小鼠嵌合抗原受体（CAR）-T细胞的高效生成

摘要

该方案简化了逆转录病毒载体的产生和小鼠T细胞的转导，促进了小鼠CAR-T细胞的高效生成。

摘要

利用嵌合抗原受体（CAR）-T细胞的工程细胞疗法在血液系统恶性肿瘤患者中取得了显着的疗效，目前正在开发用于治疗各种实体瘤。到目前为止，新型CAR-T细胞产品的初步评估主要在使用免疫缺陷小鼠的异种移植肿瘤模型中进行。选择这种方法是为了促进人类CAR-T细胞在实验环境中的成功植入。然而，肿瘤和CAR-T细胞来源于同一小鼠品系的同基因小鼠模型允许在功能免疫系统和综合肿瘤微环境（TME）的背景下评估新的CAR技术。此处描述的方案旨在通过提供逆转录病毒转导和 离体 T细胞培养的标准化方法来简化小鼠CAR-T细胞生成过程。本协议中描述的方法可应用于本研究中使用的方法以外的其他CAR构建体，以便在免疫能力系统中对新的CAR技术进行常规评估。

引言

表达嵌合抗原受体 （CAR） 的过继性 T 细胞疗法通过利用适应性免疫系统的力量特异性靶向和消除抗原阳性癌细胞，彻底改变了癌症免疫治疗领域¹。虽然靶向B细胞恶性肿瘤的CAR-T细胞疗法的成功已经得到临床验证，但在动物模型中进行的临床前研究对于开发靶向实体瘤的新型CAR仍然至关重要。然而，到目前为止，在实体瘤适应症中已证明临床疗效有限，并且越来越明显的是，单个临床前模型无法准确预测活体药物的药效学和临床疗效^2,3。因此，研究人员已开始扩大CAR-T细胞产品的临床前研究，分别包括人类和小鼠癌症的异种移植和同基因模型的平行评估。

与异种移植模型不同，异种移植模型将人类肿瘤和T细胞移植到免疫缺陷小鼠中，同基因模型能够在功能免疫系统的背景下检查CAR-T细胞反应。具体来说，携带同基因肿瘤的免疫能力小鼠提供了一个系统来研究过继转移的 T 细胞与环境特异性环境之间的相互作用——包括已知抑制肿瘤微环境 （TME） 中 T 细胞功能的肿瘤相关巨噬细胞 （TAM） 和调节性 T 细胞 （Tregs）^4,5,6.此外，同基因模型提供了一个额外的平台来评估靶向、肿瘤外毒性以及 CAR-T 细胞与可能导致其他毒性（包括细胞因子释放综合征）的宿主因子^{的相互作用 7}。

尽管有这些优势，但同基因CAR-T细胞研究的数量仍然有限。值得注意的是，同基因模型需要对来自同一小鼠品系的 CAR-T 细胞进行自体工程改造，因此由于缺乏高效的小鼠 T 细胞转导和离体扩增的方法，因此提出了额外的挑战 ^2,8。该协议概述了通过产生逆转录病毒载体和优化的T细胞转导来实现稳定CAR表达的方法。整个过程的示意图如图1所示。这种方法的使用证明了小鼠CAR-T细胞的有效逆转录病毒转导，并且无需通过超速离心实现高CAR表达，而无需病毒浓缩。除了其他转基因的共表达外，还讨论了改变CAR构建体抗原特异性的策略。

研究方案

所有动物程序均在机构动物护理和使用委员会（哥伦比亚大学，协议AC-AABQ5551和AC-AAAZ4470）的批准下使用体重在20-25克之间的6-8周龄雌性BALB / c或CF57BL / 6小鼠进行。这些动物是从商业来源获得的（见 材料表）。该协议围绕小鼠 T 细胞的"激活后天数"构建，病毒产生从第 -2 天开始。逆转录病毒在初始生产后可以储存在-80°C，并且对于该方案的未来使用，可以从步骤2开始，在第0天分离和激活T细胞。

1. 逆转录病毒载体生产

注意:通过将包装基因分离成两个单独的质粒，使病毒产物具有复制缺陷（参见 材料表），大大降低了重组事件和无意中产生具有复制能力的病毒的可能性。

1. 在转染前一天（第 -2 天程序）准备 Phoenix Eco 细胞。
   1. 使用 30 mL 培养基（Phoenix Eco 培养基，详见表 1）将大约 1 x 10⁷ 个细胞放入 15 cm TC 处理的平板或 T150 培养瓶中。
   2. 在37°C孵育过夜。 18-24小时后，细胞应约70%汇合并均匀分布，以确保高病毒产量而不会过度生长。
      注意:为获得最佳结果，请使用传代率低的细胞，并在接种前一天传代用于病毒生产。在常规培养过程中，不要让Phoenix Eco细胞过度生长。
2. 在还原血清培养基中制备含有脂质转染和增强子试剂、pCL-Eco （Gag/Pol） 和 pMSCV 表达质粒 （pMSCV_PGK_mGFP28z） 的转染混合物（参见 材料表）（第 -1 天程序）。
   注意:共转染应以 pMSCV 和 pCL-Eco 的 1:1 比例进行。
   1. 准备试管 A:每 15 cm 板将 105 μL 转染试剂稀释在 3.75 mL 还原血清培养基中，并通过涡旋或上下移液充分混合。
   2. 准备管B:用90μL增强剂试剂将pMSCV表达质粒（21μg）和pCL-Eco（21μg）稀释到每15cm板3.75mL还原血清培养基中。通过上下移液充分混合。
      注意:如果产生多种病毒产物，请设置含有 pCL-Eco 和增强剂试剂的预混液。
   3. 将试管 A 加入试管 B 中，用移液管充分混合。在室温下孵育 10-20 分钟，总体积约为 7.5 mL。
   4. 小心地从 Phoenix Eco 培养板中取出 10 mL 细胞培养基，并通过倾斜板和滴液将整个体积的转染混合物添加到剩余的培养基中。将细胞送回37°C培养箱。
3. 在转染后16-20小时（第0天程序）更换转染的Phoenix Eco细胞上的培养基。
   1. 使用水或珠浴将不含β巯基乙醇的血清和-巯基乙醇（2-ME，参见 材料表）的鼠T细胞培养基（mTCM-病毒收获，如 表1所示）预热至37°C。
   2. 倾斜平板并将移液器吸头放在底角，小心地取出Phoenix Eco培养基，如果可能的话，使用真空吸尘器。避免细胞过度干燥。
   3. 通过在最慢的设置下移液 30 mL，将加热的 mTCM 病毒收获培养基轻轻加入倾斜板的侧面。将细胞送回37°C培养箱。
      注意:此步骤会导致Phoenix Eco细胞从平板上脱落并降低病毒滴度。预热的培养基和轻柔的移液将最大限度地减少干扰。
4. 转染后48小时收获病毒上清液（第1天程序）。
   1. 收获病毒上清液并通过0.45μmPVDF过滤器过滤（参见 材料表）以去除细胞和碎片。分装并在-80°C下冷冻病毒，如果使用新鲜病毒，则直接进行到步骤3的第1天。
   2. 如前所述，通过流式细胞术测定病毒滴度（转导单位/mL）⁹。此步骤是可选的。
      1. 通过在非组织培养 （TC） 处理的 96 孔板中小规模转导 1 x 10⁵ 个活化的小鼠 T 细胞，预涂有逆转录肾素（参见 材料表）并在最终体积为 100 μL 的 mTCM 病毒收获培养基中加载三倍连续稀释的逆转录病毒上清液来测定病毒滴度。
         注意:有关 T 细胞分离、活化和转导的详细说明，请参阅下面的步骤 2 和步骤 3。
      2. 通过流式细胞术在转导后 4-5 天测定 CAR 表面表达。
      3. 根据公式¹⁰计算病毒滴度:（N x F x D）/V，其中N是转导的细胞数，F是CAR阳性细胞的频率，D是稀释因子，V是以mL为单位的转导体积，得到转导单位（TU）/mL。
         注意:冻融时病毒滴度可能会降低;因此，理想情况下，病毒滴度是在冷冻并随后解冻的病毒上测定的。

2. 小鼠T细胞分离

1. 分离并激活小鼠 T 细胞（第 0 天程序）。
   注意:这些步骤可以在室温（RT）或4°C下进行，并且应在无菌环境中进行。
   1. 如前所述，从感兴趣的小鼠品系（例如，Balb / c，C57BL / 6）中收获脾脏¹¹ ，并通过机械解离获得单细胞悬浮液。
   2. 使用无菌注射器的背面，通过 70-100 μm 细胞过滤器将脾脏粉碎到 50 mL 锥形管中。
   3. 将注射器放在一边后，用 5 mL T 细胞分离缓冲液（磷酸盐缓冲盐水，PBS，补充有 2% 胎牛血清，FBS）洗涤过滤器。
   4. 重复糖化步骤，然后用 5 mL T 细胞分离缓冲液再次洗涤过滤器。用 T 细胞分离缓冲液将最终体积降至 50 mL。
   5. 使用手动血细胞计数器或自动细胞计数器以 1:20 的比例稀释，然后以 1:1 的比例与台盼蓝混合，对活细胞进行计数。
   6. 通过在4°C（或RT）下以450× g离心10分钟来沉淀细胞，如果使用推荐的T细胞分离试剂盒，则以1×108^/ mL重悬脾细胞（参见 材料表）。
      注意:在这个阶段，可以通过40-70μm过滤器重新过滤脾细胞以去除团块。
2. 按照制造商的说明通过阴性选择分离CD3 ⁺ T细胞（参见 材料表）。磁分离后，将分离物转移到 15 mL 锥形管中并进行最终活细胞计数。
3. 通过在4°C（或RT）下以450× g离心10分钟的方式沉淀分离的T细胞，并将其以1×106^/ mL重悬于mTCM活化培养基中（表1）。
4. 通过以 25 μL/1 x 10⁶ 个 T 细胞和 100 U/mL IL-2 的比例加入小鼠抗 CD3/抗 CD28 单克隆抗体包被磁珠（参见材料表）来激活 T 细胞。
5. 将细胞置于37°C的培养箱中，并放置过夜。
   注意:由于 T 细胞的体积小，可以通过以 1:10-1:20 的比例稀释并以 1:1 的比例与台盼蓝混合以使用血细胞计数器进行手动计数来实现更准确的活 T 细胞计数。纯度可以通过流式细胞术通过用荧光偶联的 αCD3 抗体对细胞进行染色来确定。每个脾脏将产生 7-10 x 10⁶ 个 T 细胞，具体取决于小鼠的年龄和品系。

3. 小鼠T细胞转导

1. 准备用于转导的板（第 0 天程序）。
   1. 用0.5mL人纤连蛋白转导增强剂试剂（参见 材料表）预涂未经处理的无菌24孔板，终浓度为20-40μg/ mL，将其稀释在无菌PBS中，并在4°C下储存过夜。
      注意:该步骤也可以在第 1 天通过用转导试剂包被未处理的 24 孔板并在室温下孵育 2 小时来执行。
2. 进行 T 细胞转导（第 1 天程序）。
   1. 准备用于转导的预涂层板。从预包被的24孔板的每个孔中取出转导试剂，并在室温下用等体积的无菌过滤PBS + 2%牛血清白蛋白（BSA）（0.5mL）封闭30分钟。
   2. 用 0.5-1 mL PBS 洗涤一次。
3. 将来自步骤1的0.5-1mL纯逆转录病毒或根据病毒滴度稀释到每个预包被孔中，并在2,000× g 和32°C下离心90分钟。
4. 向每个病毒加载的孔中加入1mL活化的T细胞，并在450× g 和32°C下离心10分钟。 将细胞送回37°C培养箱过夜。
5. 转导后24小时，除去1-1.5mL细胞培养基，并用1-1.5mL mTCM完全和10ng / mL重组人IL-7和IL-15代替（见 材料表）。将细胞返回至37°C培养箱（第2天程序）。
   注意:在 离体 培养期间，必须每 48 小时向培养物中加入 10 ng/mL 细胞因子，并且 T 细胞不应稀释超过 1 x 10⁶/mL。
6. 转导后48小时，将细胞从转导板转移到新鲜的24孔或6孔板中，并将细胞返回到37°C培养箱（第3天程序）。
   注意:T细胞活力可以通过在转导后24小时至2天转移细胞来改善，具体取决于起始T细胞活力和病毒滴度。
7. 去除 T 细胞并确认 CAR 表达（第 5-6 天程序）。
   1. 彻底重悬细胞以将活化的T细胞从αCD3 / CD28包被的珠子上解离（参见 材料表），并将细胞悬浮液放在磁铁上30秒。将细胞悬液转移到所需的 离体 培养容器中，并将其返回到37°C培养箱中。
      注意:T细胞可以在培养瓶或深孔培养板中培养。建议在 6 孔规格板的深孔中，每孔在 30 mL mTCM 完全培养基中平板至少 5 x 10⁶ 个 T 细胞（参见 材料表）。
   2. 通过流式细胞术^{测定 CAR 表达 8}.
      注意:GFP-CAR表达通过与100 ng/mL纯化的GFP孵育来测定。掺入 N 端表位标签将有助于检测替代 CAR 构建体。
8. 进行CAR-T细胞 的体外 培养（第7-10天程序）。
   1. 在 离体 培养期间，通过去除 50% 的培养基并每 48 小时用新鲜的 mTCM-complete + 2x 10 ng/mL 的 IL-7 和 IL-15 代替来维持细胞。
      注意:小鼠CAR-T细胞在活化后7天即可用于下游应用，由于解冻后活力差，不应冷冻保存。

结果

这里描述的方案旨在标准化小鼠T细胞转导产生小鼠CAR-T细胞的过程。 图 1 提供了所涉及步骤的详细说明。该过程始于 通过 将病毒成分共转染到 Phoenix Eco 细胞中来生产逆转录病毒载体。 图 2 显示了转染当天 Phoenix Eco 细胞的最佳密度图像。然后，在转染后24小时或本方案的"第0天"激活分离的T细胞，为第1天的转导做准备。转导后，CAR-T细胞在重组?...

讨论

该方案描述了小鼠T细胞逆转录病毒转导以产生用于 体内 研究的CAR-T细胞所需的步骤和试剂。优化逆转录病毒转导条件可实现稳健的CAR表达，而无需通过超速离心或其他试剂进行病毒浓缩。但是，可以对这种方法进行多种修改。

虽然该协议描述了GFP特异性CAR的示例生成，但这些方法可以适应于生成靶向任何感兴趣的细胞外抗原的小鼠CAR-T细胞。本研究中使用的pMSCV_PGK逆?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 μm filters	MilliporeSigma	SLHVR33RS
1 mL syringe	Fisher Scientific	14-955-450
1.5 mL microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-135
10 mL syringe	BD	14-823-16E
100 μm strainer	Corning	07-201-432
15 cm TC treated cell culture dishes	ThermoFisher Scientific	130183
15 mL conical tubes	Falcon	14-959-70C
40 μm strainer	Corning	07-201-430
50 mL conical tubes	Falcon	14-959-49A
70 μm strainer	Corning	07-201-431
Attune NxT Flow Cytometer	ThermoFisher Scientific
BALB/C, 6-8 week old	Jackson Laboratory	651
B-Mercaptoethanol	Gibco	21985023
Bovine Serum Albumin	GOLDBIO	A-420-500
DMEM Medium	Gibco	11965092
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), without Calcium and Magnesium	Gibco	14-190-250
DynaMag-2 Magnet	Invitrogen	12-321-D
EasySep Magnet	Stemcell Technologies	18000
EasySep Mouse T cell Isolation Kit	Stemcell Technologies	19851
FACS buffer	BD	BDB554657
Fetal bovine serum (FBS)	Corning	MT35011CV
GlutaMAX	Gibco	35-050-061
G-Rex6	Wilson Wolf	80240M
HEPES Buffer Solution	Gibco	15-630-080
Human recombinant IL-15	Miltenyi Biotec	130-095-765
Human recombinant IL-2	Miltenyi Biotec	130-097-748
Human recombinant IL-7	Miltenyi Biotec	130-095-363
Lipofectamine 3000	Invitrogen	L3000008
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140-050
Mouse Anti-CD3 BV421	Biolegend	100228
Mouse Anti-CD3/CD28 Dynabeads	Gibco	11-453-D
Mouse Anti-CD4 BV605	BD	563151
Mouse Anti-CD44 APC	Biolegend	103011
Mouse Anti-CD62L PE-Cy7	Tonbo	SKU 60-0621-U025
Mouse Anti-CD8 APC-Cy7	Tonbo	SKU 25-0081-U025
Nikon Ti2 with Prime 95B camera	Nikon
Non-treated 24 well plates	CytoOne	CC7672-7524
Opti-MEM	Gibco	31-985-062
pCL-Eco	Addgene	#12371
Penicillin/Streptomycin Solution	Gibco	15-070-063
Phoenix Eco cells	ATCC	CRL-3214
pMDG.2	Addgene	#12259
pMSCV_PGK_GFP28z	N/A	Produced by R.LV.
Purified sfGFP	N/A	Produced by R.LV.
RetroNectin ('transduction reagent')	Takara Bio	T100B
RPMI 1640	Gibco	21875
Serological pipette 10 mL	Fisher Scientific	13-678-11E
Serological pipette 25 mL	Fisher Scientific	13-678-11
Serological pipette 5 mL	Fisher Scientific	13-678-11D
Sodium Pyruvate	Gibco	11-360-070
TC-treated 24 well plates	Corning	08-772-1
Trypan blue	Gibco	15-250-061