Effiziente Generierung von murinen chimären Antigenrezeptor (CAR)-T-Zellen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll rationalisiert die retrovirale Vektorproduktion und die murine T-Zelltransduktion und erleichtert die effiziente Generierung von CAR-T-Zellen der Maus.

Zusammenfassung

Technisch hergestellte Zelltherapien, die chimäre Antigenrezeptor (CAR)-T-Zellen verwenden, haben eine bemerkenswerte Wirksamkeit bei Personen mit hämatologischen Malignomen erreicht und befinden sich derzeit in der Entwicklung für die Behandlung verschiedener solider Tumoren. Bisher erfolgte die vorläufige Evaluierung neuartiger CAR-T-Zellprodukte überwiegend in Xenograft-Tumormodellen mit immundefizienten Mäusen. Dieser Ansatz wurde gewählt, um die erfolgreiche Transplantation von humanen CAR-T-Zellen in der experimentellen Umgebung zu erleichtern. Syngene Mausmodelle, in denen Tumore und CAR-T-Zellen vom selben Mausstamm abstammen, erlauben jedoch die Evaluierung neuer CAR-Technologien im Kontext eines funktionierenden Immunsystems und einer umfassenden Tumormikroumgebung (TME). Das hier beschriebene Protokoll zielt darauf ab, den Prozess der Generierung von CAR-T-Zellen in der Maus zu rationalisieren, indem standardisierte Methoden für die retrovirale Transduktion und die ex vivo T-Zellkultur vorgestellt werden. Die in diesem Protokoll beschriebenen Methoden können auf andere CAR-Konstrukte als die in dieser Studie verwendeten angewendet werden, um eine routinemäßige Evaluierung neuer CAR-Technologien in immunkompetenten Systemen zu ermöglichen.

Einleitung

Adoptive T-Zell-Therapien, die chimäre Antigenrezeptoren (CARs) exprimieren, haben das Gebiet der Krebsimmuntherapie revolutioniert, indem sie die Kraft des adaptiven Immunsystems nutzen, um antigenpositive Krebszellen spezifisch anzuvisieren und zu eliminieren¹. Während der Erfolg von CAR-T-Zelltherapien, die auf maligne B-Zell-Erkrankungen abzielen, klinisch validiert wurde, sind präklinische Studien, die in Tiermodellen durchgeführt wurden, für die Entwicklung neuer CARs, die auf solide Tumore abzielen, nach wie vor von entscheidender Bedeutung. Bisher konnte jedoch nur eine begrenzte klinische Wirksamkeit bei soliden Tumorindikationen nachgewiesen werden, und es wird immer deutlicher, dass einzelne präklinische Modelle die Pharmakodynamik und klinische Wirksamkeit eines lebenden Arzneimittels nicht genau vorhersagen ^2,3. Daher haben die Forscher begonnen, die präklinische Studie mit CAR-T-Zellprodukten zu erweitern, um parallele Bewertungen in Xenotransplantat- und syngenen Modellen von menschlichen bzw. murinen Krebserkrankungen einzubeziehen.

Im Gegensatz zu Xenograft-Modellen, bei denen menschliche Tumore und T-Zellen in immundefiziente Mäuse transplantiert werden, ermöglichen syngene Modelle die Untersuchung von CAR-T-Zellantworten im Kontext eines funktionierenden Immunsystems. Insbesondere bieten immunkompetente Mäuse mit syngenen Tumoren ein System zur Untersuchung der Interaktion zwischen adoptiv übertragenen T-Zellen und kontextspezifischen Milieus - einschließlich tumorassoziierter Makrophagen (TAMs) und regulatorischer T-Zellen (Tregs), von denen bekannt ist, dass sie die T-Zell-Funktion in der Tumormikroumgebung (TME^{) unterdrücken4,5,6}. Darüber hinaus bieten syngene Modelle eine zusätzliche Plattform zur Bewertung der On-Target- und Off-Tumor-Toxizität und der Interaktion von CAR-T-Zellen mit Wirtsfaktoren, die zu zusätzlichen Toxizitäten führen können, einschließlich des Zytokinfreisetzungssyndroms⁷.

Trotz dieser Vorteile ist die Anzahl der syngenen CAR-T-Zellstudien nach wie vor begrenzt. Insbesondere erfordern syngene Modelle ein autologes Engineering von CAR-T-Zellen aus demselben Mausstamm und stellen daher eine zusätzliche Herausforderung dar, da es keine Methodik für eine effiziente murine T-Zell-Transduktion und ex vivo Expansion gibt ^2,8. Dieses Protokoll beschreibt die Methoden, um eine stabile CAR-Expression durch die Produktion retroviraler Vektoren und eine optimierte T-Zell-Transduktion zu erreichen. Ein Schema des gesamten Prozesses ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Verwendung dieses Ansatzes demonstriert eine effiziente retrovirale Transduktion von murinen CAR-T-Zellen und das Erreichen einer hohen CAR-Expression ohne die Notwendigkeit einer Viruskonzentration durch Ultrazentrifugation. Neben der Co-Expression weiterer Transgene werden auch Strategien zur Veränderung der Antigenspezifität des CAR-Konstrukts diskutiert.

Protokoll

Alle Tierbehandlungen wurden mit Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee (Columbia University, Protokolle AC-AABQ5551 und AC-AAAZ4470) mit 6-8 Wochen alten weiblichen BALB/c- oder CF57BL/6-Mäusen mit einem Gewicht zwischen 20 und 25 g durchgeführt. Die Tiere stammten aus einer kommerziellen Quelle (siehe Materialtabelle). Dieses Protokoll ist um die "Tage nach der Aktivierung" der murinen T-Zellen herum strukturiert, und die Virusproduktion beginnt am Tag -2. Das Retrovirus kann nach der ersten Produktion bei -80 °C gelagert werden, und für die zukünftige Verwendung dieses Protokolls kann man mit Schritt 2, der Isolierung und Aktivierung von T-Zellen am Tag 0, beginnen.

1. Retrovirale Vektorproduktion

ANMERKUNG: Die viralen Produkte wurden durch die Trennung der Verpackungsgene in zwei separate Plasmide replikationsfehlerhaft gemacht (siehe Materialtabelle), wodurch die Wahrscheinlichkeit von Rekombinationsereignissen und der unbeabsichtigten Produktion von replikationskompetenten Viren erheblich reduziert wurde.

1. Bereiten Sie die Phoenix Eco-Zellen einen Tag vor der Transfektion vor (Tag-2-Verfahren).
   1. Etwa 1 x 10⁷ Zellen werden in eine 15 cm TC-behandelte Platte oder einen T150-Kulturkolben gegeben, wobei 30 ml Nährmedium (Phoenix Eco-Nährmedium, wie in Tabelle 1 beschrieben) verwendet werden.
   2. Über Nacht bei 37 °C inkubieren. Nach 18-24 h sollten die Zellen zu ca. 70% konfluent und gleichmäßig verteilt sein, um eine hohe Virusausbeute ohne Überwucherung zu gewährleisten.
      HINWEIS: Um optimale Ergebnisse zu erzielen, verwenden Sie Zellen mit einer niedrigen Passage und lassen Sie sie am Tag vor der Beschichtung für die Virusproduktion durch. Achten Sie darauf, dass Phoenix Eco-Zellen während der Routinekultur nicht überwuchern.
2. Die Transfektionsmischung mit den Lipofektions- und Enhancer-Reagenzien pCL-Eco (Gag/Pol) und pMSCV-Expressionsplasmid (pMSCV_PGK_mGFP28z) wird in reduzierten Serummedien hergestellt (siehe Materialtabelle) (Tag-1-Verfahren).
   HINWEIS: Die Co-Transfektion sollte in einem Verhältnis von 1:1 von pMSCV und pCL-Eco durchgeführt werden.
   1. Röhrchen A vorbereiten: Verdünnen Sie 105 μl des Transfektionsreagenzes in 3,75 ml reduziertem Serummedium pro 15-cm-Platte und mischen Sie es gründlich durch Auf- und Abpipettieren.
   2. Röhrchen B vorbereiten: pMSCV-Expressionsplasmid (21 μg) und pCL-Eco (21 μg) mit 90 μl Enhancer-Reagenz in 3,75 ml reduziertes Serummedium pro 15-cm-Platte verdünnen. Durch Auf- und Abpipettieren gut mischen.
      HINWEIS: Wenn Sie mehrere virale Produkte erzeugen, richten Sie einen Mastermix ein, der pCL-Eco und das Enhancer-Reagenz enthält.
   3. Fügen Sie Röhrchen A zu Röhrchen B hinzu und mischen Sie es gründlich durch Pipettieren. 10-20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, was ein Gesamtvolumen von ca. 7,5 ml ergibt.
   4. Entnehmen Sie vorsichtig 10 ml Zellkulturmedien von der/den Phoenix Eco-Platte(n) und geben Sie das gesamte Volumen der Transfektionsmischung zu den verbleibenden Medien, indem Sie die Platte kippen und tropfenweise pipettieren. Die Zellen werden wieder in einen 37 °C warmen Inkubator gegeben.
3. Wechseln Sie das Medium auf transfizierten Phoenix Eco-Zellen 16-20 Stunden nach der Transfektion (Tag-0-Verfahren).
   1. Serum und β-Mercaptoethanol (2-ME, siehe Materialtabelle) freies murines T-Zell-Medium (mTCM-virale Ernte, wie in Tabelle 1 aufgeführt) in einem Wasser- oder Kügelchenbad auf 37 °C vorwärmen.
   2. Entfernen Sie das Phoenix Eco Nährmedium vorsichtig, indem Sie die Platte kippen und die Pipettenspitze an der unteren Ecke platzieren, wenn möglich mit einem Vakuum. Vermeiden Sie ein Übertrocknen der Zellen.
   3. Geben Sie das erwärmte mTCM-virale Erntemedium vorsichtig an die Seite der geneigten Platte, indem Sie 30 ml auf der langsamsten Stufe pipettieren. Die Zellen werden wieder in einen 37 °C warmen Inkubator gegeben.
      HINWEIS: Dieser Schritt kann dazu führen, dass sich Phoenix Eco-Zellen von der Platte lösen und die Virustiter reduzieren. Vorgewärmte Medien und schonendes Pipettieren minimieren Unterbrechungen.
4. Entnehmen Sie den viralen Überstand 48 Stunden nach der Transfektion (Tag-1-Verfahren).
   1. Entnehmen Sie den viralen Überstand und filtern Sie ihn durch 0,45 μm PVDF-Filter (siehe Materialtabelle), um Zellen und Ablagerungen zu entfernen. Aliquotieren und frieren Sie das Virus bei -80 °C ein oder fahren Sie direkt mit Tag 1 von Schritt 3 fort, wenn Sie frisches Virus verwenden.
   2. Bestimmen Sie den Virustiter (transduzierende Einheiten/ml) durch Durchflusszytometrie, wie zuvor beschrieben⁹. Dieser Schritt ist optional.
      1. Bestimmung des Virustiters durch Transduktion von 1 x 10⁵ aktivierten murinen T-Zellen in mit Nicht-Gewebekulturen (TC) behandelten 96-Well-Platten, die mit Retronektin vorbeschichtet (siehe Materialtabelle) und mit dreifachen seriellen Verdünnungen retroviralen Überstandes in einem Endvolumen von 100 μl mTCM-viralem Erntemedium beladen wurden.
         HINWEIS: In Schritt 2 und Schritt 3 unten finden Sie detaillierte Anweisungen zur Isolierung, Aktivierung und Transduktion von T-Zellen.
      2. Bestimmung der CAR-Oberflächenexpression 4-5 Tage nach der Transduktion mittels Durchflusszytometrie.
      3. Berechnen Sie den Virustiter gemäß der Formel¹⁰: (N x F x D)/V, wobei N die Anzahl der transduzierten Zellen, F die Häufigkeit der CAR-positiven Zellen, D der Verdünnungsfaktor und V das Transduktionsvolumen in ml ist, um Transduktionseinheiten (TU)/ml zu erhalten.
         HINWEIS: Der Virustiter kann beim Einfrieren/Auftauen abnehmen; Daher wird der Virustiter idealerweise an gefrorenen und anschließend aufgetauten Viren bestimmt.

2. Isolierung von murinen T-Zellen

1. Isolierung und Aktivierung von murinen T-Zellen (Tag-0-Verfahren).
   HINWEIS: Diese Schritte können bei Raumtemperatur (RT) oder 4 °C durchgeführt werden und sollten in einer sterilen Umgebung durchgeführt werden.
   1. Man erntet die Milz(en) von dem interessierenden Mausstamm (z. B. Balb/c, C57BL/6), wie zuvor^{beschrieben 11} und erhält eine einzellige Suspension durch mechanische Dissoziation.
   2. Zerkleinern Sie die Milz(en) mit der Rückseite einer sterilen Spritze durch ein 70-100-μm-Zellsieb in ein konisches 50-ml-Röhrchen.
   3. Nachdem Sie die Spritze beiseite gelegt haben, waschen Sie das Sieb mit 5 ml T-Zell-Isolationspuffer (phosphatgepufferte Kochsalzlösung, PBS, ergänzt mit 2 % fötalem Kälberserum, FBS).
   4. Wiederholen Sie den Maischeschritt und waschen Sie das Sieb erneut mit 5 ml T-Zell-Isolationspuffer. Bringen Sie das Endvolumen mit T-Zell-Isolationspuffer auf 50 ml.
   5. Zählen Sie lebende Zellen mit einem manuellen Hämozytometer oder einem automatischen Zellzähler, indem Sie sie im Verhältnis 1:20 verdünnen und dann im Verhältnis 1:1 mit Trypanblau mischen.
   6. Die Zellen werden 10 Minuten lang bei 450 x g bei 450 °C (oder RT) zentrifugiert, und die Milzzellen werden bei 1 x 10⁸/ml resuspendiert, wenn das empfohlene T-Zell-Isolierungskit verwendet wird (siehe Materialtabelle).
      HINWEIS: Spleenozyten können in diesem Stadium durch ein 40-70 μm großes Sieb erneut eingesiebt werden, um Klumpen zu entfernen.
2. CD3⁺ T-Zellen durch Negativselektion gemäß den Anweisungen des Herstellers isolieren (siehe Materialtabelle). Nach der magnetischen Trennung wird das Isolat in ein konisches 15-ml-Röhrchen überführt und eine endgültige Lebendzellzählung durchgeführt.
3. Die isolierten T-Zellen werden durch Zentrifugation für 10 min bei 450 x g bei 4 °C (oder RT) pelletiert und bei 1 x 10⁶/ml in mTCM-Aktivierungsmedium resuspendiert (Tabelle 1).
4. Aktivierung von T-Zellen durch Zugabe von murinen monoklonalen antiklonalen Antikörper-beschichteten Magnetkügelchen (siehe Materialtabelle) in einem Verhältnis von 25 μl/1 x 10⁶ T-Zellen und 100 U/ml IL-2.
5. Legen Sie die Zellen bei 37 °C in einen Inkubator und lassen Sie sie über Nacht stehen.
   HINWEIS: Aufgrund der geringen Größe von T-Zellen kann eine genauere Anzahl lebender T-Zellen erreicht werden, indem sie im Verhältnis 1:10-1:20 verdünnt und im Verhältnis 1:1 mit Trypanblau für die manuelle Zählung mit einem Hämozytometer gemischt wird. Die Reinheit kann durch Durchflusszytometrie bestimmt werden, indem Zellen mit einem fluoreszenzkonjugierten αCD3-Antikörper gefärbt werden. Jede Milz liefert je nach Alter und Stamm der Maus zwischen 7-10 x^{10 6} T-Zellen.

3. Transduktion von murinen T-Zellen

1. Bereiten Sie die Platten für die Transduktion vor (Tag-0-Verfahren).
   1. Unbehandelte sterile 24-Well-Platten mit 0,5 ml humanem Fibronektin-Transduktionsverstärker-Reagenz (siehe Materialtabelle) in einer Endkonzentration von 20-40 μg/ml in sterilem PBS vorbeschichten und über Nacht bei 4 °C lagern.
      HINWEIS: Dieser Schritt kann auch an Tag 1 durchgeführt werden, indem unbehandelte 24-Well-Platten mit dem Transduktionsreagenz beschichtet und 2 h lang bei Raumtemperatur inkubiert werden.
2. Durchführung der T-Zell-Transduktion (Tag-1-Verfahren).
   1. Bereiten Sie die vorbeschichtete Platte für die Transduktion vor. Entfernen Sie das Transduktionsreagenz aus jeder Vertiefung der vorbeschichteten 24-Well-Platte und blockieren Sie es mit einem äquivalenten Volumen sterilfiltriertem PBS + 2 % Rinderserumalbumin (BSA) (0,5 ml) für 30 Minuten bei RT.
   2. Einmal mit 0,5-1 ml PBS waschen.
3. Geben Sie 0,5-1 ml reines Retrovirus aus Schritt 1 oder verdünnt auf der Grundlage des Virustiters in jede vorbeschichtete Vertiefung und zentrifugieren Sie 90 Minuten lang bei 2.000 x g und 32 °C.
4. 1 ml aktivierte T-Zellen in jede viral beladene Vertiefung geben und 10 Minuten bei 450 x g und 32 °C zentrifugieren. Die Zellen werden über Nacht in einen 37 °C warmen Inkubator zurückgebracht.
5. 24 Stunden nach der Transduktion 1-1,5 ml des Zellkulturmediums entfernen und durch 1-1,5 ml mTCM-complete und 10 ng/ml rekombinantes humanes IL-7 und IL-15 ersetzen (siehe Materialtabelle). Die Zellen werden wieder in einen 37 °C heißen Inkubator gegeben (Tag-2-Verfahren).
   HINWEIS: Während der Ex-vivo-Kultur müssen alle 48 Stunden 10 ng/ml Zytokine in die Kultur gegeben werden, und T-Zellen sollten nicht über 1 x 10⁶/ml hinaus verdünnt werden.
6. 48 Stunden nach der Transduktion werden die Zellen von der Transduktionsplatte in eine frische 24-Well- oder 6-Well-Platte überführt und die Zellen in einen 37 °C-Inkubator zurückgeführt (Tag-3-Verfahren).
   HINWEIS: Die Lebensfähigkeit der T-Zellen kann sich verbessern, indem die Zellen 24 Stunden bis 2 Tage nach der Transduktion übertragen werden, abhängig von der anfänglichen T-Zell-Lebensfähigkeit und dem Virustiter.
7. Entschlüsseln Sie die T-Zellen und bestätigen Sie die CAR-Expression (Verfahren an Tag 5-6).
   1. Die Zellen werden gründlich resuspendiert, um aktivierte T-Zellen von den αCD3/CD28-beschichteten Kügelchen zu trennen (siehe Materialtabelle) und die Zellsuspension 30 s lang auf einem Magneten platziert. Die Zellsuspension wird in das gewünschte Ex-vivo-Kulturgefäß überführt und in einen 37 °C heißen Inkubator zurückgeführt.
      HINWEIS: T-Zellen können in Kulturflaschen oder Deep-Well-Kulturplatten kultiviert werden. Es wird empfohlen, mindestens 5 x 10 6-T-Zellen in 30 ml mTCM-vollständigem Medium pro Well in einem tiefen Well einer 6-Well-Formatplatte zu beschichten (siehe Materialtabelle).
   2. Bestimmung der CAR-Expression mittels Durchflusszytometrie⁸.
      HINWEIS: DIE GFP-CAR-Expression wurde durch Inkubation mit 100 ng/ml gereinigtem GFP bestimmt. Der Einbau eines N-terminalen Epitop-Tags wird die Detektion alternativer CAR-Konstrukte erleichtern.
8. Durchführung einer Ex-vivo-Kultur von CAR-T-Zellen (Verfahren an Tag 7-10).
   1. Während der Ex-vivo-Kultur werden die Zellen erhalten, indem 50 % des Kulturmediums entfernt und alle 48 h durch frisches mTCM-complete + 2x 10 ng/ml IL-7 und IL-15 ersetzt werden.
      HINWEIS: Murine CAR-T-Zellen sind 7 Tage nach der Aktivierung für den Einsatz in Downstream-Anwendungen bereit und sollten aufgrund schlechter Lebensfähigkeit nach dem Auftauen nicht kryokonserviert werden.

Ergebnisse

Das hier beschriebene Protokoll zielt darauf ab, den Prozess der murinen T-Zell-Transduktion für die Generierung von CAR-T-Zellen der Maus zu standardisieren. Abbildung 1 enthält eine detaillierte Beschreibung der einzelnen Schritte. Der Prozess beginnt mit der Produktion retroviraler Vektoren durch Co-Transfektion von viralen Komponenten in Phoenix Eco-Zellen. Abbildung 2 zeigt die optimale Dichte der Phoenix Eco-Zellen am Tag der Transfektion. Isoli...

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt die Schritte und Reagenzien, die für die retrovirale Transduktion von murinen T-Zellen zur Generierung von CAR-T-Zellen für In-vivo-Studien erforderlich sind. Durch die Optimierung der retroviralen Transduktionsbedingungen wird eine robuste CAR-Expression erreicht, ohne dass eine Viruskonzentration durch Ultrazentrifugation oder zusätzliche Reagenzien erforderlich ist. Es gibt jedoch mehrere Modifikationen, die auf diese Methodik angewendet werden können.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 μm filters	MilliporeSigma	SLHVR33RS
1 mL syringe	Fisher Scientific	14-955-450
1.5 mL microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-135
10 mL syringe	BD	14-823-16E
100 μm strainer	Corning	07-201-432
15 cm TC treated cell culture dishes	ThermoFisher Scientific	130183
15 mL conical tubes	Falcon	14-959-70C
40 μm strainer	Corning	07-201-430
50 mL conical tubes	Falcon	14-959-49A
70 μm strainer	Corning	07-201-431
Attune NxT Flow Cytometer	ThermoFisher Scientific
BALB/C, 6-8 week old	Jackson Laboratory	651
B-Mercaptoethanol	Gibco	21985023
Bovine Serum Albumin	GOLDBIO	A-420-500
DMEM Medium	Gibco	11965092
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), without Calcium and Magnesium	Gibco	14-190-250
DynaMag-2 Magnet	Invitrogen	12-321-D
EasySep Magnet	Stemcell Technologies	18000
EasySep Mouse T cell Isolation Kit	Stemcell Technologies	19851
FACS buffer	BD	BDB554657
Fetal bovine serum (FBS)	Corning	MT35011CV
GlutaMAX	Gibco	35-050-061
G-Rex6	Wilson Wolf	80240M
HEPES Buffer Solution	Gibco	15-630-080
Human recombinant IL-15	Miltenyi Biotec	130-095-765
Human recombinant IL-2	Miltenyi Biotec	130-097-748
Human recombinant IL-7	Miltenyi Biotec	130-095-363
Lipofectamine 3000	Invitrogen	L3000008
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140-050
Mouse Anti-CD3 BV421	Biolegend	100228
Mouse Anti-CD3/CD28 Dynabeads	Gibco	11-453-D
Mouse Anti-CD4 BV605	BD	563151
Mouse Anti-CD44 APC	Biolegend	103011
Mouse Anti-CD62L PE-Cy7	Tonbo	SKU 60-0621-U025
Mouse Anti-CD8 APC-Cy7	Tonbo	SKU 25-0081-U025
Nikon Ti2 with Prime 95B camera	Nikon
Non-treated 24 well plates	CytoOne	CC7672-7524
Opti-MEM	Gibco	31-985-062
pCL-Eco	Addgene	#12371
Penicillin/Streptomycin Solution	Gibco	15-070-063
Phoenix Eco cells	ATCC	CRL-3214
pMDG.2	Addgene	#12259
pMSCV_PGK_GFP28z	N/A	Produced by R.LV.
Purified sfGFP	N/A	Produced by R.LV.
RetroNectin ('transduction reagent')	Takara Bio	T100B
RPMI 1640	Gibco	21875
Serological pipette 10 mL	Fisher Scientific	13-678-11E
Serological pipette 25 mL	Fisher Scientific	13-678-11
Serological pipette 5 mL	Fisher Scientific	13-678-11D
Sodium Pyruvate	Gibco	11-360-070
TC-treated 24 well plates	Corning	08-772-1
Trypan blue	Gibco	15-250-061