Génération efficace de lymphocytes T à récepteur antigénique chimérique (CAR) murin

Résumé

Ce protocole rationalise la production de vecteurs rétroviraux et la transduction des lymphocytes T murins, facilitant ainsi la génération efficace de cellules CAR-T chez la souris.

Résumé

Les thérapies cellulaires modifiées utilisant des cellules T à récepteur antigénique chimérique (CAR)-T ont atteint une efficacité remarquable chez les personnes atteintes d’hémopathies malignes et sont actuellement en cours de développement pour le traitement de diverses tumeurs solides. Jusqu’à présent, l’évaluation préliminaire de nouveaux produits cellulaires CAR-T a principalement eu lieu dans des modèles tumoraux de xénogreffe utilisant des souris immunodéficientes. Cette approche est choisie pour faciliter la prise de greffe réussie de cellules CAR-T humaines dans le cadre expérimental. Cependant, les modèles murins syngéniques, dans lesquels les tumeurs et les cellules CAR-T sont dérivées de la même souche de souris, permettent d’évaluer les nouvelles technologies CAR dans le contexte d’un système immunitaire fonctionnel et d’un microenvironnement tumoral complet (TME). Le protocole décrit ici vise à rationaliser le processus de génération de cellules CAR-T chez la souris en présentant des méthodes standardisées pour la transduction rétrovirale et la culture ex vivo de cellules T. Les méthodes décrites dans ce protocole peuvent être appliquées à d’autres constructions de CAR au-delà de celles utilisées dans cette étude pour permettre l’évaluation de routine de nouvelles technologies de CAR dans les systèmes immunocompétents.

Introduction

Les thérapies adoptives à base de lymphocytes T exprimant des récepteurs antigéniques chimériques (CAR) ont révolutionné le domaine de l’immunothérapie du cancer en exploitant la puissance du système immunitaire adaptatif pour cibler et éliminer spécifiquement les cellules cancéreuses antigéniques positives¹. Bien que le succès des thérapies cellulaires CAR-T ciblant les tumeurs malignes à cellules B ait été validé cliniquement, les études précliniques réalisées sur des modèles animaux restent vitales pour le développement de nouvelles thérapies CAR-T ciblant les tumeurs solides. Cependant, une efficacité clinique limitée a été démontrée jusqu’à présent dans les indications de tumeurs solides, et il devient de plus en plus évident que les modèles précliniques individuels ne prédisent pas avec précision la pharmacodynamie et l’efficacité clinique d’un médicament vivant ^2,3. Par conséquent, les chercheurs ont commencé à élargir l’étude préclinique des produits cellulaires CAR-T pour inclure des évaluations parallèles dans des modèles xénogreffiques et syngéniques de cancers humains et murins, respectivement.

Contrairement aux modèles de xénogreffe, où les tumeurs humaines et les lymphocytes T sont greffés dans des souris immunodéficientes, les modèles syngéniques permettent d’examiner les réponses des cellules CAR-T dans le contexte d’un système immunitaire fonctionnel. Plus précisément, les souris immunocompétentes porteuses de tumeurs syngéniques fournissent un système permettant d’étudier l’interaction entre les lymphocytes T transférés par adoption et les milieux spécifiques au contexte, y compris les macrophages associés aux tumeurs (TAM) et les lymphocytes T régulateurs (Tregs) connus pour supprimer la fonction des lymphocytes T dans le microenvironnement tumoral (ETM4,5,6). De plus, les modèles syngéniques offrent une plate-forme supplémentaire pour évaluer la toxicité sur cible, hors tumeur, et l’interaction des cellules CAR-T avec les facteurs de l’hôte qui peuvent conduire à des toxicités supplémentaires, y compris le syndrome de libération de cytokines⁷.

Malgré ces avantages, le nombre d’études sur les cellules CAR-T syngéniques reste limité. Notamment, les modèles syngéniques nécessitent l’ingénierie autologue de cellules CAR-T de la même souche de souris et présentent donc un défi supplémentaire en raison de l’absence de méthodologie pour une transduction efficace des cellules T murines et une expansion ex vivo ^2,8. Ce protocole décrit les méthodes permettant d’obtenir une expression stable de CAR grâce à la production de vecteurs rétroviraux et à l’optimisation de la transduction des lymphocytes T. Un schéma de l’ensemble du processus est présenté à la figure 1. L’utilisation de cette approche démontre l’efficacité de la transduction rétrovirale des cellules CAR-T murines et l’obtention d’une expression élevée de CAR sans avoir besoin d’une concentration virale par ultracentrifugation. Des stratégies visant à modifier la spécificité antigénique de la construction CAR sont discutées en plus de la co-expression de transgènes supplémentaires.

Protocole

Toutes les procédures animales ont été effectuées avec l’approbation de l’Institutional Animal Care and Use Committee (Université Columbia, protocoles AC-AABQ5551 et AC-AAAZ4470) en utilisant des souris femelles BALB/c ou CF57BL/6 âgées de 6 à 8 semaines pesant entre 20 et 25 g. Les animaux ont été obtenus auprès d’une source commerciale (voir le tableau des matériaux). Ce protocole est structuré autour des « jours post-activation » des lymphocytes T murins, et la production virale commence au jour -2. Le rétrovirus peut être stocké à -80 °C après la production initiale, et pour une utilisation future de ce protocole, on peut commencer par l’étape 2, l’isolement et l’activation des lymphocytes T au jour 0.

1. Production de vecteurs rétroviraux

NOTA : Les produits viraux ont été rendus défectueux en raison de la séparation des gènes d’emballage en deux plasmides distincts (voir le tableau des matériaux), ce qui réduit considérablement la probabilité d’événements de recombinaison et de production accidentelle de virus compétents pour la réplication.

1. Préparez les cellules Phoenix Eco un jour avant la transfection (procédure du jour -2).
   1. Plaquer environ 1 x 10⁷ cellules dans une plaque de 15 cm traitée au TC ou dans un flacon de culture T150, en utilisant 30 mL de milieu de culture (milieu de culture Phoenix Eco, tel qu’indiqué dans le tableau 1).
   2. Incuber toute la nuit à 37 °C. Après 18 à 24 h, les cellules doivent être confluentes à environ 70 % et réparties uniformément pour assurer un rendement viral élevé sans prolifération.
      REMARQUE : Pour des résultats optimaux, utilisez des cellules à passage bas et faites-les passer la veille du placage pour la production virale. Ne laissez pas les cellules Phoenix Eco proliférer pendant la culture de routine.
2. Préparer le mélange de transfection contenant les réactifs de lipofection et d’activation, le pCL-Eco (Gag/Pol) et le plasmide d’expression de pMSCV (pMSCV_PGK_mGFP28z) dans un milieu sérique réduit (voir le tableau des matériaux) (procédure du jour -1).
   REMARQUE : La co-transfection doit être effectuée dans un rapport de 1 :1 entre pMSCV et pCL-Eco.
   1. Préparer le tube A : Diluer 105 μL du réactif de transfection dans 3,75 mL de milieu sérique réduit par plaque de 15 cm et bien mélanger par vortex ou pipetage de haut en bas.
   2. Préparer le tube B : Diluer le plasmide d’expression du pMSCV (21 μg) et le pCL-Eco (21 μg) avec 90 μL de réactif activateur dans 3,75 mL de milieu sérique réduit par plaque de 15 cm. Bien mélanger en pipetant de haut en bas.
      REMARQUE : Si vous générez plusieurs produits viraux, mettez en place un mélange maître contenant pCL-Eco et le réactif enhancer.
   3. Ajouter le tube A au tube B et bien mélanger par pipetage. Incuber pendant 10 à 20 minutes à température ambiante, ce qui donne un volume total d’environ 7,5 ml.
   4. Retirez délicatement 10 mL de milieux de culture cellulaire de la ou des plaques Phoenix Eco et ajoutez tout le volume du mélange de transfection au milieu restant en inclinant la plaque et en pipetant goutte. Remettre les cellules dans un incubateur à 37 °C.
3. Changer le milieu sur les cellules Phoenix Eco transfectées 16 à 20 h après la transfection (procédure du jour 0).
   1. Préchauffer le sérum et le milieu de lymphocytes T murins exempts de β-mercaptoéthanol (2-ME, voir le tableau des matériaux) (récolte virale mTCM, comme indiqué dans le tableau 1) à 37 °C à l’aide d’un bain d’eau ou de billes.
   2. Retirez délicatement le milieu de culture Phoenix Eco en inclinant la plaque et en plaçant l’embout de la pipette dans le coin inférieur, si possible à l’aide d’un aspirateur. Évitez de trop sécher les cellules.
   3. Ajouter délicatement le milieu de prélèvement mTCM-viral réchauffé sur le côté de la plaque inclinée en pipetant 30 ml au réglage le plus lent. Remettre les cellules dans un incubateur à 37 °C.
      REMARQUE : Cette étape peut provoquer le détachement des cellules Phoenix Eco de la plaque et réduire les titres viraux. Un milieu préchauffé et un pipetage doux minimiseront les perturbations.
4. Prélever le surnageant viral 48 h après la transfection (procédure du jour 1).
   1. Récoltez le surnageant viral et filtrez-le à travers des filtres PVDF de 0,45 μm (voir le tableau des matériaux) pour éliminer les cellules et les débris. Aliquote et congeler le virus à -80 °C ou passer directement au jour 1 de l’étape 3 si vous utilisez un nouveau virus.
   2. Déterminer le titre viral (unités transductrices/mL) par cytométrie en flux, comme décrit précédemment⁹. Cette étape est facultative.
      1. Déterminer le titre viral par transduction à petite échelle de 1 x 10⁵ lymphocytes T murins activés dans des plaques à 96 puits non traitées par culture tissulaire (TC), pré-enrobées de rétronectine (voir le tableau des matériaux) et chargées de trois dilutions en série de surnageant rétroviral dans un volume final de 100 μL de milieu de récolte mTCM-viral.
         REMARQUE : Voir les étapes 2 et 3 ci-dessous pour des instructions détaillées sur l’isolement, l’activation et la transduction des lymphocytes T.
      2. Déterminer l’expression de surface du CAR 4 à 5 jours après la transduction par cytométrie en flux.
      3. Calculer le titre viral selon la formule¹⁰ : (N x F x D)/V, où N est le nombre de cellules transduites, F est la fréquence des cellules CAR-positives, D est le facteur de dilution et V est le volume de transduction en mL pour obtenir des unités de transduction (TU)/mL.
         REMARQUE : Le titre viral peut diminuer lors de la congélation ou de la décongélation ; Par conséquent, le titre viral est idéalement déterminé sur le virus congelé puis décongelé.

2. Isolement des lymphocytes T murins

1. Isolez et activez les lymphocytes T murins (procédure du jour 0).
   REMARQUE : Ces étapes peuvent être effectuées à température ambiante (RT) ou à 4 °C et doivent être effectuées dans un environnement stérile.
   1. Prélever la ou les rates de la souche de souris d’intérêt (p. ex., Balb/c, C57BL/6) comme décrit précédemment¹¹ et obtenir une suspension unicellulaire par dissociation mécanique.
   2. À l’aide de l’arrière d’une seringue stérile, écraser la rate à travers une crépine de 70 à 100 μm dans un tube conique de 50 ml.
   3. Après avoir mis la seringue de côté, laver la passoire avec 5 mL de tampon d’isolement des lymphocytes T (solution saline tamponnée au phosphate, PBS, complétée par du sérum de veau fœtal à 2 %).
   4. Répétez l’étape de brassage et lavez la passoire une fois de plus avec 5 mL de tampon d’isolement des lymphocytes T. Porter le volume final à 50 mL avec un tampon d’isolement des lymphocytes T.
   5. Comptez les cellules vivantes à l’aide d’un hémocytomètre manuel ou d’un compteur automatique de cellules en les diluant dans un rapport de 1 :20, puis en les mélangeant à 1 :1 avec du bleu de trypan.
   6. Granuler les cellules par centrifugation pendant 10 min à 450 x g, à 4 °C (ou RT), et remettre en suspension les spléenocytes à 1 x 10⁸/mL si vous utilisez le kit d’isolement des lymphocytes T recommandé (voir le tableau des matériaux).
      REMARQUE : Les spléenocytes peuvent être refilés à travers une crépine de 40 à 70 μm à ce stade pour éliminer les grumeaux.
2. Isolez les lymphocytes T CD3⁺ par sélection négative en suivant les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux). Après la séparation magnétique, transférez l’isolat dans un tube conique de 15 mL et effectuez une numération finale des cellules vivantes.
3. Pelleter les lymphocytes T isolés par centrifugation pendant 10 min à 450 x g, à 4 °C (ou RT), et les remettre en suspension à 1 x 10⁶/mL dans un milieu d’activation mTCM (Tableau 1).
4. Activer les lymphocytes T en ajoutant des billes magnétiques monoclonales enrobées d’anticorps murins anti-CD3/anti-CD28 (voir le tableau des matériaux) dans un rapport de 25 μL/1 x 10 cellules T⁶ et de 100 U/mL d’IL-2.
5. Placez les cellules dans un incubateur à 37 °C et laissez-les toute la nuit.
   REMARQUE : En raison de la petite taille des lymphocytes T, une numération des lymphocytes T vivants plus précise peut être obtenue en diluant dans un rapport de 1 :10-1 :20 et en mélangeant à 1 :1 avec du bleu de trypan pour le comptage manuel à l’aide d’un hémocytomètre. La pureté peut être déterminée par cytométrie en flux en colorant les cellules avec un anticorps αCD3 conjugué par fluorescence. Chaque rate produira entre 7 et 10 x 10 cellules T de⁶ en fonction de l’âge et de la souche de la souris.

3. Transduction des lymphocytes T murins

1. Préparer les plaques pour la transduction (procédure du jour 0).
   1. Enduire au préalable des plaques stériles non traitées à 24 puits avec 0,5 mL de réactif activateur de transduction de la fibronectine humaine (voir le tableau des matériaux) à une concentration finale de 20 à 40 μg/mL en les diluant dans du PBS stérile et les conserver à 4 °C pendant la nuit.
      REMARQUE : Cette étape peut également être effectuée le jour 1 en enduisant les plaques à 24 puits non traitées avec le réactif de transduction et en les incubant à température ambiante pendant 2 h.
2. Effectuer la transduction des lymphocytes T (procédure du jour 1).
   1. Préparez la plaque pré-enduite pour la transduction. Retirer le réactif de transduction de chaque puits de la plaque pré-enrobée à 24 puits et bloquer avec un volume équivalent de PBS filtré stérile + 2 % d’albumine sérique bovine (BSA) (0,5 ml) pendant 30 min à RT.
   2. Laver une fois avec 0,5 à 1 ml de PBS.
3. Ajouter 0,5 à 1 mL de rétrovirus pur de l’étape 1 ou dilué en fonction du titre viral dans chaque puits pré-enrobé et centrifuger pendant 90 min à 2 000 x g et 32 °C.
4. Ajouter 1 mL de lymphocytes T activés dans chaque puits chargé par le virus et centrifuger pendant 10 min à 450 x g et 32 °C. Remettre les cellules dans un incubateur à 37 °C pendant la nuit.
5. 24 h après la transduction, retirer 1 à 1,5 mL de milieu de culture cellulaire et le remplacer par 1 à 1,5 mL de mTCM-complet et 10 ng/mL d’IL-7 et d’IL-15 humaines recombinantes (voir le tableau des matériaux). Remettre les cellules dans un incubateur à 37 °C (procédure du jour 2).
   REMARQUE : Lors de la culture ex vivo , 10 ng/mL de cytokines doivent être ajoutés à la culture toutes les 48 h, et les lymphocytes T ne doivent pas être dilués au-delà de 1 x 10⁶/mL.
6. 48 h après la transduction, transférer les cellules de la plaque de transduction dans une nouvelle plaque à 24 ou 6 puits et remettre les cellules dans un incubateur à 37 °C (procédure du jour 3).
   REMARQUE : La viabilité des lymphocytes T peut s’améliorer en transférant les cellules 24 h à 2 jours après la transduction, en fonction de la viabilité initiale des lymphocytes T et du titre viral.
7. Dé-perlez les lymphocytes T et confirmez l’expression du CAR (procédure des jours 5 et 6).
   1. Remettre soigneusement les cellules en suspension pour dissocier les lymphocytes T activés des billes enrobées d’αCD3/CD28 (voir le tableau des matériaux) et placer la suspension cellulaire sur un aimant pendant 30 s. Transférez la suspension cellulaire dans le récipient de culture ex vivo souhaité et remettez-la dans un incubateur à 37 °C.
      REMARQUE : Les lymphocytes T peuvent être cultivés dans des flacons de culture ou des plaques de culture à puits profonds. Il est recommandé de plaquer un minimum de 5 x 10 cellules^{T de 6} dans 30 mL de milieu mTCM-complet par puits dans un puits profond d’une plaque de format 6 puits (voir le tableau des matériaux).
   2. Déterminer l’expression de CAR par cytométrie en flux⁸.
      NOTE : L’expression de GFP-CAR a été déterminée par incubation avec 100 ng/mL de GFP purifiée. L’incorporation d’un marqueur d’épitope N-terminal facilitera la détection de constructions CAR alternatives.
8. Effectuer une culture ex vivo de cellules CAR-T (procédure des jours 7 à 10).
   1. Lors de la culture ex vivo , maintenir les cellules en retirant 50 % du milieu de culture et en le remplaçant par du mTCM-complet frais + 2x 10 ng/mL d’IL-7 et d’IL-15 toutes les 48 h.
      REMARQUE : Les cellules CAR-T murines sont prêtes à être utilisées dans des applications en aval 7 jours après l’activation et ne doivent pas être cryoconservées en raison d’une mauvaise viabilité après la décongélation.

Résultats

Le protocole décrit ici vise à standardiser le processus de transduction des lymphocytes T murins pour la génération de cellules CAR-T de souris. La figure 1 fournit une description détaillée des étapes à suivre. Le processus commence par la production de vecteurs rétroviraux par co-transfection de composants viraux dans des cellules Phoenix Eco. La figure 2 fournit une image de la densité optimale des cellules Phoenix Eco le jour de la transf...

Discussion

Ce protocole décrit les étapes et les réactifs nécessaires à la transduction rétrovirale des lymphocytes T murins afin de générer des lymphocytes CAR-T pour des études in vivo . L’optimisation des conditions de transduction rétrovirale permet d’obtenir une expression robuste de la CAR sans avoir besoin d’une concentration virale par ultracentrifugation ou réactifs supplémentaires. Cependant, il existe de multiples modifications qui peuvent être appliquées à cette méthodologie.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 μm filters	MilliporeSigma	SLHVR33RS
1 mL syringe	Fisher Scientific	14-955-450
1.5 mL microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-135
10 mL syringe	BD	14-823-16E
100 μm strainer	Corning	07-201-432
15 cm TC treated cell culture dishes	ThermoFisher Scientific	130183
15 mL conical tubes	Falcon	14-959-70C
40 μm strainer	Corning	07-201-430
50 mL conical tubes	Falcon	14-959-49A
70 μm strainer	Corning	07-201-431
Attune NxT Flow Cytometer	ThermoFisher Scientific
BALB/C, 6-8 week old	Jackson Laboratory	651
B-Mercaptoethanol	Gibco	21985023
Bovine Serum Albumin	GOLDBIO	A-420-500
DMEM Medium	Gibco	11965092
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), without Calcium and Magnesium	Gibco	14-190-250
DynaMag-2 Magnet	Invitrogen	12-321-D
EasySep Magnet	Stemcell Technologies	18000
EasySep Mouse T cell Isolation Kit	Stemcell Technologies	19851
FACS buffer	BD	BDB554657
Fetal bovine serum (FBS)	Corning	MT35011CV
GlutaMAX	Gibco	35-050-061
G-Rex6	Wilson Wolf	80240M
HEPES Buffer Solution	Gibco	15-630-080
Human recombinant IL-15	Miltenyi Biotec	130-095-765
Human recombinant IL-2	Miltenyi Biotec	130-097-748
Human recombinant IL-7	Miltenyi Biotec	130-095-363
Lipofectamine 3000	Invitrogen	L3000008
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140-050
Mouse Anti-CD3 BV421	Biolegend	100228
Mouse Anti-CD3/CD28 Dynabeads	Gibco	11-453-D
Mouse Anti-CD4 BV605	BD	563151
Mouse Anti-CD44 APC	Biolegend	103011
Mouse Anti-CD62L PE-Cy7	Tonbo	SKU 60-0621-U025
Mouse Anti-CD8 APC-Cy7	Tonbo	SKU 25-0081-U025
Nikon Ti2 with Prime 95B camera	Nikon
Non-treated 24 well plates	CytoOne	CC7672-7524
Opti-MEM	Gibco	31-985-062
pCL-Eco	Addgene	#12371
Penicillin/Streptomycin Solution	Gibco	15-070-063
Phoenix Eco cells	ATCC	CRL-3214
pMDG.2	Addgene	#12259
pMSCV_PGK_GFP28z	N/A	Produced by R.LV.
Purified sfGFP	N/A	Produced by R.LV.
RetroNectin ('transduction reagent')	Takara Bio	T100B
RPMI 1640	Gibco	21875
Serological pipette 10 mL	Fisher Scientific	13-678-11E
Serological pipette 25 mL	Fisher Scientific	13-678-11
Serological pipette 5 mL	Fisher Scientific	13-678-11D
Sodium Pyruvate	Gibco	11-360-070
TC-treated 24 well plates	Corning	08-772-1
Trypan blue	Gibco	15-250-061