A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يبسط هذا البروتوكول إنتاج النواقل الفيروسية القهقرية ونقل الخلايا التائية للفأر ، مما يسهل التوليد الفعال للخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية للفئران.

Abstract

حققت العلاجات الخلوية المهندسة باستخدام مستقبلات المستضد الخيمري (CAR) -T فعالية ملحوظة في الأفراد المصابين بالأورام الخبيثة الدموية وتخضع حاليا للتطوير لعلاج الأورام الصلبة المتنوعة. حتى الآن ، تم إجراء التقييم الأولي لمنتجات الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية الجديدة في الغالب في نماذج ورم xenograft باستخدام الفئران التي تعاني من نقص المناعة. تم اختيار هذا النهج لتسهيل التطعيمات الناجحة للخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية البشرية في البيئة التجريبية. ومع ذلك ، فإن نماذج الفئران التخليقية ، التي تستمد فيها الأورام والخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية من نفس سلالة الفأر ، تسمح بتقييم تقنيات CAR الجديدة في سياق نظام المناعة الوظيفي والبيئة المكروية الشاملة للورم (TME). يهدف البروتوكول الموصوف هنا إلى تبسيط عملية توليد الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية في الفأر من خلال تقديم طرق موحدة لنقل الفيروسات القهقرية وزراعة الخلايا التائية خارج الجسم الحي . يمكن تطبيق الطرق الموضحة في هذا البروتوكول على تركيبات CAR الأخرى بخلاف تلك المستخدمة في هذه الدراسة لتمكين التقييم الروتيني لتقنيات CAR الجديدة في الأنظمة ذات الكفاءة المناعية.

Introduction

أحدثت علاجات الخلايا التائية بالتبني التي تعبر عن مستقبلات المستضدات الخيمرية (CARs) ثورة في مجال العلاج المناعي للسرطان من خلال تسخير قوة جهاز المناعة التكيفي لاستهداف الخلايا السرطانية الإيجابية للمستضد والقضاء عليها على وجه التحديد1. في حين تم التحقق سريريا من صحة نجاح علاجات الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية التي تستهدف الأورام الخبيثة في الخلايا البائية ، تظل الدراسات قبل السريرية التي أجريت على النماذج الحيوانية حيوية لتطوير مستقبلات المستضدات الوهمية الجديدة التي تستهدف الأورام الصلبة. ومع ذلك ، فقد تم إثبات فعالية سريرية محدودة في مؤشرات الورم الصلب حتى الآن ، وأصبح من الواضح بشكل متزايد أن النماذج الف....

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية بموافقة من اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام (جامعة كولومبيا ، بروتوكولات AC-AABQ5551 و AC-AAAZ4470) باستخدام إناث BALB / c البالغة من العمر 6-8 أسابيع أو CF57BL / 6 الفئران التي يتراوح وزنها بين 20-25 جم. تم الحصول على من مصدر تجاري (انظر جدول المواد). يتمحور هذا البروتوكول حول "أيام ما بعد التنشيط" للخلايا التائية الفئرانية ، ويبدأ الإنتاج الفيروسي في اليوم -2. يمكن تخزين الفيروس القهقري عند -80 درجة مئوية بعد الإنتاج الأولي ، وللاستخدام المستقبلي لهذا البروتوكول ، يمكن للمرء أن يبدأ بالخطوة 2 ، عزل الخلايا التائية وتنشيطها في اليوم 0.

1. إنتاج ناقلات الفيروسات القهقرية

<....

النتائج

يهدف البروتوكول الموصوف هنا إلى توحيد عملية نقل الخلايا التائية للفأر لتوليد خلايا CAR-T للفأر. ويقدم الشكل 1 وصفا مفصلا للخطوات المعنية. تبدأ العملية بإنتاج ناقلات الفيروسات القهقرية عن طريق النقل المشترك للمكونات الفيروسية إلى خلايا Phoenix Eco. يقدم الشكل 2

Discussion

يصف هذا البروتوكول الخطوات والكواشف اللازمة لنقل الفيروسات القهقرية للخلايا التائية الفئرانية لتوليد خلايا CAR-T للدراسات في الجسم الحي . إن تحسين ظروف نقل الفيروسات القهقرية يحقق تعبيرا قويا عن CAR دون الحاجة إلى تركيز فيروسي من خلال الطرد المركزي الفائق أو الكواشف الإضافية. ومع ذلك ، .......

Disclosures

لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

نشكر L. Brockmann على المراجعة النقدية للمخطوطة. تم دعم هذا العمل من قبل NIH 1R01EB030352 و UL1 TR001873.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.45 μm filtersMilliporeSigmaSLHVR33RS
1 mL syringe Fisher Scientific 14-955-450
1.5 mL microcentrifuge tubes Fisher Scientific 05-408-135
10 mL syringe BD14-823-16E
100 μm strainerCorning07-201-432
15 cm TC treated cell culture dishesThermoFisher Scientific 130183
15 mL conical tubes Falcon14-959-70C
40 μm strainer Corning07-201-430
50 mL conical tubes Falcon14-959-49A
70 μm strainerCorning07-201-431
Attune NxT Flow Cytometer ThermoFisher Scientific 
BALB/C, 6-8 week old Jackson Laboratory651
B-Mercaptoethanol Gibco21985023
Bovine Serum Albumin GOLDBIOA-420-500
DMEM MediumGibco11965092
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), without Calcium and Magnesium Gibco14-190-250
DynaMag-2 Magnet Invitrogen12-321-D
EasySep Magnet Stemcell Technologies18000
EasySep Mouse T cell Isolation KitStemcell Technologies19851
FACS buffer BDBDB554657
Fetal bovine serum (FBS) CorningMT35011CV
GlutaMAXGibco35-050-061
G-Rex6Wilson Wolf80240M 
HEPES Buffer Solution Gibco15-630-080
Human recombinant IL-15 Miltenyi Biotec130-095-765
Human recombinant IL-2Miltenyi Biotec130-097-748
Human recombinant IL-7Miltenyi Biotec130-095-363
Lipofectamine 3000InvitrogenL3000008
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Gibco11140-050
Mouse Anti-CD3 BV421Biolegend100228
Mouse Anti-CD3/CD28 DynabeadsGibco11-453-D
Mouse Anti-CD4 BV605BD563151
Mouse Anti-CD44 APC Biolegend103011
Mouse Anti-CD62L PE-Cy7TonboSKU 60-0621-U025
Mouse Anti-CD8 APC-Cy7TonboSKU 25-0081-U025
Nikon Ti2 with Prime 95B camera Nikon
Non-treated 24 well plates CytoOneCC7672-7524
Opti-MEMGibco31-985-062
pCL-EcoAddgene#12371
Penicillin/Streptomycin SolutionGibco15-070-063
Phoenix Eco cellsATCCCRL-3214
pMDG.2Addgene#12259
pMSCV_PGK_GFP28zN/AProduced by R.LV.
Purified sfGFPN/AProduced by R.LV.
RetroNectin ('transduction reagent')Takara BioT100B
RPMI 1640Gibco21875
Serological pipette 10 mLFisher Scientific 13-678-11E
Serological pipette 25 mLFisher Scientific 13-678-11
Serological pipette 5 mLFisher Scientific 13-678-11D
Sodium PyruvateGibco11-360-070
TC-treated 24 well plates Corning08-772-1
Trypan blue Gibco15-250-061

References

  1. June, C. H., Sadelain, M. Chimeric antigen receptor therapy. N Engl J Med. 379 (1), 64-73 (2018).
  2. Duncan, B. B., Dunbar, C. E., Ishii, K. Applying a clinical lens to animal models of car-t cell therapies. Mol Ther Meth....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 204

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved