Generación eficiente de células T con receptor de antígeno quimérico (CAR) murino

Resumen

Este protocolo agiliza la producción de vectores retrovirales y la transducción de células T murinas, lo que facilita la generación eficiente de células CAR-T de ratón.

Resumen

Las terapias celulares diseñadas que utilizan células T receptoras de antígenos quiméricos (CAR) han logrado una eficacia notable en individuos con neoplasias malignas hematológicas y actualmente están en desarrollo para el tratamiento de diversos tumores sólidos. Hasta ahora, la evaluación preliminar de nuevos productos de células CAR-T se ha llevado a cabo predominantemente en modelos tumorales de xenoinjertos utilizando ratones inmunodeficientes. Este enfoque se elige para facilitar el injerto exitoso de células CAR-T humanas en el entorno experimental. Sin embargo, los modelos de ratón singénicos, en los que los tumores y las células CAR-T se derivan de la misma cepa de ratón, permiten evaluar nuevas tecnologías de CAR en el contexto de un sistema inmunitario funcional y un microambiente tumoral integral (TME). El protocolo descrito aquí tiene como objetivo agilizar el proceso de generación de células CAR-T de ratón mediante la presentación de métodos estandarizados para la transducción retroviral y el cultivo ex vivo de células T. Los métodos descritos en este protocolo se pueden aplicar a otras construcciones de CAR más allá de las utilizadas en este estudio para permitir la evaluación rutinaria de nuevas tecnologías de CAR en sistemas inmunocompetentes.

Introducción

Las terapias adoptivas de células T que expresan receptores de antígenos quiméricos (CAR) han revolucionado el campo de la inmunoterapia contra el cáncer al aprovechar el poder del sistema inmunitario adaptativo para atacar y eliminar específicamente las células cancerosas con antígeno positivo¹. Si bien el éxito de las terapias de células CAR-T dirigidas a las neoplasias malignas de células B ha sido validado clínicamente, los estudios preclínicos realizados en modelos animales siguen siendo vitales para el desarrollo de nuevos CAR dirigidos a tumores sólidos. Sin embargo, hasta el momento se ha demostrado una eficacia cl....

Protocolo

Todos los procedimientos con animales se realizaron con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (Universidad de Columbia, protocolos AC-AABQ5551 y AC-AAAZ4470) utilizando ratones hembras BALB/c o CF57BL/6 de 6-8 semanas de edad con un peso de entre 20-25 g. Los animales se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales). Este protocolo se estructura en torno a los "días posteriores a la activación" de las células T murinas, y la producción viral comienza en el día -2. El retrovirus puede almacenarse a -80 °C después de la producción inicial, y para el uso futuro de este protocolo, se puede comenzar con el paso ....

Discusión

Este protocolo describe los pasos y reactivos necesarios para la transducción retroviral de células T murinas para generar células CAR-T para estudios in vivo . La optimización de las condiciones de transducción retroviral logra una expresión robusta de CAR sin la necesidad de concentración viral a través de ultracentrifugación o reactivos adicionales. Sin embargo, existen múltiples modificaciones que se pueden aplicar a esta metodología.

Si bien este protocolo describe el .......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 μm filters	MilliporeSigma	SLHVR33RS
1 mL syringe	Fisher Scientific	14-955-450
1.5 mL microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-135
10 mL syringe	BD	14-823-16E
100 μm strainer	Corning	07-201-432
15 cm TC treated cell culture dishes	ThermoFisher Scientific	130183
15 mL conical tubes	Falcon	14-959-70C
40 μm strainer	Corning	07-201-430
50 mL conical tubes	Falcon	14-959-49A
70 μm strainer	Corning	07-201-431
Attune NxT Flow Cytometer	ThermoFisher Scientific
BALB/C, 6-8 week old	Jackson Laboratory	651
B-Mercaptoethanol	Gibco	21985023
Bovine Serum Albumin	GOLDBIO	A-420-500
DMEM Medium	Gibco	11965092
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), without Calcium and Magnesium	Gibco	14-190-250
DynaMag-2 Magnet	Invitrogen	12-321-D
EasySep Magnet	Stemcell Technologies	18000
EasySep Mouse T cell Isolation Kit	Stemcell Technologies	19851
FACS buffer	BD	BDB554657
Fetal bovine serum (FBS)	Corning	MT35011CV
GlutaMAX	Gibco	35-050-061
G-Rex6	Wilson Wolf	80240M
HEPES Buffer Solution	Gibco	15-630-080
Human recombinant IL-15	Miltenyi Biotec	130-095-765
Human recombinant IL-2	Miltenyi Biotec	130-097-748
Human recombinant IL-7	Miltenyi Biotec	130-095-363
Lipofectamine 3000	Invitrogen	L3000008
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140-050
Mouse Anti-CD3 BV421	Biolegend	100228
Mouse Anti-CD3/CD28 Dynabeads	Gibco	11-453-D
Mouse Anti-CD4 BV605	BD	563151
Mouse Anti-CD44 APC	Biolegend	103011
Mouse Anti-CD62L PE-Cy7	Tonbo	SKU 60-0621-U025
Mouse Anti-CD8 APC-Cy7	Tonbo	SKU 25-0081-U025
Nikon Ti2 with Prime 95B camera	Nikon
Non-treated 24 well plates	CytoOne	CC7672-7524
Opti-MEM	Gibco	31-985-062
pCL-Eco	Addgene	#12371
Penicillin/Streptomycin Solution	Gibco	15-070-063
Phoenix Eco cells	ATCC	CRL-3214
pMDG.2	Addgene	#12259
pMSCV_PGK_GFP28z	N/A	Produced by R.LV.
Purified sfGFP	N/A	Produced by R.LV.
RetroNectin ('transduction reagent')	Takara Bio	T100B
RPMI 1640	Gibco	21875
Serological pipette 10 mL	Fisher Scientific	13-678-11E
Serological pipette 25 mL	Fisher Scientific	13-678-11
Serological pipette 5 mL	Fisher Scientific	13-678-11D
Sodium Pyruvate	Gibco	11-360-070
TC-treated 24 well plates	Corning	08-772-1
Trypan blue	Gibco	15-250-061