A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
يبسط هذا البروتوكول إنتاج النواقل الفيروسية القهقرية ونقل الخلايا التائية للفأر ، مما يسهل التوليد الفعال للخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية للفئران.
حققت العلاجات الخلوية المهندسة باستخدام مستقبلات المستضد الخيمري (CAR) -T فعالية ملحوظة في الأفراد المصابين بالأورام الخبيثة الدموية وتخضع حاليا للتطوير لعلاج الأورام الصلبة المتنوعة. حتى الآن ، تم إجراء التقييم الأولي لمنتجات الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية الجديدة في الغالب في نماذج ورم xenograft باستخدام الفئران التي تعاني من نقص المناعة. تم اختيار هذا النهج لتسهيل التطعيمات الناجحة للخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية البشرية في البيئة التجريبية. ومع ذلك ، فإن نماذج الفئران التخليقية ، التي تستمد فيها الأورام والخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية من نفس سلالة الفأر ، تسمح بتقييم تقنيات CAR الجديدة في سياق نظام المناعة الوظيفي والبيئة المكروية الشاملة للورم (TME). يهدف البروتوكول الموصوف هنا إلى تبسيط عملية توليد الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية في الفأر من خلال تقديم طرق موحدة لنقل الفيروسات القهقرية وزراعة الخلايا التائية خارج الجسم الحي . يمكن تطبيق الطرق الموضحة في هذا البروتوكول على تركيبات CAR الأخرى بخلاف تلك المستخدمة في هذه الدراسة لتمكين التقييم الروتيني لتقنيات CAR الجديدة في الأنظمة ذات الكفاءة المناعية.
أحدثت علاجات الخلايا التائية بالتبني التي تعبر عن مستقبلات المستضدات الخيمرية (CARs) ثورة في مجال العلاج المناعي للسرطان من خلال تسخير قوة جهاز المناعة التكيفي لاستهداف الخلايا السرطانية الإيجابية للمستضد والقضاء عليها على وجه التحديد1. في حين تم التحقق سريريا من صحة نجاح علاجات الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية التي تستهدف الأورام الخبيثة في الخلايا البائية ، تظل الدراسات قبل السريرية التي أجريت على النماذج الحيوانية حيوية لتطوير مستقبلات المستضدات الوهمية الجديدة التي تستهدف الأورام الصلبة. ومع ذلك ، فقد تم إثبات فعالية سريرية محدودة في مؤشرات الورم الصلب حتى الآن ، وأصبح من الواضح بشكل متزايد أن النماذج الف....
تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية بموافقة من اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام (جامعة كولومبيا ، بروتوكولات AC-AABQ5551 و AC-AAAZ4470) باستخدام إناث BALB / c البالغة من العمر 6-8 أسابيع أو CF57BL / 6 الفئران التي يتراوح وزنها بين 20-25 جم. تم الحصول على من مصدر تجاري (انظر جدول المواد). يتمحور هذا البروتوكول حول "أيام ما بعد التنشيط" للخلايا التائية الفئرانية ، ويبدأ الإنتاج الفيروسي في اليوم -2. يمكن تخزين الفيروس القهقري عند -80 درجة مئوية بعد الإنتاج الأولي ، وللاستخدام المستقبلي لهذا البروتوكول ، يمكن للمرء أن يبدأ بالخطوة 2 ، عزل الخلايا التائية وتنشيطها في اليوم 0.
1. إنتاج ناقلات الفيروسات القهقرية
<....يهدف البروتوكول الموصوف هنا إلى توحيد عملية نقل الخلايا التائية للفأر لتوليد خلايا CAR-T للفأر. ويقدم الشكل 1 وصفا مفصلا للخطوات المعنية. تبدأ العملية بإنتاج ناقلات الفيروسات القهقرية عن طريق النقل المشترك للمكونات الفيروسية إلى خلايا Phoenix Eco. يقدم الشكل 2
يصف هذا البروتوكول الخطوات والكواشف اللازمة لنقل الفيروسات القهقرية للخلايا التائية الفئرانية لتوليد خلايا CAR-T للدراسات في الجسم الحي . إن تحسين ظروف نقل الفيروسات القهقرية يحقق تعبيرا قويا عن CAR دون الحاجة إلى تركيز فيروسي من خلال الطرد المركزي الفائق أو الكواشف الإضافية. ومع ذلك ، .......
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
نشكر L. Brockmann على المراجعة النقدية للمخطوطة. تم دعم هذا العمل من قبل NIH 1R01EB030352 و UL1 TR001873.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.45 μm filters | MilliporeSigma | SLHVR33RS | |
1 mL syringe | Fisher Scientific | 14-955-450 | |
1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-135 | |
10 mL syringe | BD | 14-823-16E | |
100 μm strainer | Corning | 07-201-432 | |
15 cm TC treated cell culture dishes | ThermoFisher Scientific | 130183 | |
15 mL conical tubes | Falcon | 14-959-70C | |
40 μm strainer | Corning | 07-201-430 | |
50 mL conical tubes | Falcon | 14-959-49A | |
70 μm strainer | Corning | 07-201-431 | |
Attune NxT Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | ||
BALB/C, 6-8 week old | Jackson Laboratory | 651 | |
B-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
Bovine Serum Albumin | GOLDBIO | A-420-500 | |
DMEM Medium | Gibco | 11965092 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), without Calcium and Magnesium | Gibco | 14-190-250 | |
DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 12-321-D | |
EasySep Magnet | Stemcell Technologies | 18000 | |
EasySep Mouse T cell Isolation Kit | Stemcell Technologies | 19851 | |
FACS buffer | BD | BDB554657 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Corning | MT35011CV | |
GlutaMAX | Gibco | 35-050-061 | |
G-Rex6 | Wilson Wolf | 80240M | |
HEPES Buffer Solution | Gibco | 15-630-080 | |
Human recombinant IL-15 | Miltenyi Biotec | 130-095-765 | |
Human recombinant IL-2 | Miltenyi Biotec | 130-097-748 | |
Human recombinant IL-7 | Miltenyi Biotec | 130-095-363 | |
Lipofectamine 3000 | Invitrogen | L3000008 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140-050 | |
Mouse Anti-CD3 BV421 | Biolegend | 100228 | |
Mouse Anti-CD3/CD28 Dynabeads | Gibco | 11-453-D | |
Mouse Anti-CD4 BV605 | BD | 563151 | |
Mouse Anti-CD44 APC | Biolegend | 103011 | |
Mouse Anti-CD62L PE-Cy7 | Tonbo | SKU 60-0621-U025 | |
Mouse Anti-CD8 APC-Cy7 | Tonbo | SKU 25-0081-U025 | |
Nikon Ti2 with Prime 95B camera | Nikon | ||
Non-treated 24 well plates | CytoOne | CC7672-7524 | |
Opti-MEM | Gibco | 31-985-062 | |
pCL-Eco | Addgene | #12371 | |
Penicillin/Streptomycin Solution | Gibco | 15-070-063 | |
Phoenix Eco cells | ATCC | CRL-3214 | |
pMDG.2 | Addgene | #12259 | |
pMSCV_PGK_GFP28z | N/A | Produced by R.LV. | |
Purified sfGFP | N/A | Produced by R.LV. | |
RetroNectin ('transduction reagent') | Takara Bio | T100B | |
RPMI 1640 | Gibco | 21875 | |
Serological pipette 10 mL | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
Serological pipette 25 mL | Fisher Scientific | 13-678-11 | |
Serological pipette 5 mL | Fisher Scientific | 13-678-11D | |
Sodium Pyruvate | Gibco | 11-360-070 | |
TC-treated 24 well plates | Corning | 08-772-1 | |
Trypan blue | Gibco | 15-250-061 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved