Bildgebung vitaler und nicht-vitaler Hirnperizyten in Hirnschnitten nach Subarachnoidalblutung

Zusammenfassung

Die Voruntersuchung bestätigt, dass eine Subarachnoidalblutung (SAB) zum Absterben der Hirnperizyten führt. Die Beurteilung der Perizytenkontraktilität nach SAB erfordert eine Unterscheidung zwischen lebensfähigen und nicht lebensfähigen Hirnperizyten. Daher wurde ein Verfahren entwickelt, mit dem lebensfähige und nicht lebensfähige Hirnperizyten gleichzeitig in Hirnschnitten markiert werden können, was die Beobachtung mit einem hochauflösenden konfokalen Mikroskop erleichtert.

Zusammenfassung

Perizyten sind wichtige Wandzellen, die sich in der zerebralen Mikrozirkulation befinden und für die aktive Modulation des zerebralen Blutflusses durch Kontraktilitätsanpassungen von entscheidender Bedeutung sind. Konventionell wird ihre Kontraktilität durch die Beobachtung morphologischer Verschiebungen und Änderungen des Kapillardurchmessers in der Nähe unter bestimmten Umständen gemessen. Die Fixierung nach dem Gewebe, die Bewertung der Vitalität und die anschließende Kontraktilität der abgebildeten Hirnperizyten werden jedoch beeinträchtigt. In ähnlicher Weise ist die genetische Markierung von Hirnperizyten nicht in der Lage, zwischen lebensfähigen und nicht lebensfähigen Perizyten zu unterscheiden, insbesondere bei neurologischen Erkrankungen wie Subarachnoidalblutungen (SAB), bei denen unsere vorläufige Untersuchung den Absterben von Hirnperizyten bestätigt. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurde ein zuverlässiges Protokoll entwickelt, das die gleichzeitige Fluoreszenzmarkierung von funktionellen und nicht-funktionellen Hirnperizyten in Hirnschnitten ermöglicht. Diese Markierungsmethode ermöglicht eine hochauflösende konfokale mikroskopische Visualisierung bei gleichzeitiger Markierung der Mikrogefäße des Hirnschnitts. Dieses innovative Protokoll bietet die Möglichkeit, die Kontraktilität der Gehirnperizyten, ihre Auswirkungen auf den Kapillardurchmesser und die Perizytenstruktur zu beurteilen. Die Untersuchung der Kontraktilität von Hirnperizyten im SAB-Kontext liefert ein aufschlussreiches Verständnis ihrer Auswirkungen auf die zerebrale Mikrozirkulation.

Einleitung

Hirnperizyten, die sich durch ihre schlanken Ausstülpungen und hervorstehenden Zellkörper auszeichnen, umkreisen die Mikrozirkulation ^1,2. Während die zerebrale Durchblutungsaugmentation überwiegend durch kapillare Dilatation angetrieben wird, weisen kleinere Arterien langsamere Dilatationsraten auf³. Die Kontraktilität der Perizyten übt einen Einfluss auf den Kapillardurchmesser und die Perizytenmorphologie aus und wirkt sich auf die Gefäßdynamik aus⁴. Die Kontraktion der Hirnperizyten führt zu einer Verengung der Kapillaren, und in pathologischen Szenarien kann....

Protokoll

Das Versuchsprotokoll wurde von der Kommission für Tierethik und -verwendung der Medizinischen Universität Kunming genehmigt (kmmu20220945). Für die vorliegende Studie wurden Sprague-Dawley (SD)-Ratten beiderlei Geschlechts, 300-350 g, verwendet.

1. Induktion des SAB-Modells

1. Betäuben Sie die Ratten mit 2 % Isofluran und 100 % Sauerstoff. Aufrechterhaltung der Anästhesie durch kontinuierliche Inhalationsanästhesie mit Isofluran (1%-3%). Befestigen Sie den Kopf der Ratte mit einem stereotaktischen Gerät (siehe Materialtabelle).
2. Erstellen Sie das SAH-Modell, indem Sie die folgenden Schritte....

Diskussion

Es wurden hochauflösende konfokale Bildgebungsverfahren zur Visualisierung von vitalen Hirnperizyten, nicht-vitalen Hirnperizyten und der Mikrogefäße in Hirnschnitten entwickelt. In akuten Hirnschnitten von Ratten werden zunächst Perizyten mit TO-PRO-3¹¹ markiert, gefolgt von mikrovaskulären Endothelzellen mit IB4¹²; Anschließend erfolgt die Identifizierung der verstorbenen Perizyten mittels PI. Dieses Protokoll ist einfach, reproduzierbar und in hohem Maße anwendbar.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well plate	ABC biochemistry	ABC703006	RT
Adobe Photoshop	Adobe	Adobe Illustrator CS6 16.0.0	RT
Aluminium foil	MIAOJIE	225 mm x 273 mm	RT
CaCl2·2H2O	Sigma-Aldrich	C3881	RT
Confocal imaging software	Nikon	NIS-Elements 4.10.00	RT
Confocal Laser Scanning Microscope	Nikon	N-SIM/C2si	RT
Gas tank (5% CO2, 95% O2)	PENGYIDA	40L	RT
Glass Bottom Confocal Dishes	Beyotime	FCFC020-10pcs	RT
Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	RT
Glue	EVOBOND	KH-502	RT
Ice machine	XUEKE	IMS-20	RT
Image analysis software	National Institutes of Health	Image J	RT
Inhalation anesthesia system	SCIENCE	QAF700	RT
Isolectin B 4-FITC	SIGMA	L2895–2MG	Store aliquots at –20 °C
KCl	Sigma-Aldrich	7447–40–7	RT
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P0662	RT
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506	RT
NaCl	Sigma-Aldrich	7647–14–5	RT
NaH2PO4·H2O	Sigma-Aldrich	10049–21–5	RT
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761	RT
Pasteur pipette	NEST Biotechnology	318314	RT
Peristaltic Pump	Scientific Industries Inc	Model 203	RT
Propidium (Iodide)	Med Chem Express	HY-D0815/CS-7538	Store aliquots at –20 °C
Stereotaxic apparatus	SCIENCE	QA	RT
Syringe pump	Harvard PUMP	PUMP 11 ELITE Nanomite	RT
Thermostatic water bath	OLABO	HH-2	RT
Vibrating microtome	Leica	VT1200	RT