Generación eficiente de células T con receptor de antígeno quimérico (CAR) murino

Resumen

Este protocolo agiliza la producción de vectores retrovirales y la transducción de células T murinas, lo que facilita la generación eficiente de células CAR-T de ratón.

Resumen

Las terapias celulares diseñadas que utilizan células T receptoras de antígenos quiméricos (CAR) han logrado una eficacia notable en individuos con neoplasias malignas hematológicas y actualmente están en desarrollo para el tratamiento de diversos tumores sólidos. Hasta ahora, la evaluación preliminar de nuevos productos de células CAR-T se ha llevado a cabo predominantemente en modelos tumorales de xenoinjertos utilizando ratones inmunodeficientes. Este enfoque se elige para facilitar el injerto exitoso de células CAR-T humanas en el entorno experimental. Sin embargo, los modelos de ratón singénicos, en los que los tumores y las células CAR-T se derivan de la misma cepa de ratón, permiten evaluar nuevas tecnologías de CAR en el contexto de un sistema inmunitario funcional y un microambiente tumoral integral (TME). El protocolo descrito aquí tiene como objetivo agilizar el proceso de generación de células CAR-T de ratón mediante la presentación de métodos estandarizados para la transducción retroviral y el cultivo ex vivo de células T. Los métodos descritos en este protocolo se pueden aplicar a otras construcciones de CAR más allá de las utilizadas en este estudio para permitir la evaluación rutinaria de nuevas tecnologías de CAR en sistemas inmunocompetentes.

Introducción

Las terapias adoptivas de células T que expresan receptores de antígenos quiméricos (CAR) han revolucionado el campo de la inmunoterapia contra el cáncer al aprovechar el poder del sistema inmunitario adaptativo para atacar y eliminar específicamente las células cancerosas con antígeno positivo¹. Si bien el éxito de las terapias de células CAR-T dirigidas a las neoplasias malignas de células B ha sido validado clínicamente, los estudios preclínicos realizados en modelos animales siguen siendo vitales para el desarrollo de nuevos CAR dirigidos a tumores sólidos. Sin embargo, hasta el momento se ha demostrado una eficacia clínica limitada en las indicaciones de tumores sólidos, y cada vez es más evidente que los modelos preclínicos individuales no predicen con precisión la farmacodinámica y la eficacia clínica de un medicamento vivo ^2,3. Por lo tanto, los investigadores han comenzado a ampliar el estudio preclínico de los productos de células CAR-T para incluir evaluaciones paralelas en modelos de xenoinjertos y singénicos de cánceres humanos y murinos, respectivamente.

A diferencia de los modelos de xenoinjertos, en los que los tumores humanos y las células T se injertan en ratones inmunodeficientes, los modelos singénicos permiten examinar las respuestas de las células CAR-T en el contexto de un sistema inmunitario funcional. Específicamente, los ratones inmunocompetentes portadores de tumores singénicos proporcionan un sistema para estudiar la interacción entre las células T transferidas adoptivamente y los entornos específicos del contexto, incluidos los macrófagos asociados al tumor (TAM) y las células T reguladoras (Treg) que se sabe que suprimen la función de las células T en el microambiente tumoral (TME)^4,5,6. Además, los modelos singénicos ofrecen una plataforma adicional para evaluar la toxicidad en el objetivo, fuera del tumor y la interacción de las células CAR-T con los factores del huésped que pueden conducir a toxicidades adicionales, incluido el síndrome de liberación de citocinas⁷.

A pesar de estas ventajas, el número de estudios de células CAR-T singénicas sigue siendo limitado. En particular, los modelos singénicos requieren ingeniería autóloga de células CAR-T de la misma cepa de ratón y, por lo tanto, presentan un desafío adicional debido a la falta de metodología para la transducción eficiente de células T murinas y la expansión ex vivo ^2,8. Este protocolo describe los métodos para lograr una expresión estable de CAR a través de la producción de vectores retrovirales y la transducción optimizada de células T. En la Figura 1 se muestra un esquema de todo el proceso. El uso de este enfoque demuestra la transducción retroviral eficiente de células CAR-T murinas y el logro de una alta expresión de CAR sin la necesidad de concentración viral a través de la ultracentrifugación. Se discuten estrategias para cambiar la especificidad antigénica de la construcción CAR, además de la coexpresión de transgenes adicionales.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales se realizaron con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (Universidad de Columbia, protocolos AC-AABQ5551 y AC-AAAZ4470) utilizando ratones hembras BALB/c o CF57BL/6 de 6-8 semanas de edad con un peso de entre 20-25 g. Los animales se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales). Este protocolo se estructura en torno a los "días posteriores a la activación" de las células T murinas, y la producción viral comienza en el día -2. El retrovirus puede almacenarse a -80 °C después de la producción inicial, y para el uso futuro de este protocolo, se puede comenzar con el paso 2, aislamiento y activación de células T en el día 0.

1. Producción de vectores retrovirales

NOTA: Los productos virales se han convertido en replicación defectuosa mediante la separación de los genes de empaquetamiento en dos plásmidos separados (ver Tabla de Materiales), lo que reduce en gran medida la probabilidad de eventos de recombinación y la producción inadvertida de virus competentes para la replicación.

1. Prepare las celdas Phoenix Eco un día antes de la transfección (procedimiento del día -2).
   1. Colocar aproximadamente 1 x 10⁷ células en una placa tratada con TC de 15 cm o en un matraz de cultivo T150, utilizando 30 ml de medio de cultivo (medio de cultivo Phoenix Eco, como se detalla en la Tabla 1).
   2. Incubar durante la noche a 37 °C. Después de 18-24 h, las células deben estar aproximadamente en un 70% confluentes y distribuidas uniformemente para garantizar un alto rendimiento viral sin crecimiento excesivo.
      NOTA: Para obtener resultados óptimos, use células con un paso bajo y páselas el día antes de la siembra para la producción viral. No permita que las células Phoenix Eco crezcan demasiado durante el cultivo de rutina.
2. Prepare la mezcla de transfección que contiene los reactivos de lipofección y potenciadores, pCL-Eco (Gag/Pol) y plásmido de expresión de pMSCV (pMSCV_PGK_mGFP28z) en medios de suero reducido (ver Tabla de Materiales) (procedimiento del Día -1).
   NOTA: La cotransfección debe realizarse en una proporción de 1:1 de pMSCV y pCL-Eco.
   1. Preparar el tubo A: Diluir 105 μl del reactivo de transfección en 3,75 ml de medio sérico reducido por placa de 15 cm y mezclar bien mediante vórtice o pipeteo hacia arriba y hacia abajo.
   2. Preparar el tubo B: Diluir el plásmido de expresión de pMSCV (21 μg) y pCL-Eco (21 μg) con 90 μL de reactivo potenciador en 3,75 mL de medio sérico reducido por placa de 15 cm. Mezclar bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
      NOTA: Si genera varios productos virales, configure una mezcla maestra que contenga pCL-Eco y el reactivo potenciador.
   3. Agregue el tubo A al tubo B y mezcle bien pipeteando. Incubar durante 10-20 min a temperatura ambiente, lo que da como resultado un volumen total de aproximadamente 7,5 mL.
   4. Retire con cuidado 10 ml de medios de cultivo celular de la(s) placa(s) Eco Phoenix y agregue todo el volumen de la mezcla de transfección a los medios restantes inclinando la placa y pipeteando gota a gota. Devolver las células a una incubadora a 37 °C.
3. Cambie el medio en las células Phoenix Eco transfectadas 16-20 h después de la transfección (procedimiento del día 0).
   1. Precalentar el suero y el medio de células T murinas libres de β-mercaptoetanol (2-ME, véase la Tabla de materiales) (cosecha viral de mTCM, como se indica en la Tabla 1) a 37 °C utilizando un baño de agua o perlas.
   2. Retire con cuidado el medio de cultivo Phoenix Eco inclinando la placa y colocando la punta de la pipeta en la esquina inferior, utilizando una aspiradora si es posible. Evite secar demasiado las celdas.
   3. Agregue suavemente el medio de cosecha mTCM-viral calentado al costado de la placa inclinada pipeteando 30 ml en la configuración más lenta. Devolver las células a una incubadora a 37 °C.
      NOTA: Este paso puede hacer que las células Phoenix Eco se desprendan de la placa y reduzcan los títulos virales. Los medios precalentados y el pipeteo suave minimizarán las interrupciones.
4. Cosechar el sobrenadante viral 48 h después de la transfección (procedimiento del día 1).
   1. Recolectar el sobrenadante viral y filtrarlo a través de filtros de PVDF de 0,45 μm (ver Tabla de materiales) para eliminar las células y los desechos. Alícuota y congele el virus a -80 °C o continúe directamente con el día 1 del paso 3 si usa virus nuevo.
   2. Determinar el título viral (unidades de transducción/mL) por citometría de flujo, como se describió anteriormente⁹. Este paso es opcional.
      1. Determinar el título viral mediante transducción a pequeña escala de 1 x 10⁵ células T murinas activadas en placas de 96 pocillos tratadas sin cultivo de tejidos (CT), prerrecubiertas con retronectina (ver Tabla de materiales) y cargadas con diluciones en serie triples de sobrenadante retroviral en un volumen final de 100 μL de medio de recolección viral mTCM.
         NOTA: Consulte los pasos 2 y 3 a continuación para obtener instrucciones detalladas sobre el aislamiento, la activación y la transducción de células T.
      2. Determinar la expresión de la superficie de CAR 4-5 días después de la transducción mediante citometría de flujo.
      3. Calcule el título viral de acuerdo con la fórmula¹⁰: (N x F x D)/V, donde N es el número de células transducidas, F es la frecuencia de células CAR-positivas, D es el factor de dilución y V es el volumen de transducción en mL para obtener unidades de transducción (TU)/mL.
         NOTA: El título viral puede disminuir al congelar/descongelar; Por lo tanto, el título viral se determina idealmente en virus congelados y posteriormente descongelados.

2. Aislamiento de células T murinas

1. Aislar y activar las células T murinas (procedimiento de día 0).
   NOTA: Estos pasos se pueden realizar a temperatura ambiente (RT) o 4 °C y deben llevarse a cabo en un ambiente estéril.
   1. Recolectar el (los) bazo(s) de la cepa de ratón de interés (p. ej., Balb/c, C57BL/6) como se describió anteriormente¹¹ y obtener una suspensión unicelular a través de la disociación mecánica.
   2. Con la parte posterior de una jeringa estéril, triture el bazo a través de un colador de células de 70-100 μm en un tubo cónico de 50 ml.
   3. Después de dejar la jeringa a un lado, lave el colador con 5 ml de tampón de aislamiento de células T (solución salina tamponada con fosfato, PBS, suplementada con suero fetal bovino al 2%, FBS).
   4. Repita el paso de maceración y lave el colador una vez más con 5 ml de tampón de aislamiento de células T. Lleve el volumen final a 50 ml con un tampón de aislamiento de células T.
   5. Cuente las células vivas con un hemocitómetro manual o un contador automático de células diluyendo en una proporción de 1:20 y luego mezclando a 1:1 con azul de tripán.
   6. Granular las células por centrifugación durante 10 min a 450 x g, a 4 °C (o RT), y volver a suspender los espleenocitos a 1 x 10⁸/mL si se utiliza el kit de aislamiento de linfocitos T recomendado (ver Tabla de materiales).
      NOTA: Los espleenocitos se pueden volver a tensar a través de un colador de 40-70 μm en esta etapa para eliminar los grumos.
2. Aísle las células T CD3⁺ por selección negativa siguiendo las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales). Después de la separación magnética, transfiera el aislado a un tubo cónico de 15 ml y realice un recuento final de células vivas.
3. Granular los linfocitos T aislados por centrifugación durante 10 min a 450 x g, a 4 °C (o RT), y volver a suspenderlos a 1 x 10⁶/mL en medio de activación mTCM (Tabla 1).
4. Activar los linfocitos T mediante la adición de perlas magnéticas recubiertas de anticuerpos monoclonales anti-CD3/anti-CD28 murinos (ver Tabla de materiales) en una proporción de 25 μL/1 x 10⁶ linfocitos T y 100 U/mL de IL-2.
5. Coloque las células en una incubadora a 37 °C y déjelas toda la noche.
   NOTA: Debido al pequeño tamaño de las células T, se puede lograr un recuento más preciso de células T vivas diluyendo en una proporción de 1:10-1:20 y mezclando a 1:1 con azul de tripano para el recuento manual con un hemocitómetro. La pureza puede determinarse mediante citometría de flujo tiñendo células con un anticuerpo αCD3 conjugado con fluorescencia. Cada bazo producirá entre 7-10 x 10⁶ células T, dependiendo de la edad y la cepa del ratón.

3. Transducción de células T murinas

1. Preparar las placas para la transducción (procedimiento del día 0).
   1. Recubrir previamente placas estériles de 24 pocillos no tratadas con 0,5 ml de reactivo potenciador de la transducción de fibronectina humana (véase la tabla de materiales) a una concentración final de 20-40 μg/ml diluyéndolas en PBS estériles y almacenarlas a 4 °C durante la noche.
      NOTA: Este paso también se puede realizar el día 1 recubriendo placas de 24 pocillos no tratadas con el reactivo de transducción e incubándolas a temperatura ambiente durante 2 h.
2. Realice la transducción de células T (procedimiento del día 1).
   1. Prepare la placa prerrevestida para la transducción. Retire el reactivo de transducción de cada pocillo de la placa de 24 pocillos prerrevestida y bloquee con un volumen equivalente de PBS filtrado estéril + albúmina sérica bovina (BSA) al 2% (0,5 ml) durante 30 min a RT.
   2. Lavar una vez con 0,5-1 ml de PBS.
3. Añadir 0,5-1 ml de retrovirus puro del paso 1 o diluido en función del título viral a cada pocillo prerrecubierto y centrifugar durante 90 min a 2.000 x g y 32 °C.
4. Añadir 1 ml de células T activadas a cada pocillo cargado de virus y centrifugar durante 10 min a 450 x g y 32 °C. Regrese las células a una incubadora a 37 °C durante la noche.
5. 24 h después de la transducción, retire 1-1,5 mL de medio de cultivo celular y reemplácelo con 1-1,5 mL de mTCM-completo y 10 ng/mL de IL-7 e IL-15 humanas recombinantes (ver Tabla de Materiales). Devolver las células a una incubadora a 37 °C (procedimiento del día 2).
   NOTA: Durante el cultivo ex vivo , se deben agregar 10 ng/mL de citocinas al cultivo cada 48 h, y las células T no deben diluirse más allá de 1 x 10⁶/mL.
6. 48 h después de la transducción, transfiera las células de la placa de transducción a una placa nueva de 24 o 6 pocillos y devuelva las células a una incubadora a 37 °C (procedimiento del día 3).
   NOTA: La viabilidad de las células T puede mejorar mediante la transferencia de células entre 24 h y 2 días después de la transducción, dependiendo de la viabilidad inicial de las células T y del título viral.
7. Retire las células T y confirme la expresión de CAR (procedimiento de los días 5-6).
   1. Vuelva a suspender completamente las células para disociar las células T activadas de las perlas recubiertas de αCD3/CD28 (consulte la Tabla de materiales) y coloque la suspensión celular en un imán durante 30 s. Transfiera la suspensión celular al recipiente de cultivo ex vivo deseado y devuélvala a una incubadora a 37 °C.
      NOTA: Las células T se pueden cultivar en matraces de cultivo o placas de cultivo de pocillos profundos. Se recomienda sembrar un mínimo de 5 x 10^{células T de 6} en 30 mL de medio mTCM-completo por pocillo en un pocillo profundo de una placa de formato de 6 pocillos (ver Tabla de Materiales).
   2. Determinar la expresión de CAR mediante citometría de flujo⁸.
      NOTA: La expresión de GFP-CAR se determinó mediante incubación con 100 ng/mL de GFP purificado. La incorporación de una etiqueta de epítopo N-terminal facilitará la detección de construcciones alternativas de CAR.
8. Realizar cultivo ex vivo de células CAR-T (procedimiento del día 7-10).
   1. Durante el cultivo ex vivo , mantener las células retirando el 50% del medio de cultivo y sustituyéndolo por mTCM completo + 2x 10 ng/ml de IL-7 e IL-15 cada 48 h.
      NOTA: Las células CAR-T murinas están listas para su uso en aplicaciones posteriores 7 días después de la activación y no deben criopreservarse debido a la mala viabilidad después de la descongelación.

Resultados

El protocolo descrito aquí tiene como objetivo estandarizar el proceso de transducción de células T murinas para la generación de células CAR-T de ratón. La Figura 1 proporciona una descripción detallada de los pasos involucrados. El proceso comienza con la producción de vectores retrovirales a través de la co-transfección de componentes virales en células Phoenix Eco. La Figura 2 proporciona una imagen de la densidad óptima de las células ...

Discusión

Este protocolo describe los pasos y reactivos necesarios para la transducción retroviral de células T murinas para generar células CAR-T para estudios in vivo . La optimización de las condiciones de transducción retroviral logra una expresión robusta de CAR sin la necesidad de concentración viral a través de ultracentrifugación o reactivos adicionales. Sin embargo, existen múltiples modificaciones que se pueden aplicar a esta metodología.

Si bien este protocolo describe el ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 μm filters	MilliporeSigma	SLHVR33RS
1 mL syringe	Fisher Scientific	14-955-450
1.5 mL microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-135
10 mL syringe	BD	14-823-16E
100 μm strainer	Corning	07-201-432
15 cm TC treated cell culture dishes	ThermoFisher Scientific	130183
15 mL conical tubes	Falcon	14-959-70C
40 μm strainer	Corning	07-201-430
50 mL conical tubes	Falcon	14-959-49A
70 μm strainer	Corning	07-201-431
Attune NxT Flow Cytometer	ThermoFisher Scientific
BALB/C, 6-8 week old	Jackson Laboratory	651
B-Mercaptoethanol	Gibco	21985023
Bovine Serum Albumin	GOLDBIO	A-420-500
DMEM Medium	Gibco	11965092
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), without Calcium and Magnesium	Gibco	14-190-250
DynaMag-2 Magnet	Invitrogen	12-321-D
EasySep Magnet	Stemcell Technologies	18000
EasySep Mouse T cell Isolation Kit	Stemcell Technologies	19851
FACS buffer	BD	BDB554657
Fetal bovine serum (FBS)	Corning	MT35011CV
GlutaMAX	Gibco	35-050-061
G-Rex6	Wilson Wolf	80240M
HEPES Buffer Solution	Gibco	15-630-080
Human recombinant IL-15	Miltenyi Biotec	130-095-765
Human recombinant IL-2	Miltenyi Biotec	130-097-748
Human recombinant IL-7	Miltenyi Biotec	130-095-363
Lipofectamine 3000	Invitrogen	L3000008
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140-050
Mouse Anti-CD3 BV421	Biolegend	100228
Mouse Anti-CD3/CD28 Dynabeads	Gibco	11-453-D
Mouse Anti-CD4 BV605	BD	563151
Mouse Anti-CD44 APC	Biolegend	103011
Mouse Anti-CD62L PE-Cy7	Tonbo	SKU 60-0621-U025
Mouse Anti-CD8 APC-Cy7	Tonbo	SKU 25-0081-U025
Nikon Ti2 with Prime 95B camera	Nikon
Non-treated 24 well plates	CytoOne	CC7672-7524
Opti-MEM	Gibco	31-985-062
pCL-Eco	Addgene	#12371
Penicillin/Streptomycin Solution	Gibco	15-070-063
Phoenix Eco cells	ATCC	CRL-3214
pMDG.2	Addgene	#12259
pMSCV_PGK_GFP28z	N/A	Produced by R.LV.
Purified sfGFP	N/A	Produced by R.LV.
RetroNectin ('transduction reagent')	Takara Bio	T100B
RPMI 1640	Gibco	21875
Serological pipette 10 mL	Fisher Scientific	13-678-11E
Serological pipette 25 mL	Fisher Scientific	13-678-11
Serological pipette 5 mL	Fisher Scientific	13-678-11D
Sodium Pyruvate	Gibco	11-360-070
TC-treated 24 well plates	Corning	08-772-1
Trypan blue	Gibco	15-250-061