Murin kimerik antijen reseptörü (CAR)-T hücrelerinin verimli üretimi

Özet

Bu protokol, retroviral vektör üretimini ve murin T hücresi transdüksiyonunu kolaylaştırarak fare CAR-T hücrelerinin verimli bir şekilde üretilmesini kolaylaştırır.

Özet

Kimerik antijen reseptörü (CAR)-T hücrelerini kullanan tasarlanmış hücre tedavileri, hematolojik maligniteleri olan bireylerde dikkate değer bir etkinlik elde etmiştir ve şu anda çeşitli katı tümörlerin tedavisi için geliştirilmektedir. Şimdiye kadar, yeni CAR-T hücre ürünlerinin ön değerlendirmesi, ağırlıklı olarak immün yetmezliği olan fareler kullanılarak ksenogreft tümör modellerinde gerçekleştirilmiştir. Bu yaklaşım, deney ortamında insan CAR-T hücrelerinin başarılı bir şekilde aşılanmasını kolaylaştırmak için seçilmiştir. Bununla birlikte, tümörlerin ve CAR-T hücrelerinin aynı fare suşundan türetildiği sinjeneik fare modelleri, fonksiyonel bir bağışıklık sistemi ve kapsamlı tümör mikroçevresi (TME) bağlamında yeni CAR teknolojilerinin değerlendirilmesine izin verir. Burada açıklanan protokol, retroviral transdüksiyon ve ex vivo T hücre kültürü için standartlaştırılmış yöntemler sunarak fare CAR-T hücre üretimi sürecini kolaylaştırmayı amaçlamaktadır. Bu protokolde açıklanan yöntemler, bağışıklığı yeterli sistemlerde yeni CAR teknolojilerinin rutin olarak değerlendirilmesini sağlamak için bu çalışmada kullanılanların ötesinde diğer CAR yapılarına da uygulanabilir.

Giriş

Kimerik antijen reseptörlerini (CAR'lar) eksprese eden evlat edinen T hücresi tedavileri, antijen pozitif kanser hücrelerini spesifik olarak hedeflemek ve ortadan kaldırmak için adaptif bağışıklık sisteminin gücünden yararlanarak kanser immünoterapisi alanında devrim yaratmıştır¹. B hücreli maligniteleri hedef alan CAR-T hücre tedavilerinin başarısı klinik olarak doğrulanmış olsa da, hayvan modellerinde gerçekleştirilen klinik öncesi çalışmalar, katı tümörleri hedefleyen yeni CAR'ların geliştirilmesi için hayati önem taşımaktadır. Bununla birlikte, şimdiye kadar katı tümör endikasyonlarında sınırlı klinik etkinlik gösteril....

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri, Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin (Columbia Üniversitesi, AC-AABQ5551 ve AC-AAAZ4470 protokolleri) onayı ile 20-25 g ağırlığındaki 6-8 haftalık dişi BALB/c veya CF57BL/6 fareler kullanılarak gerçekleştirildi. Hayvanlar ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (bkz. Bu protokol, murin T hücrelerinin 'aktivasyonundan sonraki günler' etrafında yapılandırılmıştır ve viral üretim -2. günde başlar. Retrovirüs, ilk üretimden sonra -80 ° C'de saklanabilir ve bu protokolün gelecekteki kullanımı için, 0. günde 2. adım, T hücresi izolasyonu ve aktivasyonu ile başlanabilir.

1. Retroviral vektör ü....

Tartışmalar

Bu protokol, in vivo çalışmalar için CAR-T hücreleri üretmek üzere murin T hücrelerinin retroviral transdüksiyonu için gerekli adımları ve reaktifleri açıklar. Retroviral transdüksiyon koşullarının optimize edilmesi, ultrasantrifüjleme veya ek reaktifler yoluyla viral konsantrasyona ihtiyaç duymadan sağlam CAR ekspresyonu sağlar. Ancak, bu metodolojiye uygulanabilecek birden fazla değişiklik vardır.

Bu protokol, GFP'ye özgü bir CAR'ın örnek oluşumunu aç?.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 μm filters	MilliporeSigma	SLHVR33RS
1 mL syringe	Fisher Scientific	14-955-450
1.5 mL microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-135
10 mL syringe	BD	14-823-16E
100 μm strainer	Corning	07-201-432
15 cm TC treated cell culture dishes	ThermoFisher Scientific	130183
15 mL conical tubes	Falcon	14-959-70C
40 μm strainer	Corning	07-201-430
50 mL conical tubes	Falcon	14-959-49A
70 μm strainer	Corning	07-201-431
Attune NxT Flow Cytometer	ThermoFisher Scientific
BALB/C, 6-8 week old	Jackson Laboratory	651
B-Mercaptoethanol	Gibco	21985023
Bovine Serum Albumin	GOLDBIO	A-420-500
DMEM Medium	Gibco	11965092
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), without Calcium and Magnesium	Gibco	14-190-250
DynaMag-2 Magnet	Invitrogen	12-321-D
EasySep Magnet	Stemcell Technologies	18000
EasySep Mouse T cell Isolation Kit	Stemcell Technologies	19851
FACS buffer	BD	BDB554657
Fetal bovine serum (FBS)	Corning	MT35011CV
GlutaMAX	Gibco	35-050-061
G-Rex6	Wilson Wolf	80240M
HEPES Buffer Solution	Gibco	15-630-080
Human recombinant IL-15	Miltenyi Biotec	130-095-765
Human recombinant IL-2	Miltenyi Biotec	130-097-748
Human recombinant IL-7	Miltenyi Biotec	130-095-363
Lipofectamine 3000	Invitrogen	L3000008
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140-050
Mouse Anti-CD3 BV421	Biolegend	100228
Mouse Anti-CD3/CD28 Dynabeads	Gibco	11-453-D
Mouse Anti-CD4 BV605	BD	563151
Mouse Anti-CD44 APC	Biolegend	103011
Mouse Anti-CD62L PE-Cy7	Tonbo	SKU 60-0621-U025
Mouse Anti-CD8 APC-Cy7	Tonbo	SKU 25-0081-U025
Nikon Ti2 with Prime 95B camera	Nikon
Non-treated 24 well plates	CytoOne	CC7672-7524
Opti-MEM	Gibco	31-985-062
pCL-Eco	Addgene	#12371
Penicillin/Streptomycin Solution	Gibco	15-070-063
Phoenix Eco cells	ATCC	CRL-3214
pMDG.2	Addgene	#12259
pMSCV_PGK_GFP28z	N/A	Produced by R.LV.
Purified sfGFP	N/A	Produced by R.LV.
RetroNectin ('transduction reagent')	Takara Bio	T100B
RPMI 1640	Gibco	21875
Serological pipette 10 mL	Fisher Scientific	13-678-11E
Serological pipette 25 mL	Fisher Scientific	13-678-11
Serological pipette 5 mL	Fisher Scientific	13-678-11D
Sodium Pyruvate	Gibco	11-360-070
TC-treated 24 well plates	Corning	08-772-1
Trypan blue	Gibco	15-250-061