Generazione efficiente di cellule T del recettore chimerico murino dell'antigene (CAR)-T

Riepilogo

Questo protocollo semplifica la produzione di vettori retrovirali e la trasduzione delle cellule T murine, facilitando la generazione efficiente di cellule CAR-T di topo.

Abstract

Le terapie cellulari ingegnerizzate che utilizzano cellule T del recettore chimerico dell'antigene (CAR)-T hanno raggiunto una notevole efficacia in individui con neoplasie ematologiche e sono attualmente in fase di sviluppo per il trattamento di diversi tumori solidi. Finora, la valutazione preliminare di nuovi prodotti a base di cellule CAR-T ha avuto luogo prevalentemente in modelli tumorali xenotrapiantati utilizzando topi immunodeficienti. Questo approccio è stato scelto per facilitare il successo dell'attecchimento delle cellule CAR-T umane in ambito sperimentale. Tuttavia, i modelli murini singetici, in cui i tumori e le cellule CAR-T derivano dallo stesso ceppo murino, consentono di valutare le nuove tecnologie CAR nel contesto di un sistema immunitario funzionale e di un microambiente tumorale completo (TME). Il protocollo qui descritto mira a semplificare il processo di generazione di cellule CAR-T di topo presentando metodi standardizzati per la trasduzione retrovirale e la coltura di cellule T ex vivo . I metodi descritti in questo protocollo possono essere applicati ad altri costrutti CAR oltre a quelli utilizzati in questo studio per consentire la valutazione di routine di nuove tecnologie CAR in sistemi immuno-competenti.

Introduzione

Le terapie adottive con cellule T che esprimono recettori chimerici dell'antigene (CAR) hanno rivoluzionato il campo dell'immunoterapia del cancro sfruttando la potenza del sistema immunitario adattativo per colpire ed eliminare in modo specifico le cellule tumorali positive all'antigene¹. Mentre il successo delle terapie cellulari CAR-T mirate alle neoplasie a cellule B è stato clinicamente convalidato, gli studi preclinici eseguiti su modelli animali rimangono vitali per lo sviluppo di nuove CAR mirate ai tumori solidi. Tuttavia, finora è stata dimostrata un'efficacia clinica limitata nelle indicazioni per i tumori solidi e sta diventando sempre più evidente che i singoli modelli preclinici non predicono con precisione la farmacodinamica e l'efficacia clinica di un farmaco vivente ^2,3. Pertanto, i ricercatori hanno iniziato ad espandere lo studio preclinico dei prodotti a base di cellule CAR-T per includere valutazioni parallele in modelli xenotrapianti e singenici di tumori umani e murini, rispettivamente.

A differenza dei modelli di xenotrapianto, in cui i tumori umani e le cellule T vengono innestati in topi immunodeficienti, i modelli singenici consentono di esaminare le risposte delle cellule CAR-T nel contesto di un sistema immunitario funzionale. In particolare, i topi immunocompetenti portatori di tumori singenici forniscono un sistema per studiare l'interazione tra le cellule T trasferite adottivamente e gli ambienti specifici del contesto, compresi i macrofagi associati al tumore (TAM) e le cellule T regolatorie (Treg) note per sopprimere la funzione delle cellule T nel microambiente tumorale (TME)^4,5,6. Inoltre, i modelli singenici offrono un'ulteriore piattaforma per valutare la tossicità on-target, off-tumor e l'interazione delle cellule CAR-T con i fattori dell'ospite che possono portare a tossicità aggiuntive, tra cui la sindrome da rilascio di citochine⁷.

Nonostante questi vantaggi, il numero di studi singenici sulle cellule CAR-T rimane limitato. In particolare, i modelli singenici richiedono l'ingegnerizzazione autologa di cellule CAR-T dello stesso ceppo murino e quindi presentano un'ulteriore sfida a causa della mancanza di una metodologia per un'efficiente trasduzione delle cellule T murine e l'espansione ex vivo ^2,8. Questo protocollo delinea i metodi per ottenere un'espressione stabile di CAR attraverso la produzione di vettori retrovirali e la trasduzione ottimizzata delle cellule T. Uno schema dell'intero processo è mostrato nella Figura 1. L'uso di questo approccio dimostra un'efficiente trasduzione retrovirale delle cellule CAR-T murine e il raggiungimento di un'elevata espressione di CAR senza la necessità di concentrazione virale attraverso l'ultracentrifugazione. Vengono discusse le strategie per modificare la specificità dell'antigene del costrutto CAR in aggiunta alla co-espressione di ulteriori transgeni.

Protocollo

Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite con l'approvazione dell'Institutional Animal Care and Use Committee (Columbia University, protocolli AC-AABQ5551 e AC-AAAZ4470) utilizzando topi femmine BALB/c o CF57BL/6 di 6-8 settimane di peso compreso tra 20 e 25 g. Gli animali sono stati ottenuti da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali). Questo protocollo è strutturato intorno ai "giorni post-attivazione" delle cellule T murine e la produzione virale inizia il giorno -2. Il retrovirus può essere conservato a -80 °C dopo la produzione iniziale e, per l'uso futuro di questo protocollo, si può iniziare con la fase 2, l'isolamento e l'attivazione delle cellule T il giorno 0.

1. Produzione di vettori retrovirali

NOTA: I prodotti virali sono stati resi difettosi di replicazione dalla separazione dei geni di impacchettamento in due plasmidi separati (vedi Tabella dei materiali), riducendo notevolmente la probabilità di eventi di ricombinazione e di produzione involontaria di virus competente per la replicazione.

1. Preparare le celle Phoenix Eco un giorno prima della trasfezione (procedura Giorno -2).
   1. Piastra di circa 1 x 10⁷ cellule in una piastra da 15 cm trattata con TC o in un pallone di coltura T150, utilizzando 30 mL di terreno di coltura (terreno di coltura Phoenix Eco, come descritto nella Tabella 1).
   2. Incubare per una notte a 37 °C. Dopo 18-24 ore, le cellule dovrebbero essere confluenti per circa il 70% e distribuite uniformemente per garantire un'elevata resa virale senza crescita eccessiva.
      NOTA: Per risultati ottimali, utilizzare cellule con un passaggio basso e passarle il giorno prima della placcatura per la produzione virale. Non permettere alle cellule Phoenix Eco di crescere eccessivamente durante la coltura di routine.
2. Preparare la miscela di trasfezione contenente i reagenti di lipofecazione e enhancer, pCL-Eco (Gag/Pol) e plasmide di espressione pMSCV (pMSCV_PGK_mGFP28z) in terreni a siero ridotto (vedere Tabella dei materiali) (procedura Giorno -1).
   NOTA: La co-trasfezione deve essere eseguita con un rapporto 1:1 di pMSCV e pCL-Eco.
   1. Preparare la provetta A: diluire 105 μL del reagente di trasfezione in 3,75 mL di terreno sierico ridotto per piastra da 15 cm e mescolare accuratamente mediante vortex o pipettaggio su e giù.
   2. Preparare la provetta B: diluire il plasmide di espressione di pMSCV (21 μg) e pCL-Eco (21 μg) con 90 μL di reagente enhancer in 3,75 mL di terreno sierico ridotto per piastra da 15 cm. Mescolare bene pipettando su e giù.
      NOTA: Se si generano più prodotti virali, impostare una miscela master contenente pCL-Eco e il reagente enhancer.
   3. Aggiungere la provetta A alla provetta B e mescolare accuratamente mediante pipettaggio. Incubare per 10-20 minuti a temperatura ambiente, ottenendo un volume totale di circa 7,5 mL.
   4. Rimuovere con cautela 10 mL di terreno di coltura cellulare dalle piastre Phoenix Eco e aggiungere l'intero volume della miscela di trasfezione ai terreni rimanenti inclinando la piastra e pipettando in senso goccia. Riportare le cellule in un incubatore a 37 °C.
3. Sostituire il terreno sulle celle Phoenix Eco trasfettate 16-20 ore dopo la trasfezione (procedura Giorno 0).
   1. Siero preriscaldato e terreno di cellule T murine prive di β-mercaptoetanolo (2-ME, vedere Tabella dei materiali) (raccolta virale mTCM, come elencato nella Tabella 1) a 37 °C utilizzando un bagno in acqua o in microsfere.
   2. Rimuovere con cautela il terreno di coltura Phoenix Eco inclinando la piastra e posizionando il puntale della pipetta nell'angolo inferiore, se possibile con l'aspirapolvere. Evitare di essiccare eccessivamente le cellule.
   3. Aggiungere delicatamente il terreno di raccolta virale mTCM riscaldato sul lato della piastra inclinata pipettando 30 mL con l'impostazione più lenta. Riportare le cellule in un incubatore a 37 °C.
      NOTA: Questo passaggio può causare il distacco delle cellule Phoenix Eco dalla piastra e ridurre i titoli virali. I terreni preriscaldati e il pipettaggio delicato ridurranno al minimo le interruzioni.
4. Prelevare il surnatante virale 48 ore dopo la trasfezione (procedura del giorno 1).
   1. Raccogliere il surnatante virale e filtrarlo attraverso filtri in PVDF da 0,45 μm (vedere la tabella dei materiali) per rimuovere cellule e detriti. Aliquotare e congelare il virus a -80 °C o procedere direttamente al Giorno 1 della fase 3 se si utilizza un virus fresco.
   2. Determinare il titolo virale (unità trasduttrici/mL) mediante citometria a flusso, come descritto in precedenza⁹. Questo passaggio è facoltativo.
      1. Determinare il titolo virale mediante trasduzione su piccola scala di 1 x 10⁵ cellule T murine attivate in piastre a 96 pozzetti non trattate con colture tissutali (TC), pre-rivestite con retronectina (vedere Tabella dei materiali) e caricate con tre diluizioni seriali di surnatante retrovirale in un volume finale di 100 μL di terreno di raccolta virale mTCM.
         NOTA: Vedere i passaggi 2 e 3 di seguito per istruzioni dettagliate sull'isolamento, l'attivazione e la trasduzione delle cellule T.
      2. Determinare l'espressione superficiale di CAR 4-5 giorni dopo la trasduzione mediante citometria a flusso.
      3. Calcolare il titolo virale secondo la formula¹⁰: (N x F x D)/V, dove N è il numero di cellule trasdotte, F è la frequenza delle cellule CAR-positive, D è il fattore di diluizione e V è il volume di trasduzione in mL per ottenere le unità di trasduzione (TU)/mL.
         NOTA: Il titolo virale può diminuire in caso di congelamento/scongelamento; Pertanto, il titolo virale è idealmente determinato sul virus congelato e successivamente scongelato.

2. Isolamento delle cellule T murine

1. Isolare e attivare le cellule T murine (procedura del giorno 0).
   NOTA: Questi passaggi possono essere eseguiti a temperatura ambiente (RT) o 4 °C e devono essere eseguiti in un ambiente sterile.
   1. Prelevare la milza dal ceppo murino di interesse (ad esempio, Balb/c, C57BL/6) come descritto in precedenza¹¹ e ottenere una sospensione unicellulare attraverso la dissociazione meccanica.
   2. Utilizzando il dorso di una siringa sterile, schiacciare la milza attraverso un colino cellulare da 70-100 μm in una provetta conica da 50 ml.
   3. Dopo aver messo da parte la siringa, lavare il colino con 5 mL di tampone per l'isolamento delle cellule T (soluzione salina tamponata con fosfato, PBS, integrata con siero fetale bovino al 2%, FBS).
   4. Ripetere la fase di ammostamento e lavare nuovamente il colino con 5 ml di tampone di isolamento delle cellule T. Portare il volume finale a 50 mL con tampone di isolamento delle cellule T.
   5. Contare le cellule vive utilizzando un emocitometro manuale o un contatore automatico di cellule diluendo in un rapporto 1:20 e quindi mescolando a 1:1 con il blu di tripano.
   6. Pellet le cellule mediante centrifugazione per 10 minuti a 450 x g, a 4 °C (o RT) e risospendere gli spleenociti a 1 x 10⁸/mL se si utilizza il kit di isolamento delle cellule T raccomandato (vedere la tabella dei materiali).
      NOTA: In questa fase, gli spleenociti possono essere nuovamente filtrati attraverso un colino da 40-70 μm per rimuovere i grumi.
2. Isolare le cellule T CD3⁺ mediante selezione negativa seguendo le istruzioni del produttore (vedere la tabella dei materiali). Dopo la separazione magnetica, trasferire l'isolato in una provetta conica da 15 mL ed eseguire un conteggio finale delle cellule vive.
3. Pellet le cellule T isolate mediante centrifugazione per 10 minuti a 450 x g, a 4 °C (o RT), e risospenderle a 1 x 10⁶/mL in terreno di attivazione mTCM (Tabella 1).
4. Attivare le cellule T aggiungendo microsfere magnetiche rivestite di anticorpi monoclonali murini anti-CD3/anti-CD28 (vedi Tabella dei materiali) in un rapporto di 25 μL/1 x 10 cellule T⁶ e 100 U/mL di IL-2.
5. Mettere le cellule in un'incubatrice a 37 °C e lasciarle per una notte.
   NOTA: A causa delle piccole dimensioni delle cellule T, è possibile ottenere una conta delle cellule T vive più accurata diluendo in un rapporto 1:10-1:20 e mescolando a 1:1 con blu di tripano per il conteggio manuale utilizzando un emocitometro. La purezza può essere determinata mediante citometria a flusso colorando le cellule con un anticorpo αCD3 coniugato con fluorescenza. Ogni milza produrrà tra 7-10 x 10 cellule 6 T a seconda dell'età e del ceppo del topo.

3. Trasduzione delle cellule T murine

1. Preparare le piastre per la trasduzione (procedura Giorno 0).
   1. Pre-rivestire piastre sterili a 24 pozzetti non trattate con 0,5 mL di reagente potenziatore della trasduzione della fibronectina umana (vedere Tabella dei materiali) a una concentrazione finale di 20-40 μg/mL diluendole in PBS sterile e conservare a 4 °C per una notte.
      NOTA: Questo passaggio può essere eseguito anche il giorno 1 rivestendo le piastre a 24 pozzetti non trattate con il reagente di trasduzione e incubandole a temperatura ambiente per 2 ore.
2. Eseguire la trasduzione delle cellule T (procedura del giorno 1).
   1. Preparare la piastra preverniciata per la trasduzione. Rimuovere il reagente di trasduzione da ciascun pozzetto della piastra prerivestita a 24 pozzetti e bloccare con un volume equivalente di PBS filtrato sterile + 2% di albumina sierica bovina (BSA) (0,5 mL) per 30 minuti a RT.
   2. Lavare una volta con 0,5-1 mL di PBS.
3. Aggiungere 0,5-1 mL di retrovirus puro della fase 1 o diluito in base al titolo virale a ciascun pozzetto pre-rivestito e centrifugare per 90 minuti a 2.000 x g e 32 °C.
4. Aggiungere 1 mL di cellule T attivate a ciascun pozzetto caricato viralmente e centrifugare per 10 minuti a 450 x g e 32 °C. Rimettere le cellule in un incubatore a 37 °C per una notte.
5. 24 ore dopo la trasduzione, rimuovere 1-1,5 mL di terreno di coltura cellulare e sostituirlo con 1-1,5 mL di mTCM-completo e 10 ng/mL di IL-7 e IL-15 umane ricombinanti (vedi Tabella dei materiali). Riportare le cellule in un incubatore a 37 °C (procedura Giorno 2).
   NOTA: Durante la coltura ex vivo , 10 ng/mL di citochine devono essere aggiunti alla coltura ogni 48 ore e le cellule T non devono essere diluite oltre 1 x 10⁶/mL.
6. 48 ore dopo la trasduzione, trasferire le cellule dalla piastra di trasduzione in una piastra fresca da 24 o 6 pozzetti e riportare le cellule in un incubatore a 37 °C (procedura Giorno 3).
   NOTA: La vitalità delle cellule T può migliorare trasferendo le cellule da 24 ore a 2 giorni dopo la trasduzione, a seconda della vitalità iniziale delle cellule T e del titolo virale.
7. De-bead le cellule T e confermare l'espressione di CAR (procedura del giorno 5-6).
   1. Risospendere accuratamente le cellule per dissociare le cellule T attivate dalle perle rivestite di αCD3/CD28 (vedere la tabella dei materiali) e posizionare la sospensione cellulare su un magnete per 30 s. Trasferire la sospensione cellulare nel recipiente di coltura ex vivo desiderato e riportarla in un incubatore a 37 °C.
      NOTA: Le cellule T possono essere coltivate in palloni di coltura o piastre di coltura a pozzetti profondi. Si raccomanda di placcare un minimo di 5 x 10 cellule^{T da 6} in 30 mL di terreno completo mTCM per pozzetto in un pozzetto profondo di una piastra in formato 6 pozzetti (vedere Tabella dei materiali).
   2. Determinare l'espressione di CAR mediante citometria a flusso⁸.
      NOTA: L'espressione di GFP-CAR è stata determinata mediante incubazione con 100 ng/mL di GFP purificata. L'incorporazione di un tag epitopo N-terminale faciliterà l'individuazione di costrutti CAR alternativi.
8. Eseguire la coltura ex vivo di cellule CAR-T (procedura 7-10 giorni).
   1. Durante la coltura ex vivo , mantenere le cellule rimuovendo il 50% del terreno di coltura e sostituendolo con mTCM-completo fresco + 2x 10 ng/mL di IL-7 e IL-15 ogni 48 ore.
      NOTA: Le cellule CAR-T murine sono pronte per l'uso nelle applicazioni a valle 7 giorni dopo l'attivazione e non devono essere crioconservate a causa della scarsa vitalità post-scongelamento.

Risultati

Il protocollo qui descritto mira a standardizzare il processo di trasduzione delle cellule T murine per la generazione di cellule CAR-T di topo. La Figura 1 fornisce una descrizione dettagliata dei passaggi necessari. Il processo inizia con la produzione di vettori retrovirali attraverso la co-trasfezione di componenti virali in cellule Phoenix Eco. La Figura 2 fornisce un'immagine della densità ottimale delle celle Phoenix Eco il giorno della trasfezi...

Discussione

Questo protocollo descrive le fasi e i reagenti necessari per la trasduzione retrovirale delle cellule T murine per generare cellule CAR-T per studi in vivo . L'ottimizzazione delle condizioni di trasduzione retrovirale consente di ottenere una robusta espressione di CAR senza la necessità di concentrazione virale attraverso l'ultracentrifugazione o reagenti aggiuntivi. Tuttavia, ci sono diverse modifiche che possono essere applicate a questa metodologia.

Mentre questo protocollo des...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 μm filters	MilliporeSigma	SLHVR33RS
1 mL syringe	Fisher Scientific	14-955-450
1.5 mL microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-135
10 mL syringe	BD	14-823-16E
100 μm strainer	Corning	07-201-432
15 cm TC treated cell culture dishes	ThermoFisher Scientific	130183
15 mL conical tubes	Falcon	14-959-70C
40 μm strainer	Corning	07-201-430
50 mL conical tubes	Falcon	14-959-49A
70 μm strainer	Corning	07-201-431
Attune NxT Flow Cytometer	ThermoFisher Scientific
BALB/C, 6-8 week old	Jackson Laboratory	651
B-Mercaptoethanol	Gibco	21985023
Bovine Serum Albumin	GOLDBIO	A-420-500
DMEM Medium	Gibco	11965092
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), without Calcium and Magnesium	Gibco	14-190-250
DynaMag-2 Magnet	Invitrogen	12-321-D
EasySep Magnet	Stemcell Technologies	18000
EasySep Mouse T cell Isolation Kit	Stemcell Technologies	19851
FACS buffer	BD	BDB554657
Fetal bovine serum (FBS)	Corning	MT35011CV
GlutaMAX	Gibco	35-050-061
G-Rex6	Wilson Wolf	80240M
HEPES Buffer Solution	Gibco	15-630-080
Human recombinant IL-15	Miltenyi Biotec	130-095-765
Human recombinant IL-2	Miltenyi Biotec	130-097-748
Human recombinant IL-7	Miltenyi Biotec	130-095-363
Lipofectamine 3000	Invitrogen	L3000008
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140-050
Mouse Anti-CD3 BV421	Biolegend	100228
Mouse Anti-CD3/CD28 Dynabeads	Gibco	11-453-D
Mouse Anti-CD4 BV605	BD	563151
Mouse Anti-CD44 APC	Biolegend	103011
Mouse Anti-CD62L PE-Cy7	Tonbo	SKU 60-0621-U025
Mouse Anti-CD8 APC-Cy7	Tonbo	SKU 25-0081-U025
Nikon Ti2 with Prime 95B camera	Nikon
Non-treated 24 well plates	CytoOne	CC7672-7524
Opti-MEM	Gibco	31-985-062
pCL-Eco	Addgene	#12371
Penicillin/Streptomycin Solution	Gibco	15-070-063
Phoenix Eco cells	ATCC	CRL-3214
pMDG.2	Addgene	#12259
pMSCV_PGK_GFP28z	N/A	Produced by R.LV.
Purified sfGFP	N/A	Produced by R.LV.
RetroNectin ('transduction reagent')	Takara Bio	T100B
RPMI 1640	Gibco	21875
Serological pipette 10 mL	Fisher Scientific	13-678-11E
Serological pipette 25 mL	Fisher Scientific	13-678-11
Serological pipette 5 mL	Fisher Scientific	13-678-11D
Sodium Pyruvate	Gibco	11-360-070
TC-treated 24 well plates	Corning	08-772-1
Trypan blue	Gibco	15-250-061