20	RT
Image analysis software	National Institutes of Health	Image J	RT
Inhalation anesthesia system	SCIENCE	QAF700	RT
Isolectin B 4-FITC	SIGMA	L2895–2MG	Store aliquots at –20 °C
KCl	Sigma-Aldrich	7447–40–7	RT
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P0662	RT
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506	RT
NaCl	Sigma-Aldrich	7647–14–5	RT
NaH2PO4·H2O	Sigma-Aldrich	10049–21–5	RT
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761	RT
Pasteur pipette	NEST Biotechnology	318314	RT
Peristaltic Pump	Scientific Industries Inc	Model 203	RT
Propidium (Iodide)	Med Chem Express	HY-D0815/CS-7538	Store aliquots at –20 °C
Stereotaxic apparatus	SCIENCE	QA	RT
Syringe pump	Harvard PUMP	PUMP 11 ELITE Nanomite	RT
Thermostatic water bath	OLABO	HH-2	RT
Vibrating microtome	Leica	VT1200	RT