Murin kimerik antijen reseptörü (CAR)-T hücrelerinin verimli üretimi

Özet

Bu protokol, retroviral vektör üretimini ve murin T hücresi transdüksiyonunu kolaylaştırarak fare CAR-T hücrelerinin verimli bir şekilde üretilmesini kolaylaştırır.

Özet

Kimerik antijen reseptörü (CAR)-T hücrelerini kullanan tasarlanmış hücre tedavileri, hematolojik maligniteleri olan bireylerde dikkate değer bir etkinlik elde etmiştir ve şu anda çeşitli katı tümörlerin tedavisi için geliştirilmektedir. Şimdiye kadar, yeni CAR-T hücre ürünlerinin ön değerlendirmesi, ağırlıklı olarak immün yetmezliği olan fareler kullanılarak ksenogreft tümör modellerinde gerçekleştirilmiştir. Bu yaklaşım, deney ortamında insan CAR-T hücrelerinin başarılı bir şekilde aşılanmasını kolaylaştırmak için seçilmiştir. Bununla birlikte, tümörlerin ve CAR-T hücrelerinin aynı fare suşundan türetildiği sinjeneik fare modelleri, fonksiyonel bir bağışıklık sistemi ve kapsamlı tümör mikroçevresi (TME) bağlamında yeni CAR teknolojilerinin değerlendirilmesine izin verir. Burada açıklanan protokol, retroviral transdüksiyon ve ex vivo T hücre kültürü için standartlaştırılmış yöntemler sunarak fare CAR-T hücre üretimi sürecini kolaylaştırmayı amaçlamaktadır. Bu protokolde açıklanan yöntemler, bağışıklığı yeterli sistemlerde yeni CAR teknolojilerinin rutin olarak değerlendirilmesini sağlamak için bu çalışmada kullanılanların ötesinde diğer CAR yapılarına da uygulanabilir.

Giriş

Kimerik antijen reseptörlerini (CAR'lar) eksprese eden evlat edinen T hücresi tedavileri, antijen pozitif kanser hücrelerini spesifik olarak hedeflemek ve ortadan kaldırmak için adaptif bağışıklık sisteminin gücünden yararlanarak kanser immünoterapisi alanında devrim yaratmıştır¹. B hücreli maligniteleri hedef alan CAR-T hücre tedavilerinin başarısı klinik olarak doğrulanmış olsa da, hayvan modellerinde gerçekleştirilen klinik öncesi çalışmalar, katı tümörleri hedefleyen yeni CAR'ların geliştirilmesi için hayati önem taşımaktadır. Bununla birlikte, şimdiye kadar katı tümör endikasyonlarında sınırlı klinik etkinlik gösterilmiştir ve bireysel klinik öncesi modellerin canlı bir ilacın farmakodinamiğini ve klinik etkinliğini doğru bir şekilde tahmin etmediği giderek daha belirgin hale gelmektedir ^2,3. Bu nedenle, araştırmacılar, CAR-T hücre ürünlerinin klinik öncesi çalışmasını, sırasıyla insan ve fare kanserlerinin ksenogreft ve sinjeneik modellerinde paralel değerlendirmeleri içerecek şekilde genişletmeye başladılar.

İnsan tümörlerinin ve T hücrelerinin immün yetmezliği olan farelere aşılandığı ksenogreft modellerinin aksine, sinjeneik modeller, fonksiyonel bir bağışıklık sistemi bağlamında CAR-T hücre yanıtlarının incelenmesini sağlar. Spesifik olarak, sinjeneik tümörler taşıyan bağışıklığa yetkin fareler, tümör mikroçevresinde (TME) T hücresi fonksiyonunu baskıladığı bilinen tümörle ilişkili makrofajlar (TAM'lar) ve düzenleyici T hücreleri (Treg'ler) dahil olmak üzere, evlat edinilmiş olarak transfer edilen T hücreleri ile bağlama özgü ortamlar arasındaki etkileşimi incelemek için bir sistem ^sağlar4,5,6. Ayrıca, sinjeneik modeller, sitokin salınım sendromu⁷ dahil olmak üzere ek toksisitelere yol açabilecek konakçı faktörlerle hedefte, tümör dışı toksisiteyi ve CAR-T hücre etkileşimini değerlendirmek için ek bir platform sunar.

Bu avantajlara rağmen, sinjeneik CAR-T hücre çalışmalarının sayısı sınırlı kalmaktadır. Özellikle, sinjeneik modeller, aynı fare suşundan CAR-T hücrelerinin otolog mühendisliğini gerektirir ve bu nedenle, verimli murin T hücresi transdüksiyonu ve ex vivo genişleme için metodoloji eksikliği nedeniyle ek bir zorluk sunar ^2,8. Bu protokol, retroviral vektörlerin üretimi ve optimize edilmiş T hücresi transdüksiyonu yoluyla kararlı CAR ekspresyonu elde etme yöntemlerini özetlemektedir. Tüm sürecin bir şeması Şekil 1'de gösterilmektedir. Bu yaklaşımın kullanımı, murin CAR-T hücrelerinin verimli retroviral transdüksiyonunu ve ultrasantrifüjleme yoluyla viral konsantrasyona ihtiyaç duymadan yüksek CAR ekspresyonunun elde edildiğini göstermektedir. CAR yapısının antijen özgüllüğünü değiştirme stratejileri, ek transgenlerin birlikte ekspresyonuna ek olarak tartışılmaktadır.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri, Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin (Columbia Üniversitesi, AC-AABQ5551 ve AC-AAAZ4470 protokolleri) onayı ile 20-25 g ağırlığındaki 6-8 haftalık dişi BALB/c veya CF57BL/6 fareler kullanılarak gerçekleştirildi. Hayvanlar ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (bkz. Bu protokol, murin T hücrelerinin 'aktivasyonundan sonraki günler' etrafında yapılandırılmıştır ve viral üretim -2. günde başlar. Retrovirüs, ilk üretimden sonra -80 ° C'de saklanabilir ve bu protokolün gelecekteki kullanımı için, 0. günde 2. adım, T hücresi izolasyonu ve aktivasyonu ile başlanabilir.

1. Retroviral vektör üretimi

NOT: Viral ürünler, paketleme genlerinin iki ayrı plazmide ayrılmasıyla replikasyon kusurlu hale getirilmiştir (bkz. Malzeme Tablosu), rekombinasyon olayları olasılığını ve replikasyona yetkin virüsün yanlışlıkla üretilmesini büyük ölçüde azaltır.

1. Transfeksiyondan bir gün önce Phoenix Eco hücrelerini hazırlayın (Gün -2 prosedürü).
   1. 30 mL kültür ortamı (Tablo 1'de detaylandırıldığı gibi Phoenix Eco kültür ortamı) kullanarak, 15 cm TC ile muamele edilmiş bir plaka veya T150 kültür şişesinde yaklaşık 1 x^{10 7} hücre plakalayın.
   2. Gece boyunca 37 °C'de inkübe edin. 18-24 saat sonra, aşırı büyüme olmadan yüksek bir viral verim sağlamak için hücreler yaklaşık% 70 birleşik olmalı ve düzgün bir şekilde dağılmalıdır.
      NOT: En iyi sonuçlar için, düşük geçişli hücreler kullanın ve viral üretim için kaplamadan bir gün önce bunları geçirin. Phoenix Eco hücrelerinin rutin kültür sırasında aşırı büyümesine izin vermeyin.
2. İndirgenmiş serum ortamında lipofeksiyon ve arttırıcı reaktifler, pCL-Eco (Gag / Pol) ve pMSCV ekspresyon plazmidini (pMSCV_PGK_mGFP28z) içeren transfeksiyon karışımını hazırlayın (bkz. Malzeme Tablosu) (Gün -1 prosedürü).
   NOT: Ko-transfeksiyon, pMSCV ve pCL-Eco'nun 1:1 oranında gerçekleştirilmelidir.
   1. Tüp A'yı Hazırlayın: 105 μL transfeksiyon reaktifini 15 cm'lik plaka başına 3.75 mL indirgenmiş serum ortamında seyreltin ve yukarı ve aşağı girdap veya pipetleme ile iyice karıştırın.
   2. Tüp B'yi hazırlayın: pMSCV ekspresyon plazmidini (21 μg) ve pCL-Eco'yu (21 μg) 90 μL arttırıcı reaktif ile 15 cm'lik plaka başına 3.75 mL indirgenmiş serum ortamına seyreltin. Yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın.
      NOT: Birden fazla viral ürün oluşturuyorsanız, pCL-Eco ve arttırıcı reaktif içeren bir ana karışım oluşturun.
   3. Tüp A'yı Tüp B'ye ekleyin ve pipetleyerek iyice karıştırın. Oda sıcaklığında 10-20 dakika inkübe edin, toplam hacim yaklaşık 7,5 mL'dir.
   4. Phoenix Eco plakasından/plakalarından 10 mL hücre kültürü ortamını dikkatlice çıkarın ve plakayı eğerek ve damla damla pipetleyerek transfeksiyon karışımının tüm hacmini kalan ortama ekleyin. Hücreleri 37 °C'lik bir inkübatöre geri koyun.
3. Transfekte edilmiş Phoenix Eco hücrelerindeki ortamı, transfeksiyondan 16-20 saat sonra değiştirin (Gün 0 prosedürü).
   1. Bir su veya boncuk banyosu kullanarak serum ve β-merkaptoetanol (2-ME, Malzeme Tablosuna bakınız) içermeyen murin T hücresi ortamını ( Tablo 1'de listelendiği gibi mTCM-viral hasat) 37 ° C'ye kadar önceden ısıtın.
   2. Plakayı eğerek ve pipet ucunu alt köşeye yerleştirerek, mümkünse bir vakum kullanarak Phoenix Eco kültür ortamını dikkatlice çıkarın. Hücreleri aşırı kurutmaktan kaçının.
   3. Isıtılmış mTCM-viral hasat ortamını, en yavaş ayarda 30 mL pipetleyerek eğimli plakanın yan tarafına yavaşça ekleyin. Hücreleri 37 °C'lik bir inkübatöre geri koyun.
      NOT: Bu adım, Phoenix Eco hücrelerinin plakadan ayrılmasına ve viral titreleri azaltmasına neden olabilir. Önceden ısıtılmış ortam ve hassas pipetleme, bozulmayı en aza indirir.
4. Viral süpernatanı transfeksiyondan 48 saat sonra hasat edin (1. gün prosedürü).
   1. Viral süpernatanı toplayın ve hücreleri ve kalıntıları gidermek için 0.45 μm PVDF filtrelerinden ( Malzeme Tablosuna bakınız) süzün. Virüsü alın ve -80 °C'de dondurun veya taze virüs kullanıyorsanız doğrudan 3. adımın 1. gününe geçin.
   2. Daha önce tarif edildiği gibi akış sitometrisi ile viral titreyi (dönüştürücü birimler / mL) belirleyin⁹. Bu adım isteğe bağlıdır.
      1. Doku kültürü (TC) ile muamele edilmiş 96 oyuklu plakalarda 1 x 10⁵ aktif murin T hücrelerinin küçük ölçekli transdüksiyonu ile viral titreyi belirleyin, retronektin ile önceden kaplanmıştır (bkz. Malzeme Tablosu) ve 100 μL mTCM-viral hasat ortamının nihai hacminde retroviral süpernatantın üç kat seri dilüsyonları ile yüklenmiştir.
         NOT: T hücresi izolasyonu, aktivasyonu ve transdüksiyonu hakkında ayrıntılı talimatlar için aşağıdaki 2. ve 3. adımlara bakın.
      2. Akış sitometrisi ile transdüksiyondan 4-5 gün sonra CAR yüzey ekspresyonunu belirleyin.
      3. Viral titreyi^{formül 10'a} göre hesaplayın: (N x F x D) / V, burada N dönüştürülen hücre sayısıdır, F, CAR pozitif hücrelerin frekansıdır, D seyreltme faktörüdür ve V, dönüştürücü birimler (TU) / mL elde etmek için mL cinsinden iletim hacmidir.
         NOT: Viral titre donma/çözülme üzerine azalabilir; Bu nedenle, viral titre ideal olarak donmuş ve daha sonra çözülmüş virüs üzerinde belirlenir.

2. Murin T hücresi izolasyonu

1. Murin T hücrelerini izole edin ve aktive edin (Gün 0 prosedürü).
   NOT: Bu adımlar oda sıcaklığında (RT) veya 4 °C'de gerçekleştirilebilir ve steril bir ortamda gerçekleştirilmelidir.
   1. Dalak (lar) daha önce tarif edildiği gibi ilgilenilen fare suşundan (örneğin, Balb / c, C57BL / 6)^{hasat edin 11} ve mekanik ayrışma yoluyla tek hücreli bir süspansiyon elde edin.
   2. Steril bir şırınganın arkasını kullanarak, dalakları 70-100 μm'lik bir hücre süzgecinden 50 mL'lik konik bir tüpe ezin.
   3. Şırıngayı bir kenara koyduktan sonra, süzgeci 5 mL T hücresi izolasyon tamponu (fosfat tamponlu salin, PBS,% 2 fetal sığır serumu, FBS ile desteklenmiş) ile yıkayın.
   4. Ezme adımını tekrarlayın ve süzgeci 5 mL T hücre izolasyon tamponu ile bir kez daha yıkayın. T hücresi izolasyon tamponu ile son hacmi 50 mL'ye getirin.
   5. Manuel hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak canlı hücreleri 1:20 oranında seyrelterek ve ardından 1:1'de tripan mavisi ile karıştırarak sayın.
   6. Hücreleri 450 x g'da, 4 °C'de (veya RT'de) 10 dakika santrifüjleme ile pelet yapın ve önerilen T hücresi izolasyon kitini kullanıyorsanız spleenositleri 1 x 10⁸ / mL'de yeniden süspanse edin (bkz.
      NOT: Spleenositler, kümeleri çıkarmak için bu aşamada 40-70 μm'lik bir süzgeçten tekrar süzülebilir.
2. CD3⁺ T hücrelerini, üreticinin talimatlarını izleyerek negatif seçimle izole edin (bkz. Malzeme Tablosu). Manyetik ayırmadan sonra, izolatı 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve son bir canlı hücre sayımı yapın.
3. İzole edilmiş T hücrelerini 450 x g'da, 4 ° C'de (veya RT'de) 10 dakika santrifüjleme ile pelet haline getirin ve mTCM aktivasyon ortamında 1 x 10⁶ / mL'de yeniden süspanse edin (Tablo 1).
4. 25 μL / 1 x 10⁶ T hücre ve 100 U / mL IL-2 oranında murin anti-CD3 / anti-CD28 monoklonal antikor kaplı manyetik boncuklar (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyerek T hücrelerini aktive edin.
5. Hücreleri 37 °C'de bir inkübatöre yerleştirin ve gece boyunca bırakın.
   NOT: T hücrelerinin küçük boyutu nedeniyle, bir hemositometre kullanılarak manuel sayım için 1:10-1:20 oranında seyreltilerek ve 1:1'de tripan mavisi ile karıştırılarak daha doğru bir canlı T hücresi sayımı elde edilebilir. Saflık, hücrelerin floresan konjuge αCD3 antikoru ile boyanmasıyla akış sitometrisi ile belirlenebilir. Her dalak, farenin yaşına ve türüne bağlı olarak 7-10 x 10⁶ T hücre verecektir.

3. Murin T hücresi transdüksiyonu

1. Transdüksiyon için plakaları hazırlayın (Gün 0 prosedürü).
   1. İşlem görmemiş steril 24 oyuklu plakaları 0.5 mL insan fibronektin transdüksiyon arttırıcı reaktif (Malzeme Tablosuna bakınız) ile steril PBS içinde seyrelterek 20-40 μg / mL'lik bir son konsantrasyonda önceden kaplayın ve gece boyunca 4 ° C'de saklayın.
      NOT: Bu adım, işlem görmemiş 24 oyuklu plakaların transdüksiyon reaktifi ile kaplanması ve oda sıcaklığında 2 saat inkübe edilmesiyle 1. günde de gerçekleştirilebilir.
2. T hücresi transdüksiyonu gerçekleştirin (1. gün prosedürü).
   1. Önceden kaplanmış plakayı transdüksiyon için hazırlayın. Transdüksiyon reaktifini önceden kaplanmış 24 oyuklu plakanın her bir oyuğundan çıkarın ve RT'de 30 dakika boyunca eşdeğer hacimde steril filtrelenmiş PBS +% 2 sığır serum albümini (BSA) (0.5 mL) ile bloke edin.
   2. 0.5-1 mL PBS ile bir kez yıkayın.
3. 1. adımdan itibaren 0.5-1 mL saf retrovirüs ekleyin veya önceden kaplanmış her bir kuyucuğa viral titreye göre seyreltilmiş ve 2.000 x g ve 32 ° C'de 90 dakika santrifüjleyin.
4. Viral olarak yüklenen her kuyuya 1 mL aktif T hücresi ekleyin ve 450 x g ve 32 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin. Hücreleri gece boyunca 37 ° C'lik bir inkübatöre geri koyun.
5. Transdüksiyondan 24 saat sonra, 1-1.5 mL hücre kültürü ortamını çıkarın ve 1-1.5 mL mTCM-tam ve 10 ng / mL rekombinant insan IL-7 ve IL-15 ile değiştirin (bkz. Hücreleri 37 ° C'lik bir inkübatöre geri koyun (2. gün prosedürü).
   NOT: Ex vivo kültür sırasında, kültüre her 48 saatte bir 10 ng/mL sitokin eklenmeli ve T hücreleri 1 x 10⁶/mL'nin üzerinde seyreltilmemelidir.
6. Transdüksiyondan 48 saat sonra, hücreleri transdüksiyon plakasından yeni bir 24 oyuklu veya 6 oyuklu plakaya aktarın ve hücreleri 37 ° C'lik bir inkübatöre geri koyun (3. Gün prosedürü).
   NOT: T hücresi canlılığı, T hücresi canlılığına ve viral titreye bağlı olarak, transdüksiyondan 24 saat ila 2 gün sonra hücrelerin aktarılmasıyla iyileşebilir.
7. T hücrelerini ayırın ve CAR ekspresyonunu onaylayın (Gün 5-6 prosedürü).
   1. Aktive edilmiş T hücrelerini αCD3/CD28 kaplı boncuklardan ayırmak için hücreleri iyice yeniden süspanse edin (Malzeme Tablosuna bakın) ve hücre süspansiyonunu 30 saniye boyunca bir mıknatıs üzerine yerleştirin. Hücre süspansiyonunu istenen ex vivo kültür kabına aktarın ve 37 °C'lik bir inkübatöre geri koyun.
      NOT: T hücreleri, kültür şişelerinde veya derin kuyu kültür plakalarında kültürlenebilir. 6 oyuklu formatlı bir plakanın derin bir kuyusunda oyuk başına 30 mL mTCM-tam ortamda en az 5 x 10⁶ T hücrenin kaplanması önerilir (bkz.
   2. Akış sitometrisi ile CAR ekspresyonunu belirleyin⁸.
      NOT: GFP-CAR ekspresyonu, 100 ng/mL saflaştırılmış GFP ile inkübasyon ile belirlendi. Bir N-terminal epitop etiketinin dahil edilmesi, alternatif CAR yapılarının tespitini kolaylaştıracaktır.
8. CAR-T hücrelerinin ex vivo kültürünü gerçekleştirin (7-10. gün prosedürü).
   1. Ex vivo kültür sırasında, kültür ortamının% 50'sini çıkararak ve her 48 saatte bir taze mTCM-tam + 2x 10 ng / mL IL-7 ve IL-15 ile değiştirerek hücreleri koruyun.
      NOT: Murin CAR-T hücreleri, aktivasyondan 7 gün sonra aşağı akış uygulamalarında kullanıma hazırdır ve çözülme sonrası zayıf canlılık nedeniyle dondurularak saklanmamalıdır.

Sonuçlar

Burada açıklanan protokol, fare CAR-T hücrelerinin üretilmesi için murin T hücresi transdüksiyon sürecini standartlaştırmayı amaçlamaktadır. Şekil 1 , ilgili adımların ayrıntılı bir açıklamasını sağlar. Süreç, viral bileşenlerin Phoenix Eco hücrelerine birlikte transfeksiyonu yoluyla retroviral vektörlerin üretilmesiyle başlar. Şekil 2 , transfeksiyon gününde Phoenix Eco hücrelerinin optimal yoğunluğunun bir görünt...

Tartışmalar

Bu protokol, in vivo çalışmalar için CAR-T hücreleri üretmek üzere murin T hücrelerinin retroviral transdüksiyonu için gerekli adımları ve reaktifleri açıklar. Retroviral transdüksiyon koşullarının optimize edilmesi, ultrasantrifüjleme veya ek reaktifler yoluyla viral konsantrasyona ihtiyaç duymadan sağlam CAR ekspresyonu sağlar. Ancak, bu metodolojiye uygulanabilecek birden fazla değişiklik vardır.

Bu protokol, GFP'ye özgü bir CAR'ın örnek oluşumunu aç?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 μm filters	MilliporeSigma	SLHVR33RS
1 mL syringe	Fisher Scientific	14-955-450
1.5 mL microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-135
10 mL syringe	BD	14-823-16E
100 μm strainer	Corning	07-201-432
15 cm TC treated cell culture dishes	ThermoFisher Scientific	130183
15 mL conical tubes	Falcon	14-959-70C
40 μm strainer	Corning	07-201-430
50 mL conical tubes	Falcon	14-959-49A
70 μm strainer	Corning	07-201-431
Attune NxT Flow Cytometer	ThermoFisher Scientific
BALB/C, 6-8 week old	Jackson Laboratory	651
B-Mercaptoethanol	Gibco	21985023
Bovine Serum Albumin	GOLDBIO	A-420-500
DMEM Medium	Gibco	11965092
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), without Calcium and Magnesium	Gibco	14-190-250
DynaMag-2 Magnet	Invitrogen	12-321-D
EasySep Magnet	Stemcell Technologies	18000
EasySep Mouse T cell Isolation Kit	Stemcell Technologies	19851
FACS buffer	BD	BDB554657
Fetal bovine serum (FBS)	Corning	MT35011CV
GlutaMAX	Gibco	35-050-061
G-Rex6	Wilson Wolf	80240M
HEPES Buffer Solution	Gibco	15-630-080
Human recombinant IL-15	Miltenyi Biotec	130-095-765
Human recombinant IL-2	Miltenyi Biotec	130-097-748
Human recombinant IL-7	Miltenyi Biotec	130-095-363
Lipofectamine 3000	Invitrogen	L3000008
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140-050
Mouse Anti-CD3 BV421	Biolegend	100228
Mouse Anti-CD3/CD28 Dynabeads	Gibco	11-453-D
Mouse Anti-CD4 BV605	BD	563151
Mouse Anti-CD44 APC	Biolegend	103011
Mouse Anti-CD62L PE-Cy7	Tonbo	SKU 60-0621-U025
Mouse Anti-CD8 APC-Cy7	Tonbo	SKU 25-0081-U025
Nikon Ti2 with Prime 95B camera	Nikon
Non-treated 24 well plates	CytoOne	CC7672-7524
Opti-MEM	Gibco	31-985-062
pCL-Eco	Addgene	#12371
Penicillin/Streptomycin Solution	Gibco	15-070-063
Phoenix Eco cells	ATCC	CRL-3214
pMDG.2	Addgene	#12259
pMSCV_PGK_GFP28z	N/A	Produced by R.LV.
Purified sfGFP	N/A	Produced by R.LV.
RetroNectin ('transduction reagent')	Takara Bio	T100B
RPMI 1640	Gibco	21875
Serological pipette 10 mL	Fisher Scientific	13-678-11E
Serological pipette 25 mL	Fisher Scientific	13-678-11
Serological pipette 5 mL	Fisher Scientific	13-678-11D
Sodium Pyruvate	Gibco	11-360-070
TC-treated 24 well plates	Corning	08-772-1
Trypan blue	Gibco	15-250-061