Imagerie des péricytes cérébraux vitaux et non vitaux dans des coupes de cerveau après une hémorragie sous-arachnoïdienne

Résumé

L’enquête préliminaire confirme que l’hémorragie sous-arachnoïdienne (HSA) provoque la mort du péricyte cérébral. L’évaluation de la contractilité des péricytes après l’HSA nécessite de différencier les péricytes cérébraux viables et non viables. Par conséquent, une procédure a été mise au point pour marquer simultanément les péricytes cérébraux viables et non viables dans des coupes cérébrales, facilitant ainsi l’observation à l’aide d’un microscope confocal à haute résolution.

Résumé

Les péricytes sont des cellules murales cruciales situées dans la microcirculation cérébrale, essentielles à la modulation active du flux sanguin cérébral via des ajustements de la contractilité. Classiquement, leur contractilité est mesurée en observant les changements morphologiques et les changements de diamètre capillaire à proximité dans des circonstances spécifiques. Pourtant, la fixation post-tissulaire, l’évaluation de la vitalité et la contractilité péricytaire qui en résulte des péricytes cérébraux imagés sont compromises. De même, le marquage génétique des péricytes cérébraux ne permet pas de distinguer les péricytes viables des péricytes non viables, en particulier dans les affections neurologiques telles que l’hémorragie sous-arachnoïdienne (HSA), où notre enquête préliminaire valide la mort des péricytes cérébraux. Un protocole fiable a été mis au point pour surmonter ces contraintes, permettant le marquage simultané par fluorescence des péricytes cérébraux fonctionnels et non fonctionnels dans les coupes cérébrales. Cette méthode de marquage permet une visualisation au microscope confocal à haute résolution, marquant simultanément la microvascularisation de la tranche de cerveau. Ce protocole innovant permet d’évaluer la contractilité des péricytes cérébraux, son impact sur le diamètre capillaire et la structure des péricytes. L’étude de la contractilité des péricytes cérébraux dans le contexte de l’HSA permet de mieux comprendre ses effets sur la microcirculation cérébrale.

Introduction

Les péricytes cérébraux, qui se distinguent par leurs protubérances minces et leurs corps cellulaires saillants, entourent la microcirculation ^1,2. Alors que l’augmentation du flux sanguin cérébral est principalement entraînée par la dilatation capillaire, les artères plus petites présentent des taux de dilatation plus lents³. La contractilité des péricytes exerce une influence sur le diamètre capillaire et la morphologie des péricytes, ce qui a un impact sur la dynamique vasculaire⁴. La contraction des péricytes cérébraux entraîne une constriction capillaire et, dans les scénarios pathologiques, une contraction excessive peut entraver l’écoulement des érythrocytes⁵. Divers facteurs, y compris la noradrénaline libérée par le locus coeruleus, peuvent induire une contraction du péricyte cérébral dans les capillaires⁶. Jouant un rôle régulateur dans le flux sanguin cérébral, les péricytes présentent une synthèse de 20-HETE, servant de capteur d’oxygène pendant l’hyperoxie⁷. La contraction des péricytes cérébraux déclenchée par le stress oxydatif-nitritif affecte négativement les capillaires⁵. Malgré des études in vivo et ex vivo sur la contraction des péricytes cérébraux⁸, les connaissances persistent concernant l’imagerie des péricytes cérébraux viables et non viables dans les coupes de cerveau.

De manière cruciale, l’imagerie post-fixation tissulaire des péricytes cérébraux compromet leur vitalité et l’évaluation ultérieure de la contractilité. De plus, dans des scénarios tels que les troubles neurologiques (par exemple, l’hémorragie sous-arachnoïdienne - SAH), le marquage transgénique des péricytes cérébraux ne parvient pas à différencier les péricytes viables et non viables, comme le confirme notre étude préliminaire sur la mort des péricytes cérébraux induite par la SAH⁹.

Pour surmonter ces défis, nous avons utilisé TO-PRO-3 pour marquer les péricytes vivants, tandis que les péricytes décédés ont été colorés avec de l’iodure de propidium (IP). Nous avons utilisé des technologies d’imagerie confocale à haute résolution pour visualiser les péricytes cérébraux viables et non viables dans des coupes de cerveau tout en préservant l’activité des tranches pendant l’imagerie. Cet article vise à présenter une méthode reproductible d’imagerie des péricytes cérébraux viables et non viables dans des coupes de cerveau, servant d’outil précieux pour sonder l’impact des péricytes cérébraux sur la microcirculation cérébrale après l’HSA.

Protocole

Le protocole expérimental a été approuvé par le Comité d’éthique et d’utilisation des animaux de l’Université de médecine de Kunming (kmmu20220945). Des rats Sprague-Dawley (SD) des deux sexes, de 300 à 350 g, ont été utilisés pour la présente étude.

1. Induire le modèle SAH

1. Anesthésier les rats avec 2 % d’isoflurane et 100 % d’oxygène. Maintenir l’anesthésie en fournissant de l’isoflurane (1 % à 3 %) à une anesthésie par inhalation continue. Fixez la tête du rat à l’aide d’un appareil stéréotaxique (voir le tableau des matériaux).
2. Créez le modèle SAH en suivant les étapes ci-dessous.
   1. Insérez une aiguille de micro-injection dans la citerne suprasellaire. Ensuite, injecter du sang autologue de l’artère caudale du rat (sans anticoagulant) dans la citerne suprasellaire à l’aide d’un pousse-seringue (voir le tableau des matériaux).
   2. Implanter une aiguille de micro-injection dans le ventricule cérébral latéral droit en utilisant les coordonnées mentionnées : bregma, −0,8 mm ; latérale, 1,4 mm ; profondeur, 4 mm⁹. Pour les groupes d’HSA, injecter 0,2 mL de sang de l’artère de la queue de rat. Pour les groupes fictifs, administrer le même volume de solution saline isotonique (Figure 1A).

2. Préparation et stabilisation des tranches de cerveau

1. Anesthésier profondément les rats en inhalant de l’isoflurane à 2 %. Après la décapitation, extrayez le cerveau entier et plongez-le dans du liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF) glacé.
   REMARQUE : Utilisez des solutions d’ACSF fraîchement préparées avec la composition suivante : 134 mM de NaCl, 2,8 mM de KCl, 29 mM de NaHCO₃, 1,1 mM de NaH 2 PO 4, 1,5 mM de MgSO₄, 2,5 mM de CaCl₂et 10,11 mM de D-Glucose (voir le tableau des matériaux). Maintenez un pH entre 7,3 et 7,4.
2. À l’aide d’un vibratome (voir le tableau des matériaux), préparer des tranches de cerveau aiguës d’une épaisseur de 200 μm provenant de rats SD dans de l’ACSF glacé aéré avec 5 % de CO 2 et 95 % d’O 2 (Figure 2).
3. Placez les tranches de cerveau aiguë de 200 μm d’épaisseur dans une chambre de stockage sur un treillis en nylon immergé dans de l’ACSF. Équilibrer la solution ACSF avec 95 % d’O2 et 5 % de CO₂, en maintenant une plage de température de 35 à 37 °C. Laissez les tranches de cerveau se stabiliser pendant 2 h, ce qui leur donne le temps de s’ajuster (Figure 3).

3. Marquage des péricytes dans les coupes de cerveau aiguë avec TO-PRO-3

REMARQUE : Les péricytes des coupes de cerveau aiguë ont été marqués par fluorescence à l’aide du traceur TO-PRO-3¹⁰.

1. Ajouter le colorant fluorescent TO-PRO-3 à l’ACSF, jusqu’à obtenir une concentration finale de 1 μM. Incuber les tranches de cerveau aiguës à température ambiante dans un environnement sombre avec l’ACSF contenant du TO-PRO-3 pendant 20 min.
   REMARQUE : N’oubliez pas de porter des gants en latex lorsque vous manipulez TO-PRO-3 pour vous protéger.
2. Transférez la crépine en maille de nylon, transportant les tranches de cerveau, de la chambre de chargement à une chambre de rinçage de la plaque à 6 puits (voir le tableau des matériaux). Laissez les tranches de cerveau rester dans la chambre de rinçage pendant 10 minutes (Figure 4D).
   REMARQUE : Cette étape de rinçage met fin au processus de coloration, diminue l’étiquetage de fond et empêche les taches non spécifiques.
3. Rincez les préparations pendant un total de 15 min avec une solution ACSF équilibrée avec un mélange de 5 % de CO 2 et 95 % d’O₂. Cette étape de rinçage permet d’arrêter l’absorption du colorant et de minimiser l’étiquetage de fond (figure 4C).

4. Coloration des péricytes non vitaux de la microcirculation cérébrale dans les coupes cérébrales aiguës

1. Incuber des tranches de cerveau préchargées avec TO-PRO-3 à 37 °C avec de l’isolectine B4 conjuguée à Alexa Fluor 488 (FITC-ISOB4 ; 5 μg/mL, voir le tableau des matériaux) pendant 30 min dans un environnement sombre. Après l’incubation, rincez les tranches de cerveau pendant 15 minutes dans de l’ACSF (Figure 4E).
2. Incuber les tranches de cerveau dans de l’ACSF gazé avec 5 % de CO 2 et 95 % d’O₂ comme d’habitude. Ajouter de l’iodure de propidium (IP) à une concentration de 37 μM aux deux solutions à 37 °C. Cela permettra d’étiqueter les péricytes cérébraux non vitaux. Incuber les préparations dans cette solution ACSF pendant 60 min dans l’obscurité (Figure 4F).
3. Ensuite, rincez les préparations pendant 15 minutes avec des solutions ACSF pour arrêter l’absorption du colorant et minimiser l’étiquetage de fond.

5. Imagerie des péricytes cérébraux vitaux et non vitaux dans des coupes cérébrales aiguës

1. Transférer délicatement les tranches de cerveau dans des boîtes confocaux à fond en verre (voir le tableau des matériaux) à l’aide de pipettes Pasteur en plastique. Remplissez les plats avec une solution d’ACSF préalablement équilibrée avec 5 % de CO 2 et 95 % d’O₂. Utilisez un treillis de fer pour fixer les tranches de cerveau de rat en place.
2. Transférez les boîtes confocaux à fond de verre sur la platine d’un microscope confocal. Positionner la tranche aiguë de cerveau au fond de la boîte et la perfuser⁹ avec une solution d’ACSF équilibrée avec un mélange de 95 % d’O2 et de 5 % de CO₂ lors de l’imagerie par microscopie confocale (Figure 5A et Figure 5Ab').
3. Visualisez les cellules de la paroi de la microvascularisation corticale cérébrale à l’aide d’un objectif 40x. Capturez des piles d’images à l’aide d’un logiciel compatible (voir la table des matériaux). Utiliser des filtres appropriés pour IB4 (excitation/émission 460 nm/520 nm), PI (excitation/émission 545 nm/595 nm) et TO-PRO-3 (excitation/émission 606 nm/666 nm) (Figure 5D).
   REMARQUE : Capturez des images avec les détails suivants : objectif DIC N1 40×, 3 × 12 bits : 512 × 512 pixels (0,22 × 0,22 mm), étalonnage : 0,42 μm/px.
4. Identifier la microvascularisation cérébrale et les péricytes en fonction de leur réseau et de leur morphologie. Localisez une région spécifique contenant un réseau de microvascularisation cérébrale sur chaque tranche de cerveau et capturez des images.
5. Notez soigneusement l’emplacement de l’imagerie pour assurer la cohérence des captures subséquentes (Figure 5B, C). Pour un traitement et une analyse ultérieurs, utilisez un logiciel d’analyse d’images (ImageJ) et un logiciel de retouche photo (voir la table des matériaux).

Résultats

Dans des conditions physiologiques normales, les péricytes cérébraux ne subissent généralement pas de mort cellulaire. La figure 6 illustre ce phénomène, le jaune indiquant la présence de péricytes cérébraux vitaux ; Les péricytes cérébraux ne présentent aucune coloration par IP, ce qui indique leur viabilité. Pour étudier plus en détail si les péricytes restent attachés à la microvascularisation après la mort cellulaire, des méthodes ont été employées dans un modè...

Discussion

Des techniques d’imagerie confocale à haute résolution ont été mises au point pour visualiser les péricytes cérébraux vitaux, les péricytes cérébraux non vitaux et la microvascularisation dans les coupes de cerveau. Dans les coupes aiguës de cerveau de rat, le processus implique un marquage initial des péricytes avec TO-PRO-3¹¹, suivi des cellules endothéliales microvasculaires avec IB4¹² ; par la suite, l’identification des péricytes décédés est effect...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well plate	ABC biochemistry	ABC703006	RT
Adobe Photoshop	Adobe	Adobe Illustrator CS6 16.0.0	RT
Aluminium foil	MIAOJIE	225 mm x 273 mm	RT
CaCl2·2H2O	Sigma-Aldrich	C3881	RT
Confocal imaging software	Nikon	NIS-Elements 4.10.00	RT
Confocal Laser Scanning Microscope	Nikon	N-SIM/C2si	RT
Gas tank (5% CO2, 95% O2)	PENGYIDA	40L	RT
Glass Bottom Confocal Dishes	Beyotime	FCFC020-10pcs	RT
Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	RT
Glue	EVOBOND	KH-502	RT
Ice machine	XUEKE	IMS-20	RT
Image analysis software	National Institutes of Health	Image J	RT
Inhalation anesthesia system	SCIENCE	QAF700	RT
Isolectin B 4-FITC	SIGMA	L2895–2MG	Store aliquots at –20 °C
KCl	Sigma-Aldrich	7447–40–7	RT
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P0662	RT
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506	RT
NaCl	Sigma-Aldrich	7647–14–5	RT
NaH2PO4·H2O	Sigma-Aldrich	10049–21–5	RT
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761	RT
Pasteur pipette	NEST Biotechnology	318314	RT
Peristaltic Pump	Scientific Industries Inc	Model 203	RT
Propidium (Iodide)	Med Chem Express	HY-D0815/CS-7538	Store aliquots at –20 °C
Stereotaxic apparatus	SCIENCE	QA	RT
Syringe pump	Harvard PUMP	PUMP 11 ELITE Nanomite	RT
Thermostatic water bath	OLABO	HH-2	RT
Vibrating microtome	Leica	VT1200	RT