Obtención de imágenes de pericitos cerebrales vitales y no vitales en cortes de cerebro después de una hemorragia subaracnoidea

Resumen

La investigación preliminar confirma que la hemorragia subaracnoidea (HSA) causa la muerte de los pericitos cerebrales. La evaluación de la contractilidad de los pericitos después de la HSA requiere la diferenciación entre pericitos cerebrales viables y no viables. Por lo tanto, se ha desarrollado un procedimiento para marcar pericitos cerebrales viables y no viables simultáneamente en secciones cerebrales, lo que facilita la observación utilizando un microscopio confocal de alta resolución.

Resumen

Los pericitos son células murales cruciales situadas dentro de la microcirculación cerebral, fundamentales para modular activamente el flujo sanguíneo cerebral a través de ajustes de contractilidad. Convencionalmente, su contractilidad se mide observando los cambios morfológicos y los cambios de diámetro capilar cercanos en circunstancias específicas. Sin embargo, la fijación posterior al tejido, la evaluación de la vitalidad y la consiguiente contractilidad pericitaria de los pericitos cerebrales de los que se obtienen imágenes se ven comprometidas. Del mismo modo, el etiquetado genético de los pericitos cerebrales se queda corto a la hora de distinguir entre pericitos viables y no viables, especialmente en afecciones neurológicas como la hemorragia subaracnoidea (HSA), donde nuestra investigación preliminar valida la desaparición de los pericitos cerebrales. Se ha diseñado un protocolo fiable para superar estas limitaciones, que permite el marcaje fluorescente simultáneo de pericitos cerebrales funcionales y no funcionales en secciones cerebrales. Este método de etiquetado permite la visualización al microscopio confocal de alta resolución, marcando simultáneamente la microvasculatura del corte de cerebro. Este innovador protocolo ofrece un medio para evaluar la contractilidad del pericito cerebral, su impacto en el diámetro capilar y la estructura del pericito. La investigación de la contractilidad de los pericitos cerebrales en el contexto de la HSA permite comprender mejor sus efectos sobre la microcirculación cerebral.

Introducción

Los pericitos cerebrales, que se distinguen por sus protuberancias delgadas y cuerpos celulares que sobresalen, rodean la microcirculación ^1,2. Mientras que el aumento del flujo sanguíneo cerebral es impulsado predominantemente por la dilatación capilar, las arterias más pequeñas exhiben tasas más lentas^{de dilatación}. La contractilidad pericitaria ejerce influencia sobre el diámetro capilar y la morfología pericitaria, impactando en la dinámica vascular⁴. La contracción de los pericitos cerebrales conduce a la constricción capilar y, en escenarios patológicos, la contracción excesiva puede impedir el flujo de eritrocitos⁵. Varios factores, incluida la norepinefrina liberada del locus coeruleus, pueden inducir la contracción de los pericitos cerebrales dentro de los capilares⁶. Con un papel regulador en el flujo sanguíneo cerebral, los pericitos exhiben síntesis de 20-HOTE, sirviendo como sensor de oxígeno durante la hiperoxia⁷. La contracción de los pericitos cerebrales provocada por el estrés oxidativo-nitrativo afecta negativamente a los capilares⁵. A pesar de las investigaciones in vivo y ex vivo sobre la contracción de los pericitos cerebrales⁸, persiste un conocimiento limitado con respecto a la obtención de imágenes de pericitos cerebrales viables y no viables dentro de cortes de cerebro.

De manera crucial, las imágenes posteriores a la fijación tisular de los pericitos cerebrales comprometen su vitalidad y la posterior evaluación de la contractilidad. Además, en escenarios como los trastornos neurológicos (p. ej., hemorragia subaracnoidea - HSA), el marcaje transgénico de los pericitos cerebrales no logra diferenciar entre pericitos viables y no viables, como lo confirma nuestro estudio preliminar de muerte de pericitos cerebrales inducida por HSA⁹.

Para superar estos desafíos, empleamos TO-PRO-3 para marcar pericitos vivos, mientras que los fallecidos se tiñeron con yoduro de propidio (PI). Utilizamos tecnologías de imágenes confocales de alta resolución para visualizar pericitos cerebrales viables y no viables en cortes de cerebro, al tiempo que preservamos la actividad de los cortes durante la obtención de imágenes. Este artículo tiene como objetivo presentar un método reproducible para obtener imágenes de pericitos cerebrales viables y no viables en cortes de cerebro, que sirva como una herramienta valiosa para investigar el impacto de los pericitos cerebrales en la microcirculación cerebral después de la HSA.

Protocolo

El protocolo experimental fue aprobado por el Comité de Ética y Uso Animal de la Universidad Médica de Kunming (kmmu20220945). Para el presente estudio se utilizaron ratas Sprague-Dawley (SD) de ambos sexos, de 300-350 g.

1. Inducir el modelo SAH

1. Anestesiar a las ratas con isoflurano al 2% y oxígeno al 100%. Mantener la anestesia suministrando anestesia inhalatoria continua con isoflurano (1%-3%). Asegure la cabeza de la rata con un aparato estereotáxico (consulte la Tabla de materiales).
2. Cree el modelo SAH siguiendo los pasos que se indican a continuación.
   1. Inserte una aguja de microinyección en la cisterna supraselar. A continuación, inyecte sangre autóloga de la arteria de la cola de la rata (sin anticoagulante) en la cisterna supraselar utilizando una bomba de jeringa (ver Tabla de materiales).
   2. Implantar una aguja de microinyección en el ventrículo cerebral lateral derecho utilizando las coordenadas mencionadas: bregma, −0,8 mm; lateral, 1,4 mm; profundidad, 4 mm⁹. Para los grupos de HSA, inyecte 0,2 ml de sangre de la arteria de la cola de rata. Para grupos simulados, administrar el mismo volumen de suero fisiológico isotónico (Figura 1A).

2. Preparación y estabilización de cortes de cerebro

1. Anestesiar profundamente a las ratas con inhalación de isoflurano al 2%. Después de la decapitación, extraiga todo el cerebro y sumérjalo en líquido cefalorraquídeo artificial helado (ACSF, por sus siglas en inglés).
   NOTA: Utilice soluciones de ACSF recién preparadas con la siguiente composición: 134 mM de NaCl, 2,8 mM de KCl, 29 mM de NaHCO₃, 1,1 mM de NaH 2 PO 4, 1,5 mM de MgSO₄, 2,5 mM de CaCl₂y 10,11 mM de D-glucosa (ver Tabla de Materiales). Mantenga un pH entre 7,3 y 7,4.
2. Utilice un vibrátomo (ver Tabla de materiales) para preparar cortes agudos de cerebro con un grosor de 200 μm de las ratas SD en ACSF helado que se airea con 5% de CO 2 y 95% de_O2 (Figura 2).
3. Coloque los cortes agudos de cerebro de 200 μm de espesor en una cámara de almacenamiento sobre una malla de nailon sumergida en ACSF. Equilibrar la solución ACSF con 95% de_O2 y 5% de CO₂, manteniendo un rango de temperatura de 35-37 °C. Deje que los cortes de cerebro se estabilicen durante 2 h, dándoles tiempo para adaptarse (Figura 3).

3. Marcaje de pericitos en cortes cerebrales agudos con TO-PRO-3

NOTA: Los pericitos de cortes agudos de cerebro se marcaron con fluorescencia utilizando el trazador TO-PRO-3¹⁰.

1. Añadir el colorante fluorescente TO-PRO-3 al ACSF, consiguiendo una concentración final de 1 μM. Incubar los cortes agudos de cerebro a temperatura ambiente en un ambiente oscuro con el ACSF que contiene TO-PRO-3 durante 20 min.
   NOTA: Recuerde usar guantes de látex mientras manipula TO-PRO-3 para su protección.
2. Transfiera el colador de malla de nylon, que transporta las rodajas de cerebro, de la cámara de carga a una cámara de enjuague de placas de 6 pocillos (consulte la Tabla de materiales). Deje que los cortes de cerebro permanezcan en la cámara de enjuague durante 10 minutos (Figura 4D).
   NOTA: Este paso de enjuague finaliza el proceso de tinción, disminuye el etiquetado de fondo y evita la tinción inespecífica.
3. Enjuague las preparaciones durante un total de 15 minutos con una solución de ACSF equilibrada con una mezcla de 5% de CO 2 y 95% de O₂. Este paso de enjuague detiene la absorción del tinte y minimiza el etiquetado de fondo (Figura 4C).

4. Tinción de pericitos no vitales de la microcirculación cerebral en cortes cerebrales agudos

1. Incubar cortes de cerebro precargados con TO-PRO-3 a 37 °C con isolectina B4 conjugada con Alexa Fluor 488 (FITC-ISOB4; 5 μg/mL, ver Tabla de Materiales) durante 30 min en un ambiente oscuro. Después de la incubación, enjuague las rodajas de cerebro durante 15 minutos en ACSF (Figura 4E).
2. Incubar las rodajas de cerebro en ACSF gaseado con 5% de CO₂ y 95% de_O2 como de costumbre. Añadir yoduro de propidio (PI) a una concentración de 37 μM a ambas soluciones a 37 °C. Esto etiquetará los pericitos cerebrales no vitales. Incubar las preparaciones en esta solución de ACSF durante 60 minutos en la oscuridad (Figura 4F).
3. A continuación, enjuague las preparaciones durante 15 minutos con soluciones ACSF para detener la absorción del tinte y minimizar el etiquetado de fondo.

5. Obtención de imágenes de pericitos cerebrales vitales y no vitales en cortes cerebrales agudos

1. Transfiera suavemente las rodajas de cerebro a platos confocales con fondo de vidrio (consulte la Tabla de materiales) utilizando pipetas Pasteur de plástico. Llene los platos con una solución de ACSF previamente equilibrada con 5% de CO2 y 95% de_O2. Use una malla de hierro para asegurar las rodajas de cerebro de rata en su lugar.
2. Transfiera las placas confocales con fondo de vidrio a la platina de un microscopio confocal. Coloque el corte agudo de cerebro en el fondo de la placa y transfundíquelo con una solución de ACSF equilibrada con una mezcla de 95% de_O2 y 5% de CO₂ durante la obtención de imágenes de microscopía confocal (Figura 5A y Figura 5Ab').
3. Visualice las células de la pared de la microvasculatura cortical cerebral utilizando un objetivo de 40x. Capture pilas de imágenes utilizando software compatible (consulte la Tabla de materiales). Utilice filtros apropiados para IB4 (excitación/emisión 460 nm/520 nm), PI (excitación/emisión 545 nm/595 nm) y TO-PRO-3 (excitación/emisión 606 nm/666 nm) (Figura 5D).
   NOTA: Capture imágenes con los siguientes detalles: lente de objetivo 40× DIC N1, 3 × 12 bits: 512 × 512 píxeles (0,22 × 0,22 mm), calibración: 0,42 μm/px.
4. Identificar la microvasculatura cerebral y los pericitos en función de su red y morfología. Localice una región específica que contenga una red de microvasculatura cerebral en cada corte de cerebro y capture imágenes.
5. Anote cuidadosamente la ubicación de la imagen para garantizar la coherencia en las capturas posteriores (Figura 5B, C). Para un mayor procesamiento y análisis, utilice un software de análisis de imágenes (ImageJ) y un software de edición de fotos (consulte la tabla de materiales).

Resultados

En condiciones fisiológicas normales, los pericitos cerebrales generalmente no sufren muerte celular. La figura 6 ilustra este fenómeno, donde el amarillo indica la presencia de pericitos cerebrales vitales; Los pericitos cerebrales no muestran tinción con PI, lo que indica su viabilidad. Para investigar más a fondo si los pericitos permanecen unidos a la microvasculatura después de la muerte celular, se emplearon métodos en un modelo de rata SAH y se realizaron imágenes posteriores.<...

Discusión

Se han desarrollado técnicas de imagen confocal de alta resolución para visualizar los pericitos cerebrales vitales, los pericitos cerebrales no vitales y la microvasculatura en cortes cerebrales. En cortes agudos de cerebro de rata, el proceso implica el marcaje inicial de pericitos con TO-PRO-3¹¹, seguido de células endoteliales microvasculares con IB4¹²; posteriormente, se realiza la identificación de los pericitos fallecidos mediante PI. Este protocolo es sencillo, ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well plate	ABC biochemistry	ABC703006	RT
Adobe Photoshop	Adobe	Adobe Illustrator CS6 16.0.0	RT
Aluminium foil	MIAOJIE	225 mm x 273 mm	RT
CaCl2·2H2O	Sigma-Aldrich	C3881	RT
Confocal imaging software	Nikon	NIS-Elements 4.10.00	RT
Confocal Laser Scanning Microscope	Nikon	N-SIM/C2si	RT
Gas tank (5% CO2, 95% O2)	PENGYIDA	40L	RT
Glass Bottom Confocal Dishes	Beyotime	FCFC020-10pcs	RT
Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	RT
Glue	EVOBOND	KH-502	RT
Ice machine	XUEKE	IMS-20	RT
Image analysis software	National Institutes of Health	Image J	RT
Inhalation anesthesia system	SCIENCE	QAF700	RT
Isolectin B 4-FITC	SIGMA	L2895–2MG	Store aliquots at –20 °C
KCl	Sigma-Aldrich	7447–40–7	RT
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P0662	RT
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506	RT
NaCl	Sigma-Aldrich	7647–14–5	RT
NaH2PO4·H2O	Sigma-Aldrich	10049–21–5	RT
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761	RT
Pasteur pipette	NEST Biotechnology	318314	RT
Peristaltic Pump	Scientific Industries Inc	Model 203	RT
Propidium (Iodide)	Med Chem Express	HY-D0815/CS-7538	Store aliquots at –20 °C
Stereotaxic apparatus	SCIENCE	QA	RT
Syringe pump	Harvard PUMP	PUMP 11 ELITE Nanomite	RT
Thermostatic water bath	OLABO	HH-2	RT
Vibrating microtome	Leica	VT1200	RT