Murine Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T cell의 효율적인 생성

요약

이 프로토콜은 레트로바이러스 벡터 생산과 쥐 T 세포 transduction을 간소화하여 마우스 CAR-T 세포의 효율적인 생성을 촉진합니다.

초록

키메라 항원 수용체(CAR)-T 세포를 활용한 조작된 세포 치료제는 혈액 악성 종양 환자에게 놀라운 효과를 보였으며 현재 다양한 고형 종양 치료를 위한 개발이 진행 중입니다. 지금까지 새로운 CAR-T 세포 산물의 예비 평가는 주로 면역 결핍 마우스를 사용한 이종 이식 종양 모델에서 이루어졌습니다. 이 접근법은 실험 환경에서 인간 CAR-T 세포의 성공적인 생착을 촉진하기 위해 선택되었습니다. 그러나 종양과 CAR-T 세포가 동일한 마우스 균주에서 파생된 합성 마우스 모델을 사용하면 기능적 면역 체계 및 포괄적인 종양 미세환경(TME)의 맥락에서 새로운 CAR 기술을 평가할 수 있습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 레트로바이러스 형질도입 및 체외 T 세포 배양을 위한 표준화된 방법을 제시하여 마우스 CAR-T 세포 생성 과정을 간소화하는 것을 목표로 합니다. 이 프로토콜에 설명된 방법은 면역 능력 시스템에서 새로운 CAR 기술의 일상적인 평가를 가능하게 하기 위해 이 연구에서 사용된 것 이외의 다른 CAR 구조에도 적용할 수 있습니다.

서문

키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 입양 T 세포 치료제는 적응 면역 체계의 힘을 활용하여 항원 양성 암세포를 특이적으로 표적으로 삼고 제거함으로써 암 면역 요법 분야에 혁명을 일으켰습니다¹. B세포 악성종양을 표적으로 하는 CAR-T 세포 치료제의 성공은 임상적으로 검증되었지만, 동물 모델에서 수행된 전임상 연구는 고형 종양을 표적으로 하는 새로운 CAR의 개발에 여전히 중요합니다. 그러나 지금까지 고형 종양 적응증에서 제한적인 임상적 효능이 입증되었으며, 개별 전임상 모델이 살아있는 의약품의 약력학 및 임상적 효능을 정확하게 예측하지 못한다는 것이 점점 더 분명해지고 있습니다 ^2,3. 따라서 연구자들은 CAR-T 세포 제품의 전임상 연구를 확대하여 인간 및 쥐 암의 이종이식 및 합성 유전자 모델에서 각각 병행 평가를 포함하기 시작했습니다.

인간 종양과 T 세포를 면역 결핍 마우스에 생착하는 이종이식 모델과 달리, 합성 유전자 모델은 기능적 면역 체계의 맥락에서 CAR-T 세포 반응을 검사할 수 있습니다. 특히, 합성 종양을 보유한 면역 유능한 마우스는....

프로토콜

모든 동물 시술은 20-25g의 6-8주 된 암컷 BALB/c 또는 CF57BL/6 마우스를 사용하여 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Columbia University, 프로토콜 AC-AABQ5551 및 AC-AAAZ4470)의 승인을 받아 수행되었습니다. 동물은 상업적 출처에서 얻었다( 자료표 참조). 이 프로토콜은 쥐 T 세포의 '활성화 후 며칠'을 중심으로 구성되며, 바이러스 생산은 -2일째에 시작됩니다. 레트로바이러스는 초기 생산 후 -80°C에서 보관할 수 있으며, 이 프로토콜의 향후 사용을 위해 2단계, T 세포 분리 및 0일째 활성화로 시작할 수 있습니다.

1. 레트로바이러스 벡터 생산

참고: 바이러스 산물은 패키징 유전자를 두 개의 개별 플라스미드로 분리하여 복제 결함을 만들었으며( 재료 표 참조), 재조합 이벤트 및 복제 가능 바이러스의 우발적인 생산 가능성을 크게 줄였습니다.

1. transfection(-2일차 절차) 하루 전에 Phoenix Eco 세포를 준비합니다.
   1. 30mL의 배양 배지(표 1에 자세히 설명된 Phoenix ....

토론

이 프로토콜은 생체 내 연구를 위한 CAR-T 세포를 생성하기 위해 쥐 T 세포의 레트로바이러스 형질도입에 필요한 단계와 시약을 설명합니다. 레트로바이러스 형질도입 조건을 최적화하면 초원심분리 또는 추가 시약을 통해 바이러스 농도를 높일 필요 없이 강력한 CAR 발현을 달성할 수 있습니다. 그러나 이 방법론에 적용할 수 있는 여러 수정 사항이 있습니다.

이 프로토?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 μm filters	MilliporeSigma	SLHVR33RS
1 mL syringe	Fisher Scientific	14-955-450
1.5 mL microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-135
10 mL syringe	BD	14-823-16E
100 μm strainer	Corning	07-201-432
15 cm TC treated cell culture dishes	ThermoFisher Scientific	130183
15 mL conical tubes	Falcon	14-959-70C
40 μm strainer	Corning	07-201-430
50 mL conical tubes	Falcon	14-959-49A
70 μm strainer	Corning	07-201-431
Attune NxT Flow Cytometer	ThermoFisher Scientific
BALB/C, 6-8 week old	Jackson Laboratory	651
B-Mercaptoethanol	Gibco	21985023
Bovine Serum Albumin	GOLDBIO	A-420-500
DMEM Medium	Gibco	11965092
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), without Calcium and Magnesium	Gibco	14-190-250
DynaMag-2 Magnet	Invitrogen	12-321-D
EasySep Magnet	Stemcell Technologies	18000
EasySep Mouse T cell Isolation Kit	Stemcell Technologies	19851
FACS buffer	BD	BDB554657
Fetal bovine serum (FBS)	Corning	MT35011CV
GlutaMAX	Gibco	35-050-061
G-Rex6	Wilson Wolf	80240M
HEPES Buffer Solution	Gibco	15-630-080
Human recombinant IL-15	Miltenyi Biotec	130-095-765
Human recombinant IL-2	Miltenyi Biotec	130-097-748
Human recombinant IL-7	Miltenyi Biotec	130-095-363
Lipofectamine 3000	Invitrogen	L3000008
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140-050
Mouse Anti-CD3 BV421	Biolegend	100228
Mouse Anti-CD3/CD28 Dynabeads	Gibco	11-453-D
Mouse Anti-CD4 BV605	BD	563151
Mouse Anti-CD44 APC	Biolegend	103011
Mouse Anti-CD62L PE-Cy7	Tonbo	SKU 60-0621-U025
Mouse Anti-CD8 APC-Cy7	Tonbo	SKU 25-0081-U025
Nikon Ti2 with Prime 95B camera	Nikon
Non-treated 24 well plates	CytoOne	CC7672-7524
Opti-MEM	Gibco	31-985-062
pCL-Eco	Addgene	#12371
Penicillin/Streptomycin Solution	Gibco	15-070-063
Phoenix Eco cells	ATCC	CRL-3214
pMDG.2	Addgene	#12259
pMSCV_PGK_GFP28z	N/A	Produced by R.LV.
Purified sfGFP	N/A	Produced by R.LV.
RetroNectin ('transduction reagent')	Takara Bio	T100B
RPMI 1640	Gibco	21875
Serological pipette 10 mL	Fisher Scientific	13-678-11E
Serological pipette 25 mL	Fisher Scientific	13-678-11
Serological pipette 5 mL	Fisher Scientific	13-678-11D
Sodium Pyruvate	Gibco	11-360-070
TC-treated 24 well plates	Corning	08-772-1
Trypan blue	Gibco	15-250-061