Bildgebung vitaler und nicht-vitaler Hirnperizyten in Hirnschnitten nach Subarachnoidalblutung

Zusammenfassung

Die Voruntersuchung bestätigt, dass eine Subarachnoidalblutung (SAB) zum Absterben der Hirnperizyten führt. Die Beurteilung der Perizytenkontraktilität nach SAB erfordert eine Unterscheidung zwischen lebensfähigen und nicht lebensfähigen Hirnperizyten. Daher wurde ein Verfahren entwickelt, mit dem lebensfähige und nicht lebensfähige Hirnperizyten gleichzeitig in Hirnschnitten markiert werden können, was die Beobachtung mit einem hochauflösenden konfokalen Mikroskop erleichtert.

Zusammenfassung

Perizyten sind wichtige Wandzellen, die sich in der zerebralen Mikrozirkulation befinden und für die aktive Modulation des zerebralen Blutflusses durch Kontraktilitätsanpassungen von entscheidender Bedeutung sind. Konventionell wird ihre Kontraktilität durch die Beobachtung morphologischer Verschiebungen und Änderungen des Kapillardurchmessers in der Nähe unter bestimmten Umständen gemessen. Die Fixierung nach dem Gewebe, die Bewertung der Vitalität und die anschließende Kontraktilität der abgebildeten Hirnperizyten werden jedoch beeinträchtigt. In ähnlicher Weise ist die genetische Markierung von Hirnperizyten nicht in der Lage, zwischen lebensfähigen und nicht lebensfähigen Perizyten zu unterscheiden, insbesondere bei neurologischen Erkrankungen wie Subarachnoidalblutungen (SAB), bei denen unsere vorläufige Untersuchung den Absterben von Hirnperizyten bestätigt. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurde ein zuverlässiges Protokoll entwickelt, das die gleichzeitige Fluoreszenzmarkierung von funktionellen und nicht-funktionellen Hirnperizyten in Hirnschnitten ermöglicht. Diese Markierungsmethode ermöglicht eine hochauflösende konfokale mikroskopische Visualisierung bei gleichzeitiger Markierung der Mikrogefäße des Hirnschnitts. Dieses innovative Protokoll bietet die Möglichkeit, die Kontraktilität der Gehirnperizyten, ihre Auswirkungen auf den Kapillardurchmesser und die Perizytenstruktur zu beurteilen. Die Untersuchung der Kontraktilität von Hirnperizyten im SAB-Kontext liefert ein aufschlussreiches Verständnis ihrer Auswirkungen auf die zerebrale Mikrozirkulation.

Einleitung

Hirnperizyten, die sich durch ihre schlanken Ausstülpungen und hervorstehenden Zellkörper auszeichnen, umkreisen die Mikrozirkulation ^1,2. Während die zerebrale Durchblutungsaugmentation überwiegend durch kapillare Dilatation angetrieben wird, weisen kleinere Arterien langsamere Dilatationsraten auf³. Die Kontraktilität der Perizyten übt einen Einfluss auf den Kapillardurchmesser und die Perizytenmorphologie aus und wirkt sich auf die Gefäßdynamik aus⁴. Die Kontraktion der Hirnperizyten führt zu einer Verengung der Kapillaren, und in pathologischen Szenarien kann eine übermäßige Kontraktion den Erythrozytenfluss behindern⁵. Verschiedene Faktoren, einschließlich Noradrenalin, das aus dem Locus coeruleus freigesetzt wird, können eine Kontraktion der Gehirnperizyten in den Kapillaren induzieren⁶. Perizyten spielen eine regulatorische Rolle im zerebralen Blutfluss und zeigen eine 20-HETE-Synthese, die als Sauerstoffsensor während der Hyperoxie⁷ dient. Die durch oxidativ-nitrativen Stress ausgelöste Kontraktion der Hirnperizyten wirkt sich nachteilig auf die Kapillaren aus⁵. Trotz In-vivo- und Ex-vivo-Untersuchungen zur Hirnperizytenkontraktion⁸ ist das Wissen über die Bildgebung von lebensfähigen und nicht-lebensfähigen Hirnperizyten in Hirnschnitten nach wie vor begrenzt.

Entscheidend ist, dass die Bildgebung der Hirnperizyten nach der Gewebefixierung deren Vitalität und die anschließende Beurteilung der Kontraktilität beeinträchtigt. Darüber hinaus kann in Szenarien wie neurologischen Störungen (z. B. Subarachnoidalblutung - SAB) bei der transgenen Markierung von Hirnperizyten nicht zwischen lebensfähigen und nicht lebensfähigen Perizyten unterschieden werden, wie unsere vorläufige SAB-induzierte Hirnperizytentodstudie⁹ bestätigt.

Um diese Herausforderungen zu meistern, setzten wir TO-PRO-3 zur Markierung lebender Perizyten ein, während verstorbene mit Propidiumiodid (PI) gefärbt wurden. Wir verwendeten hochauflösende konfokale Bildgebungstechnologien, um lebensfähige und nicht lebensfähige Hirnperizyten in Hirnschnitten zu visualisieren und gleichzeitig die Schichtaktivität während der Bildgebung zu erhalten. Dieser Artikel zielt darauf ab, eine reproduzierbare Methode zur Darstellung lebensfähiger und nicht lebensfähiger Hirnperizyten in Hirnschnitten vorzustellen, die als wertvolles Werkzeug dient, um den Einfluss von Hirnperizyten auf die zerebrale Mikrozirkulation nach SAB zu untersuchen.

Protokoll

Das Versuchsprotokoll wurde von der Kommission für Tierethik und -verwendung der Medizinischen Universität Kunming genehmigt (kmmu20220945). Für die vorliegende Studie wurden Sprague-Dawley (SD)-Ratten beiderlei Geschlechts, 300-350 g, verwendet.

1. Induktion des SAB-Modells

1. Betäuben Sie die Ratten mit 2 % Isofluran und 100 % Sauerstoff. Aufrechterhaltung der Anästhesie durch kontinuierliche Inhalationsanästhesie mit Isofluran (1%-3%). Befestigen Sie den Kopf der Ratte mit einem stereotaktischen Gerät (siehe Materialtabelle).
2. Erstellen Sie das SAH-Modell, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
   1. Führen Sie eine Mikroinjektionsnadel in den suprasellaren Spülkasten ein. Anschließend wird Eigenblut aus der Rattenschwanzarterie (ohne Antikoagulans) mit einer Spritzenpumpe in die suprasellare Zisterne injiziert (siehe Materialtabelle).
   2. Implantieren Sie eine Mikroinjektionsnadel in den rechten lateralen Hirnventrikel mit den genannten Koordinaten: bregma, −0,8 mm; seitlich, 1,4 mm; Tiefe, 4 mm⁹. Für SAB-Gruppen injizieren Sie 0,2 ml Blut aus der Rattenschwanzarterie. Bei Scheingruppen wird die gleiche Menge isotonischer Kochsalzlösung verabreicht (Abbildung 1A).

2. Präparation und Stabilisierung von Hirnschnitten

1. Die Ratten werden mit einer Inhalation von 2 % Isofluran tief betäubt. Nach der Enthauptung wird das gesamte Gehirn entnommen und in eiskaltes künstliches Liquor cerebrospinalis (ACSF) getaucht.
   HINWEIS: Verwenden Sie frisch zubereitete ACSF-Lösungen mit der folgenden Zusammensetzung: 134 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 29 mM NaHCO₃, 1,1 mM NaH 2 PO 4, 1,5 mM MgSO₄, 2,5 mM CaCl ₂und 10,11 mM D-Glucose (siehe Materialtabelle). Halten Sie einen pH-Wert zwischen 7,3 und 7,4 aufrecht.
2. Verwenden Sie ein Vibratom (siehe Materialtabelle), um akute Hirnschnitte mit einer Dicke von 200 μm von den SD-Ratten in eiskaltem ACSF herzustellen, das mit 5 % CO 2 und 95 % _O2 belüftet ist (Abbildung 2).
3. Legen Sie die 200 μm dicken akuten Hirnschnitte in eine Vorratskammer auf ein Nylonnetz, das in ACSF getaucht ist. Die ACSF-Lösung wird mit 95 % O2 und 5 %_CO2 in einem Temperaturbereich von 35-37 °C ausgeglichen. Lassen Sie die Gehirnschnitte 2 Stunden lang stabilisieren, damit sie sich anpassen können (Abbildung 3).

3. Markierung von Perizyten in akuten Hirnschnitten mit TO-PRO-3

HINWEIS: Perizyten aus akuten Hirnschnitten wurden mit dem Tracer TO-PRO-3¹⁰ fluoreszenzmarkiert.

1. Der Fluoreszenzfarbstoff TO-PRO-3 wird mit dem ACSF versetzt, so dass eine Endkonzentration von 1 μM erreicht wird. Inkubieren Sie die akuten Hirnschnitte bei Raumtemperatur in dunkler Umgebung mit dem TO-PRO-3-haltigen ACSF für 20 min.
   HINWEIS: Denken Sie daran, Latexhandschuhe zu tragen, wenn Sie TO-PRO-3 zum Schutz handhaben.
2. Das Nylongewebesieb mit den Hirnschnitten aus der Ladekammer in eine 6-Well-Plattenspülkammer überführen (siehe Materialtabelle). Lassen Sie die Hirnschnitte 10 Minuten in der Spülkammer verbleiben (Abbildung 4D).
   HINWEIS: Dieser Spülschritt beendet den Färbeprozess, verringert die Hintergrundbeschriftung und verhindert unspezifische Flecken.
3. Spülen Sie die Präparate insgesamt 15 Minuten lang mit einer ACSF-Lösung, die mit einer Mischung aus 5 %_CO2 und 95 %_O2 äquilibriert ist. Dieser Spülschritt stoppt die Farbstoffaufnahme und minimiert die Hintergrundmarkierung (Abbildung 4C).

4. Färbung nicht-vitaler Perizyten der zerebralen Mikrozirkulation in akuten Hirnschnitten

1. Inkubieren Sie Gehirnschnitte, die mit TO-PRO-3 vorgeladen sind, bei 37 °C mit Isolektin B4, konjugiert mit Alexa Fluor 488 (FITC-ISOB4; 5 μg/ml, siehe Materialtabelle) für 30 Minuten in einer dunklen Umgebung. Nach der Inkubation werden die Hirnschnitte 15 Minuten lang in ACSF gespült (Abbildung 4E).
2. Inkubieren Sie die Hirnschnitte wie üblich in ACSF, das mit 5 % CO2 und 95 %_O2 vergast ist. Propidiumiodid (PI) in einer Konzentration von 37 μM wird zu beiden Lösungen bei 37 °C gegeben. Dadurch werden nicht-vitale Hirnperizyten markiert. Die Präparate werden in dieser ACSF-Lösung 60 Minuten lang im Dunkeln inkubiert (Abbildung 4F).
3. Als nächstes spülen Sie die Präparate 15 Minuten lang mit ACSF-Lösungen, um die Farbstoffaufnahme zu stoppen und die Hintergrundmarkierung zu minimieren.

5. Bildgebung vitaler und nicht-vitaler Hirnperizyten in akuten Hirnschnitten

1. Die Gehirnschnitte werden vorsichtig mit Pasteurpipetten aus Kunststoff in konfokale Schalen mit Glasboden (siehe Materialtabelle) übertragen. Füllen Sie die Schalen mit ACSF-Lösung, die zuvor mit 5 % CO2 und 95 %_O2 äquilibriert wurde. Verwende ein Eisengitter, um Rattenhirnschnitte an Ort und Stelle zu befestigen.
2. Übertragen Sie die konfokalen Glasbodenschalen auf den Tisch eines konfokalen Mikroskops. Positionieren Sie den akuten Hirnschnitt am Boden der Schale und perfundiertieren Sie ihn⁹ mit einer ACSF-Lösung, die mit einer Mischung aus 95 % O2 und 5 %_CO2 während der konfokalen mikroskopischen Bildgebung äquilibriert ist (Abbildung 5A und Abbildung 5Ab').
3. Visualisieren Sie die Wandzellen der zerebralen kortikalen Mikrogefäße mit einem 40-fachen Objektiv. Erfassen Sie Bildstapel mit kompatibler Software (siehe Materialtabelle). Verwenden Sie geeignete Filter für IB4 (Anregung/Emission 460 nm/520 nm), PI (Anregung/Emission 545 nm/595 nm) und TO-PRO-3 (Anregung/Emission 606 nm/666 nm) (Abbildung 5D).
   HINWEIS: Nehmen Sie Bilder mit den folgenden Details auf: 40× DIC N1 Objektiv, 3 × 12 Bit: 512 × 512 Pixel (0,22 × 0,22 mm), Kalibrierung: 0,42 μm/px.
4. Identifizierung von zerebralen Mikrogefäßen und Perizyten anhand ihres Netzwerks und ihrer Morphologie. Lokalisieren Sie eine bestimmte Region, die ein zerebrales Mikrogefäßsystem auf jedem Hirnschnitt enthält, und nehmen Sie Bilder auf.
5. Notieren Sie sich sorgfältig den Aufnahmeort, um die Konsistenz bei nachfolgenden Aufnahmen sicherzustellen (Abbildung 5B,C). Verwenden Sie für die weitere Verarbeitung und Analyse eine Bildanalysesoftware (ImageJ) und eine Bildbearbeitungssoftware (siehe Materialtabelle).

Ergebnisse

Unter normalen physiologischen Bedingungen erleiden Hirnperizyten in der Regel keinen Zelltod. Abbildung 6 veranschaulicht dieses Phänomen, wobei Gelb das Vorhandensein lebenswichtiger Hirnperizyten anzeigt. Die Perizyten des Gehirns zeigen keine Färbung mit PI, was auf ihre Lebensfähigkeit hinweist. Um weiter zu untersuchen, ob Perizyten nach dem Zelltod an das Mikrogefäßsystem gebunden bleiben, wurden Methoden in einem SAH-Rattenmodell eingesetzt und anschließend eine Bildgebung durc...

Diskussion

Es wurden hochauflösende konfokale Bildgebungsverfahren zur Visualisierung von vitalen Hirnperizyten, nicht-vitalen Hirnperizyten und der Mikrogefäße in Hirnschnitten entwickelt. In akuten Hirnschnitten von Ratten werden zunächst Perizyten mit TO-PRO-3¹¹ markiert, gefolgt von mikrovaskulären Endothelzellen mit IB4¹²; Anschließend erfolgt die Identifizierung der verstorbenen Perizyten mittels PI. Dieses Protokoll ist einfach, reproduzierbar und in hohem Maße anwendbar...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well plate	ABC biochemistry	ABC703006	RT
Adobe Photoshop	Adobe	Adobe Illustrator CS6 16.0.0	RT
Aluminium foil	MIAOJIE	225 mm x 273 mm	RT
CaCl2·2H2O	Sigma-Aldrich	C3881	RT
Confocal imaging software	Nikon	NIS-Elements 4.10.00	RT
Confocal Laser Scanning Microscope	Nikon	N-SIM/C2si	RT
Gas tank (5% CO2, 95% O2)	PENGYIDA	40L	RT
Glass Bottom Confocal Dishes	Beyotime	FCFC020-10pcs	RT
Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	RT
Glue	EVOBOND	KH-502	RT
Ice machine	XUEKE	IMS-20	RT
Image analysis software	National Institutes of Health	Image J	RT
Inhalation anesthesia system	SCIENCE	QAF700	RT
Isolectin B 4-FITC	SIGMA	L2895–2MG	Store aliquots at –20 °C
KCl	Sigma-Aldrich	7447–40–7	RT
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P0662	RT
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506	RT
NaCl	Sigma-Aldrich	7647–14–5	RT
NaH2PO4·H2O	Sigma-Aldrich	10049–21–5	RT
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761	RT
Pasteur pipette	NEST Biotechnology	318314	RT
Peristaltic Pump	Scientific Industries Inc	Model 203	RT
Propidium (Iodide)	Med Chem Express	HY-D0815/CS-7538	Store aliquots at –20 °C
Stereotaxic apparatus	SCIENCE	QA	RT
Syringe pump	Harvard PUMP	PUMP 11 ELITE Nanomite	RT
Thermostatic water bath	OLABO	HH-2	RT
Vibrating microtome	Leica	VT1200	RT