Generazione efficiente di cellule T del recettore chimerico murino dell'antigene (CAR)-T

Riepilogo

Questo protocollo semplifica la produzione di vettori retrovirali e la trasduzione delle cellule T murine, facilitando la generazione efficiente di cellule CAR-T di topo.

Abstract

Le terapie cellulari ingegnerizzate che utilizzano cellule T del recettore chimerico dell'antigene (CAR)-T hanno raggiunto una notevole efficacia in individui con neoplasie ematologiche e sono attualmente in fase di sviluppo per il trattamento di diversi tumori solidi. Finora, la valutazione preliminare di nuovi prodotti a base di cellule CAR-T ha avuto luogo prevalentemente in modelli tumorali xenotrapiantati utilizzando topi immunodeficienti. Questo approccio è stato scelto per facilitare il successo dell'attecchimento delle cellule CAR-T umane in ambito sperimentale. Tuttavia, i modelli murini singetici, in cui i tumori e le cellule CAR-T derivano dallo stesso ceppo murino, consentono di valutare le nuove tecnologie CAR nel contesto di un sistema immunitario funzionale e di un microambiente tumorale completo (TME). Il protocollo qui descritto mira a semplificare il processo di generazione di cellule CAR-T di topo presentando metodi standardizzati per la trasduzione retrovirale e la coltura di cellule T ex vivo . I metodi descritti in questo protocollo possono essere applicati ad altri costrutti CAR oltre a quelli utilizzati in questo studio per consentire la valutazione di routine di nuove tecnologie CAR in sistemi immuno-competenti.

Introduzione

Le terapie adottive con cellule T che esprimono recettori chimerici dell'antigene (CAR) hanno rivoluzionato il campo dell'immunoterapia del cancro sfruttando la potenza del sistema immunitario adattativo per colpire ed eliminare in modo specifico le cellule tumorali positive all'antigene¹. Mentre il successo delle terapie cellulari CAR-T mirate alle neoplasie a cellule B è stato clinicamente convalidato, gli studi preclinici eseguiti su modelli animali rimangono vitali per lo sviluppo di nuove CAR mirate ai tumori solidi. Tuttavia, finora è stata dimostrata un'efficacia clinica limitata nelle indicazioni per i tumori solid....

Protocollo

Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite con l'approvazione dell'Institutional Animal Care and Use Committee (Columbia University, protocolli AC-AABQ5551 e AC-AAAZ4470) utilizzando topi femmine BALB/c o CF57BL/6 di 6-8 settimane di peso compreso tra 20 e 25 g. Gli animali sono stati ottenuti da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali). Questo protocollo è strutturato intorno ai "giorni post-attivazione" delle cellule T murine e la produzione virale inizia il giorno -2. Il retrovirus può essere conservato a -80 °C dopo la produzione iniziale e, per l'uso futuro di questo protocollo, si può iniziare con la fase 2, l'isolamento e l'....

Discussione

Questo protocollo descrive le fasi e i reagenti necessari per la trasduzione retrovirale delle cellule T murine per generare cellule CAR-T per studi in vivo . L'ottimizzazione delle condizioni di trasduzione retrovirale consente di ottenere una robusta espressione di CAR senza la necessità di concentrazione virale attraverso l'ultracentrifugazione o reagenti aggiuntivi. Tuttavia, ci sono diverse modifiche che possono essere applicate a questa metodologia.

Mentre questo protocollo des.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 μm filters	MilliporeSigma	SLHVR33RS
1 mL syringe	Fisher Scientific	14-955-450
1.5 mL microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-135
10 mL syringe	BD	14-823-16E
100 μm strainer	Corning	07-201-432
15 cm TC treated cell culture dishes	ThermoFisher Scientific	130183
15 mL conical tubes	Falcon	14-959-70C
40 μm strainer	Corning	07-201-430
50 mL conical tubes	Falcon	14-959-49A
70 μm strainer	Corning	07-201-431
Attune NxT Flow Cytometer	ThermoFisher Scientific
BALB/C, 6-8 week old	Jackson Laboratory	651
B-Mercaptoethanol	Gibco	21985023
Bovine Serum Albumin	GOLDBIO	A-420-500
DMEM Medium	Gibco	11965092
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), without Calcium and Magnesium	Gibco	14-190-250
DynaMag-2 Magnet	Invitrogen	12-321-D
EasySep Magnet	Stemcell Technologies	18000
EasySep Mouse T cell Isolation Kit	Stemcell Technologies	19851
FACS buffer	BD	BDB554657
Fetal bovine serum (FBS)	Corning	MT35011CV
GlutaMAX	Gibco	35-050-061
G-Rex6	Wilson Wolf	80240M
HEPES Buffer Solution	Gibco	15-630-080
Human recombinant IL-15	Miltenyi Biotec	130-095-765
Human recombinant IL-2	Miltenyi Biotec	130-097-748
Human recombinant IL-7	Miltenyi Biotec	130-095-363
Lipofectamine 3000	Invitrogen	L3000008
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140-050
Mouse Anti-CD3 BV421	Biolegend	100228
Mouse Anti-CD3/CD28 Dynabeads	Gibco	11-453-D
Mouse Anti-CD4 BV605	BD	563151
Mouse Anti-CD44 APC	Biolegend	103011
Mouse Anti-CD62L PE-Cy7	Tonbo	SKU 60-0621-U025
Mouse Anti-CD8 APC-Cy7	Tonbo	SKU 25-0081-U025
Nikon Ti2 with Prime 95B camera	Nikon
Non-treated 24 well plates	CytoOne	CC7672-7524
Opti-MEM	Gibco	31-985-062
pCL-Eco	Addgene	#12371
Penicillin/Streptomycin Solution	Gibco	15-070-063
Phoenix Eco cells	ATCC	CRL-3214
pMDG.2	Addgene	#12259
pMSCV_PGK_GFP28z	N/A	Produced by R.LV.
Purified sfGFP	N/A	Produced by R.LV.
RetroNectin ('transduction reagent')	Takara Bio	T100B
RPMI 1640	Gibco	21875
Serological pipette 10 mL	Fisher Scientific	13-678-11E
Serological pipette 25 mL	Fisher Scientific	13-678-11
Serological pipette 5 mL	Fisher Scientific	13-678-11D
Sodium Pyruvate	Gibco	11-360-070
TC-treated 24 well plates	Corning	08-772-1
Trypan blue	Gibco	15-250-061