小鼠嵌合抗原受体（CAR）-T细胞的高效生成

摘要

该方案简化了逆转录病毒载体的产生和小鼠T细胞的转导，促进了小鼠CAR-T细胞的高效生成。

摘要

利用嵌合抗原受体（CAR）-T细胞的工程细胞疗法在血液系统恶性肿瘤患者中取得了显着的疗效，目前正在开发用于治疗各种实体瘤。到目前为止，新型CAR-T细胞产品的初步评估主要在使用免疫缺陷小鼠的异种移植肿瘤模型中进行。选择这种方法是为了促进人类CAR-T细胞在实验环境中的成功植入。然而，肿瘤和CAR-T细胞来源于同一小鼠品系的同基因小鼠模型允许在功能免疫系统和综合肿瘤微环境（TME）的背景下评估新的CAR技术。此处描述的方案旨在通过提供逆转录病毒转导和 离体 T细胞培养的标准化方法来简化小鼠CAR-T细胞生成过程。本协议中描述的方法可应用于本研究中使用的方法以外的其他CAR构建体，以便在免疫能力系统中对新的CAR技术进行常规评估。

引言

表达嵌合抗原受体 （CAR） 的过继性 T 细胞疗法通过利用适应性免疫系统的力量特异性靶向和消除抗原阳性癌细胞，彻底改变了癌症免疫治疗领域¹。虽然靶向B细胞恶性肿瘤的CAR-T细胞疗法的成功已经得到临床验证，但在动物模型中进行的临床前研究对于开发靶向实体瘤的新型CAR仍然至关重要。然而，到目前为止，在实体瘤适应症中已证明临床疗效有限，并且越来越明显的是，单个临床前模型无法准确预测活体药物的药效学和临床疗效^2,3。因此，研究人员已开始扩大CAR-T细胞产品的临床前研究，分别包括人类和小鼠癌症的异种移植和同基因模型的平行评估。

与异种移植模型不同，异种移植模型将人类肿瘤和T细胞移植到免疫缺陷小鼠中，同基因模型能够在功能免疫系统的背景下检查CAR-T细胞反应。具体来说，携带同基因肿瘤的免疫能力小鼠提供了一个系统来研究过继转移的 T 细胞与环境特异性环境之间的相互作用——包括已知抑制肿瘤微环境 （TME） 中 T 细胞功能的肿瘤相关巨噬细胞 （TAM） 和调节性 T 细胞 （Tregs）^4,5,6

研究方案

所有动物程序均在机构动物护理和使用委员会（哥伦比亚大学，协议AC-AABQ5551和AC-AAAZ4470）的批准下使用体重在20-25克之间的6-8周龄雌性BALB / c或CF57BL / 6小鼠进行。这些动物是从商业来源获得的（见 材料表）。该协议围绕小鼠 T 细胞的“激活后天数”构建，病毒产生从第 -2 天开始。逆转录病毒在初始生产后可以储存在-80°C，并且对于该方案的未来使用，可以从步骤2开始，在第0天分离和激活T细胞。

1. 逆转录病毒载体生产

注意：通过将包装基因分离成两个单独的质粒，使病毒产物具有复制缺陷（参见 材料表），大大降低了重组事件和无意中产生具有复制能力的病毒的可能性。

1. 在转染前一天（第 -2 天程序）准备 Phoenix Eco 细胞。
   1. 使用 30 mL 培养基（Phoenix Eco 培养基，详见表 1）将大约 1 x 10⁷ 个细胞放入 15 cm TC 处理的平板或 T150 培养瓶中。
   2. 在37°C孵育过夜。 18-24小时后，细胞应约70%汇合并均匀分布，以确保高病毒产量而不会过度生长。
      注意：为获得最佳结果，请使用传代率低的细胞，并在接种前一天传代用于病毒生产。在常....

讨论

该方案描述了小鼠T细胞逆转录病毒转导以产生用于 体内 研究的CAR-T细胞所需的步骤和试剂。优化逆转录病毒转导条件可实现稳健的CAR表达，而无需通过超速离心或其他试剂进行病毒浓缩。但是，可以对这种方法进行多种修改。

虽然该协议描述了GFP特异性CAR的示例生成，但这些方法可以适应于生成靶向任何感兴趣的细胞外抗原的小鼠CAR-T细胞。本研究中使用的pMSCV_PGK逆?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 μm filters	MilliporeSigma	SLHVR33RS
1 mL syringe	Fisher Scientific	14-955-450
1.5 mL microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-135
10 mL syringe	BD	14-823-16E
100 μm strainer	Corning	07-201-432
15 cm TC treated cell culture dishes	ThermoFisher Scientific	130183
15 mL conical tubes	Falcon	14-959-70C
40 μm strainer	Corning	07-201-430
50 mL conical tubes	Falcon	14-959-49A
70 μm strainer	Corning	07-201-431
Attune NxT Flow Cytometer	ThermoFisher Scientific
BALB/C, 6-8 week old	Jackson Laboratory	651
B-Mercaptoethanol	Gibco	21985023
Bovine Serum Albumin	GOLDBIO	A-420-500
DMEM Medium	Gibco	11965092
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), without Calcium and Magnesium	Gibco	14-190-250
DynaMag-2 Magnet	Invitrogen	12-321-D
EasySep Magnet	Stemcell Technologies	18000
EasySep Mouse T cell Isolation Kit	Stemcell Technologies	19851
FACS buffer	BD	BDB554657
Fetal bovine serum (FBS)	Corning	MT35011CV
GlutaMAX	Gibco	35-050-061
G-Rex6	Wilson Wolf	80240M
HEPES Buffer Solution	Gibco	15-630-080
Human recombinant IL-15	Miltenyi Biotec	130-095-765
Human recombinant IL-2	Miltenyi Biotec	130-097-748
Human recombinant IL-7	Miltenyi Biotec	130-095-363
Lipofectamine 3000	Invitrogen	L3000008
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140-050
Mouse Anti-CD3 BV421	Biolegend	100228
Mouse Anti-CD3/CD28 Dynabeads	Gibco	11-453-D
Mouse Anti-CD4 BV605	BD	563151
Mouse Anti-CD44 APC	Biolegend	103011
Mouse Anti-CD62L PE-Cy7	Tonbo	SKU 60-0621-U025
Mouse Anti-CD8 APC-Cy7	Tonbo	SKU 25-0081-U025
Nikon Ti2 with Prime 95B camera	Nikon
Non-treated 24 well plates	CytoOne	CC7672-7524
Opti-MEM	Gibco	31-985-062
pCL-Eco	Addgene	#12371
Penicillin/Streptomycin Solution	Gibco	15-070-063
Phoenix Eco cells	ATCC	CRL-3214
pMDG.2	Addgene	#12259
pMSCV_PGK_GFP28z	N/A	Produced by R.LV.
Purified sfGFP	N/A	Produced by R.LV.
RetroNectin ('transduction reagent')	Takara Bio	T100B
RPMI 1640	Gibco	21875
Serological pipette 10 mL	Fisher Scientific	13-678-11E
Serological pipette 25 mL	Fisher Scientific	13-678-11
Serological pipette 5 mL	Fisher Scientific	13-678-11D
Sodium Pyruvate	Gibco	11-360-070
TC-treated 24 well plates	Corning	08-772-1
Trypan blue	Gibco	15-250-061