Эффективная генерация мышиных химерных антигенных рецепторов (CAR)-Т-клеток

Резюме

Этот протокол оптимизирует производство ретровирусных векторов и трансдукцию мышиных Т-клеток, способствуя эффективной генерации мышиных CAR-T-клеток.

Аннотация

Инженерная клеточная терапия с использованием химерных антигенных рецепторов (CAR)-T-клеток достигла замечательной эффективности у пациентов с гематологическими злокачественными новообразованиями и в настоящее время разрабатывается для лечения различных солидных опухолей. До сих пор предварительная оценка новых продуктов CAR-T-клеток проводилась преимущественно на моделях ксенотрансплантатов опухолей с использованием мышей с иммунодефицитом. Этот подход выбран для того, чтобы способствовать успешному приживлению CAR-T-клеток человека в экспериментальных условиях. Тем не менее, сингенные мышиные модели, в которых опухоли и CAR-T-клетки получены из одной и той же линии мышей, позволяют оценивать новые технологии CAR в контексте функциональной иммунной системы и комплексного опухолевого микроокружения (TME). Протокол, описанный здесь, направлен на оптимизацию процесса генерации мышиных CAR-T-клеток путем представления стандартизированных методов ретровирусной трансдукции и культуры ex vivo Т-клеток. Методы, описанные в этом протоколе, могут быть применены к другим конструкциям CAR, помимо тех, которые использовались в данном исследовании, чтобы обеспечить рутинную оценку новых технологий CAR в иммунокомпетентных системах.

Введение

Адоптивная Т-клеточная терапия, экспрессирующая химерные антигенные рецепторы (CAR), произвела революцию в области иммунотерапии рака, используя возможности адаптивной иммунной системы для специфического нацеливания и уничтожения антиген-позитивных раковых^{клеток.} В то время как успех терапии CAR-T-клетками, направленной на злокачественные опухоли В-клеток, был клинически подтвержден, доклинические исследования, проведенные на животных моделях, остаются жизненно важными для разработки новых CAR, нацеленных на солидные опухоли. Тем не менее, до сих пор была продемонстрирована ограниченная клиническая эффективность при солидных опухолях, и становится все более очевидным, что отдельные доклинические модели не могут точно предсказать фармакодинамику и клиническую эффективность живого лекарственного средства ^2,3. Поэтому исследователи начали расширять доклинические исследования продуктов CAR-T-клеток, чтобы включить параллельные оценки в ксенотрансплантатах и сингенных моделях рака человека и мышей соответственно.

В отличие от ксенотрансплантатов, в которых человеческие опухоли и Т-клетки приживаются мышам с иммунодефицитом, сингенные модели позволяют исследовать реакцию CAR-T-клеток в контексте функциональной иммунной системы. В частности, иммунокомпетентные мыши с сингенными опухолями представляют собой систему для изучения взаимодействия между адоптивно перенесенными Т-клетками и контекстно-зависимыми средами, включая опухоль-ассоциированные макрофаги (TAM) и регуляторные Т-клетки (Tregs), которые, как известно, подавляют функцию Т-клеток в опухолевом микроокружении (TME)^4,5,6. Кроме того, сингенные модели предлагают дополнительную платформу для оценки целевой и внеопухолевой токсичности и взаимодействия CAR-T-клеток с факторами хозяина, которые могут приводить к дополнительной токсичности, включая синдром высвобождения цитокинов⁷.

Несмотря на эти преимущества, количество исследований сингенных CAR-T-клеток остается ограниченным. Примечательно, что сингенные модели требуют аутологичной инженерии CAR-T-клеток из одной и той же линии мышей и, таким образом, представляют собой дополнительную проблему из-за отсутствия методологии для эффективной трансдукции мышиных Т-клеток и экспансии ex vivo ^2,8. В этом протоколе описаны методы достижения стабильной экспрессии CAR за счет производства ретровирусных векторов и оптимизированной трансдукции Т-клеток. Схема всего процесса показана на рисунке 1. Использование данного подхода демонстрирует эффективную ретровирусную трансдукцию мышиных CAR-T-клеток и достижение высокой экспрессии CAR без необходимости концентрации вируса с помощью ультрацентрифугирования. Обсуждаются стратегии изменения антиген-специфичности конструкции CAR в дополнение к коэкспрессии дополнительных трансгенов.

протокол

Все процедуры на животных проводились с одобрения Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (Колумбийский университет, протоколы AC-AABQ5551 и AC-AAAZ4470) с использованием 6-8-недельных самок мышей BALB/c или CF57BL/6 весом от 20 до 25 г. Животные были получены из коммерческого источника (см. Таблицу материалов). Этот протокол построен вокруг «дней после активации» мышиных Т-клеток, а выработка вируса начинается на 2-й день. Ретровирус может храниться при температуре -80 °C после первоначального производства, и для будущего использования этого протокола можно начать с шага 2, выделения и активации Т-клеток на 0-й день.

1. Производство ретровирусных векторов

ПРИМЕЧАНИЕ: Вирусные продукты стали дефектными для репликации путем разделения генов-упаковок на две отдельные плазмиды (см. таблицу материалов), что значительно снижает вероятность событий рекомбинации и непреднамеренного образования репликационно-компетентного вируса.

1. Подготовьте клетки Phoenix Eco за день до трансфекции (процедура 2-го дня).
   1. Поместите примерно 1 x 10⁷ клеток в 15-сантиметровую пробирку, обработанную ТС, или колбу для культивирования T150, используя 30 мл питательной среды (питательная среда Phoenix Eco, как подробно описано в таблице 1).
   2. Инкубировать в течение ночи при температуре 37 °C. Через 18-24 ч клетки должны сливаться примерно на 70% и равномерно распределяться, чтобы обеспечить высокий выход вируса без чрезмерного роста.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения оптимальных результатов используйте клетки с низким проходом и проходите их за день до нанесения покрытия на вирусную продукцию. Не допускайте перерастания клеток Phoenix Eco во время рутинного культивирования.
2. Приготовьте трансфекционную смесь, содержащую реагенты для липофектации и энхансера, pCL-Eco (Gag/Pol) и плазмиду экспрессии pMSCV (pMSCV_PGK_mGFP28z) в среде с восстановленной сывороткой (см. Таблицу материалов) (процедура 1-го дня).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Котрансфекцию следует проводить в соотношении 1:1 pMSCV и pCL-Eco.
   1. Подготовьте пробирку А: Разведите 105 мкл реагента для трансфекции в 3,75 мл восстановленной сывороточной среды на 15-сантиметровую пластину и тщательно перемешайте, вихревая или пипетируя вверх и вниз.
   2. Подготовьте пробирку B: разбавьте плазмиду экспрессии pMSCV (21 мкг) и pCL-Eco (21 мкг) 90 мкл реагента-энхансера в 3,75 мл восстановленной сывороточной среды на 15-сантиметровую пластину. Хорошо перемешайте, пипетируя вверх и вниз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы генерируете несколько вирусных продуктов, создайте мастер-смесь, содержащую pCL-Eco и реагент энхансер.
   3. Добавьте пробирку А в пробирку Б и тщательно перемешайте пипеткой. Выдерживают 10-20 мин при комнатной температуре, в результате чего общий объем составляет примерно 7,5 мл.
   4. Осторожно извлеките 10 мл среды для клеточной культуры из планшета (планшетов) Phoenix Eco и добавьте весь объем смеси для трансфекции к оставшейся среде, наклонив планшет и пипетируя по каплям. Верните клетки в инкубатор с температурой 37 °C.
3. Смените среду на трансфицированных клетках Phoenix Eco через 16-20 ч после трансфекции (процедура 0-го дня).
   1. Предварительно нагрейте сыворотку и мышиную Т-клеточную среду без β-меркаптоэтанола (2-ME, см. таблицу материалов) (сбор мТКМ-вируса, как указано в таблице 1) до 37 °C с помощью водяной или шариковой ванны.
   2. Осторожно извлеките питательную среду Phoenix Eco, наклонив пластину и поместив наконечник пипетки в нижний угол, по возможности используя вакуум. Избегайте пересушивания клеток.
   3. Осторожно добавьте подогретую среду для сбора вируса mTCM на боковую сторону наклоненной пластины, пипетируя 30 мл на самой медленной настройке. Верните клетки в инкубатор с температурой 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может привести к отделению клеток Phoenix Eco от планшета и снижению титров вируса. Предварительно нагретый фильтрующий материал и щадящее пипетирование сведут к минимуму перебои в работе.
4. Соберите вирусную надосадочную жидкость через 48 ч после трансфекции (процедура 1-го дня).
   1. Соберите вирусную надосадочную жидкость и отфильтруйте ее через фильтры PVDF 0,45 мкм (см. Таблицу материалов), чтобы удалить клетки и мусор. Аликвотируйте и замораживайте вирус при -80 °C или переходите непосредственно к 1-му дню шага 3, если используете свежий вирус.
   2. Определяют титр вируса (трансдуцирующие единицы/мл) методом проточной цитометрии, как описано ранее⁹. Этот шаг не является обязательным.
      1. Определяют титр вируса путем мелкомасштабной трансдукции 1 x 10,5 активированных мышиных Т-клеток в 96-луночных планшетах, обработанных нетканевой культурой (ТС), предварительно покрытых ретронектином (см. таблицу материалов) и загруженных трехкратными серийными разведениями ретровирусной надосадочной жидкости в конечном объеме 100 мкл среды для сбора мТКМ-вируса.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Подробные инструкции по выделению, активации и трансдукции Т-клеток см. в шагах 2 и 3 ниже.
      2. Определяют поверхностную экспрессию CAR через 4-5 дней после трансдукции методом проточной цитометрии.
      3. Рассчитайте титр вируса по формуле¹⁰: (N x F x D)/V, где N — количество трансдуцированных клеток, F — частота CAR-положительных клеток, D — коэффициент разведения, V — объем трансдукции в мл для получения трансдуцирующих единиц (TU)/мл.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Титр вируса может уменьшаться при замораживании/оттаивании; Поэтому титр вируса в идеале определяется по замороженному, а затем размороженному вирусу.

2. Выделение мышиных Т-клеток

1. Выделение и активация мышиных Т-клеток (процедура 0-го дня).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шаги можно выполнять при комнатной температуре (RT) или 4 °C и следует проводить в стерильной среде.
   1. Возьмите селезенку (селезенки) из интересующего штамма мыши (например, Balb/c, C57BL/6), как описано выше^{, и} получите одноклеточную суспензию путем механической диссоциации.
   2. Используя заднюю часть стерильного шприца, измельчите селезенку (селезенки) через ситечко с клетками 70-100 мкм в коническую пробирку объемом 50 мл.
   3. Отложив шприц в сторону, промойте ситечко 5 мл буфера для выделения Т-клеток (фосфатно-солевой буфер, PBS, дополненный 2% фетальной бычьей сывороткой, FBS).
   4. Повторите этап затирания и еще раз промойте ситечко 5 мл буфера для выделения Т-клеток. Доведите окончательный объем до 50 мл с помощью буфера для выделения Т-клеток.
   5. Подсчитывают живые клетки с помощью ручного гемоцитометра или автоматического счетчика клеток, разбавляя их в соотношении 1:20 и затем смешивая в соотношении 1:1 с трипановым синим.
   6. Гранулируют клетки центрифугированием в течение 10 мин при 450 x g, при 4 °C (или RT) и повторно суспендируют сплиеноциты при концентрации 1 x 10⁸/мл при использовании рекомендованного набора для выделения Т-клеток (см. таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе спленоциты можно повторно процедить через ситечко 40-70 мкм для удаления комков.
2. Изолируйте CD3⁺ Т-клетки методом отрицательного отбора, следуя инструкциям производителя (см. таблицу материалов). После магнитной сепарации переложите изолят в коническую пробирку объемом 15 мл и выполните окончательный подсчет живых клеток.
3. Изолированные Т-клетки гранулируют центрифугированием в течение 10 мин при 450 x g, при 4 °C (или RT) и повторно суспендируют их при 1 x 10⁶/мл в среде активации mTCM (табл. 1).
4. Активируйте Т-клетки, добавляя мышиные магнитные шарики, покрытые моноклональными антителами (см. таблицу материалов) в соотношении 25 мкл/1 x 10⁶ Т-клеток и 100 ед/мл IL-2.
5. Поместите клетки в инкубатор при температуре 37 °C и оставьте на ночь.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за небольшого размера Т-клеток более точное количество живых Т-клеток может быть достигнуто путем разведения в соотношении 1:10-1:20 и смешивания в соотношении 1:1 с трипановым синим для ручного подсчета с помощью гемоцитометра. Чистоту можно определить с помощью проточной цитометрии путем окрашивания клеток флуоресцентно конъюгированным антителом αCD3. Каждая селезенка будет давать от 7 до 10 x 10⁶ Т-клеток в зависимости от возраста и штамма мыши.

3. Мышиная трансдукция Т-клеток

1. Подготовьте пластины для трансдукции (процедура 0-го дня).
   1. Необработанные стерильные 24-луночные планшеты предварительно покрыть 0,5 мл реагента для усиления трансдукции фибронектина человека (см. таблицу материалов) в конечной концентрации 20-40 мкг/мл, разбавив его в стерильном PBS, и хранить при температуре 4 °C в течение ночи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап также можно выполнить на 1-й день, покрыв необработанные 24-луночные планшеты трансдукционным реагентом и инкубируя их при комнатной температуре в течение 2 часов.
2. Провести трансдукцию Т-клеток (процедура 1-го дня).
   1. Подготовьте пластину с предварительно нанесенным покрытием к трансдукции. Извлеките трансдукционный реагент из каждой лунки предварительно покрытой 24-луночной пластины и заблокируйте эквивалентным объемом стерильно отфильтрованного PBS + 2% бычьего сывороточного альбумина (BSA) (0,5 мл) в течение 30 мин при RT.
   2. Промойте один раз 0,5-1 мл PBS.
3. Добавьте 0,5-1 мл чистого ретровируса с этапа 1 или разбавленного в зависимости от титра вируса в каждую лунку с предварительно покрытым покрытием и центрифугу в течение 90 мин при 2000 x g и 32 °C.
4. Добавьте 1 мл активированных Т-клеток в каждую лунку с вирусной нагрузкой и центрифугируйте в течение 10 мин при 450 x g и 32 °C. Верните клетки в инкубатор с температурой 37 °C на ночь.
5. Через 24 ч после трансдукции удаляют 1-1,5 мл клеточной питательной среды и заменяют ее 1-1,5 мл mTCM-complete и 10 нг/мл рекомбинантных человеческих IL-7 и IL-15 (см. таблицу материалов). Верните клетки в инкубатор с температурой 37 °C (процедура 2-го дня).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Во время культивирования ex vivo каждые 48 ч в культуру необходимо добавлять 10 нг/мл цитокинов, а Т-клетки не следует разбавлять более 1 x 10⁶/мл.
6. Через 48 ч после трансдукции перенести клетки из трансдукционной пластины в свежую 24-луночную или 6-луночную планшет и вернуть клетки в инкубатор при температуре 37 °C (процедура 3-го дня).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Жизнеспособность Т-клеток может улучшиться при переносе клеток через 24-2 дня после трансдукции, в зависимости от исходной жизнеспособности Т-клеток и титра вируса.
7. Удалить Т-клетки и подтвердить экспрессию CAR (процедура 5-6 дня).
   1. Тщательно ресуспендируйте клетки, чтобы диссоциировать активированные Т-клетки от гранул, покрытых αCD3/CD28 (см. таблицу материалов), и поместите клеточную суспензию на магнит на 30 с. Перенесите клеточную суспензию в желаемый культуральный сосуд ex vivo и верните его в инкубатор с температурой 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Т-клетки можно культивировать в культуральных колбах или глубоких культуральных планшетах. Рекомендуется помещать не менее 5 x 10⁶ Т-клеток в 30 мл среды mTCM-complete на лунку в глубокой лунке 6-луночного формата (см. таблицу материалов).
   2. Определение экспрессии CAR методом проточной цитометрии⁸.
      Примечание: экспрессию GFP-CAR определяли путем инкубации со 100 нг/мл очищенного GFP. Включение N-концевой метки эпитопа облегчит обнаружение альтернативных конструкций CAR.
8. Провести культивирование ex vivo CAR-T-клеток (процедура 7-10 дня).
   1. Во время культивирования ex vivo поддерживайте клетки, удаляя 50% питательной среды и заменяя ее свежей mTCM-complete + 2x 10 нг/мл IL-7 и IL-15 каждые 48 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мышиные CAR-T-клетки готовы к использованию в последующих приложениях через 7 дней после активации и не должны подвергаться криоконсервации из-за низкой жизнеспособности после оттаивания.

Результаты

Протокол, описанный здесь, направлен на стандартизацию процесса трансдукции мышиных Т-клеток для получения мышиных CAR-T-клеток. На рисунке 1 приведено подробное описание необходимых шагов. Процесс начинается с производства ретровирусных векторов путем котрансфекц...

Обсуждение

Этот протокол описывает этапы и реагенты, необходимые для ретровирусной трансдукции мышиных Т-клеток для получения CAR-T-клеток для исследований in vivo . Оптимизация условий ретровирусной трансдукции позволяет достичь устойчивой экспрессии CAR без необходимости концентрации вируса с...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 μm filters	MilliporeSigma	SLHVR33RS
1 mL syringe	Fisher Scientific	14-955-450
1.5 mL microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-135
10 mL syringe	BD	14-823-16E
100 μm strainer	Corning	07-201-432
15 cm TC treated cell culture dishes	ThermoFisher Scientific	130183
15 mL conical tubes	Falcon	14-959-70C
40 μm strainer	Corning	07-201-430
50 mL conical tubes	Falcon	14-959-49A
70 μm strainer	Corning	07-201-431
Attune NxT Flow Cytometer	ThermoFisher Scientific
BALB/C, 6-8 week old	Jackson Laboratory	651
B-Mercaptoethanol	Gibco	21985023
Bovine Serum Albumin	GOLDBIO	A-420-500
DMEM Medium	Gibco	11965092
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), without Calcium and Magnesium	Gibco	14-190-250
DynaMag-2 Magnet	Invitrogen	12-321-D
EasySep Magnet	Stemcell Technologies	18000
EasySep Mouse T cell Isolation Kit	Stemcell Technologies	19851
FACS buffer	BD	BDB554657
Fetal bovine serum (FBS)	Corning	MT35011CV
GlutaMAX	Gibco	35-050-061
G-Rex6	Wilson Wolf	80240M
HEPES Buffer Solution	Gibco	15-630-080
Human recombinant IL-15	Miltenyi Biotec	130-095-765
Human recombinant IL-2	Miltenyi Biotec	130-097-748
Human recombinant IL-7	Miltenyi Biotec	130-095-363
Lipofectamine 3000	Invitrogen	L3000008
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140-050
Mouse Anti-CD3 BV421	Biolegend	100228
Mouse Anti-CD3/CD28 Dynabeads	Gibco	11-453-D
Mouse Anti-CD4 BV605	BD	563151
Mouse Anti-CD44 APC	Biolegend	103011
Mouse Anti-CD62L PE-Cy7	Tonbo	SKU 60-0621-U025
Mouse Anti-CD8 APC-Cy7	Tonbo	SKU 25-0081-U025
Nikon Ti2 with Prime 95B camera	Nikon
Non-treated 24 well plates	CytoOne	CC7672-7524
Opti-MEM	Gibco	31-985-062
pCL-Eco	Addgene	#12371
Penicillin/Streptomycin Solution	Gibco	15-070-063
Phoenix Eco cells	ATCC	CRL-3214
pMDG.2	Addgene	#12259
pMSCV_PGK_GFP28z	N/A	Produced by R.LV.
Purified sfGFP	N/A	Produced by R.LV.
RetroNectin ('transduction reagent')	Takara Bio	T100B
RPMI 1640	Gibco	21875
Serological pipette 10 mL	Fisher Scientific	13-678-11E
Serological pipette 25 mL	Fisher Scientific	13-678-11
Serological pipette 5 mL	Fisher Scientific	13-678-11D
Sodium Pyruvate	Gibco	11-360-070
TC-treated 24 well plates	Corning	08-772-1
Trypan blue	Gibco	15-250-061