Geração Eficiente de Células T do Receptor de Antígeno Quimérico Murino (CAR)-T

Resumo

Esse protocolo agiliza a produção de vetores retrovirais e a transdução de células T murinas, facilitando a geração eficiente de células CAR-T em camundongos.

Resumo

Terapias celulares projetadas utilizando células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) têm alcançado notável eficácia em indivíduos com neoplasias hematológicas e estão atualmente em desenvolvimento para o tratamento de diversos tumores sólidos. Até o momento, a avaliação preliminar de novos produtos de células CAR-T tem ocorrido predominantemente em modelos tumorais de xenoenxerto usando camundongos imunodeficientes. Esta abordagem é escolhida para facilitar o enxerto bem-sucedido de células CAR-T humanas no ambiente experimental. No entanto, modelos singênicos de camundongos, nos quais tumores e células CAR-T são derivados da mesma linhagem de camundongos, permitem a avaliação de novas tecnologias CAR no contexto de um sistema imunológico funcional e microambiente tumoral abrangente (TME). O protocolo aqui descrito visa agilizar o processo de geração de células CAR-T em camundongos, apresentando métodos padronizados para transdução retroviral e cultura ex vivo de células T. Os métodos descritos neste protocolo podem ser aplicados a outros construtos do CAR além dos utilizados neste estudo para permitir a avaliação rotineira de novas tecnologias do CAR em sistemas imunocompetentes.

Introdução

Terapias com células T que expressam receptores de antígenos quiméricos (CARs) revolucionaram o campo da imunoterapia do câncer, aproveitando o poder do sistema imune adaptativo para atingir e eliminar especificamente células cancerosas antígeno-positivas¹. Embora o sucesso das terapias com células CAR-T visando malignidades de células B tenha sido clinicamente validado, estudos pré-clínicos realizados em modelos animais permanecem vitais para o desenvolvimento de novos CARs direcionados a tumores sólidos. No entanto, a eficácia clínica limitada tem sido demonstrada em indicações de tumores sólidos até o momento, e está se tornando cada vez mais evidente que modelos pré-clínicos individuais não predizem com precisão a farmacodinâmica e a eficácia clínica de um medicamento vivo ^2,3. Portanto, os pesquisadores começaram a expandir o estudo pré-clínico de produtos de células CAR-T para incluir avaliações paralelas em modelos de xenoenxerto e singênicos de cânceres humanos e murinos, respectivamente.

Ao contrário dos modelos de xenoenxerto, em que tumores humanos e células T são enxertadas em camundongos imunodeficientes, os modelos singênicos permitem o exame das respostas das células CAR-T no contexto de um sistema imunológico funcional. Especificamente, camundongos imunocompetentes portadores de tumores singênicos fornecem um sistema para estudar a interação entre células T transferidas adotivamente e meios contexto-específicos - incluindo macrófagos associados a tumores (TAMs) e células T reguladoras (Tregs) conhecidas por suprimir a função de células T no microambiente tumoral (TME)^4,5,6. Além disso, os modelos singênicos oferecem uma plataforma adicional para avaliar a toxicidade no alvo, fora do tumor e a interação de células CAR-T com fatores do hospedeiro que podem levar a toxicidades adicionais, incluindo a síndrome de liberação de citocinas⁷.

Apesar dessas vantagens, o número de estudos singênicos com células CAR-T permanece limitado. Notadamente, modelos singênicos requerem engenharia autóloga de células CAR-T da mesma linhagem de camundongos e, portanto, apresentam um desafio adicional devido à falta de metodologia para transdução eficiente de células T murinas e expansão ex vivo ^2,8. Este protocolo descreve os métodos para alcançar a expressão estável do CAR através da produção de vetores retrovirais e transdução otimizada de células T. Um esquema de todo o processo é mostrado na Figura 1. O uso desta abordagem demonstra a transdução retroviral eficiente de células CAR-T murinas e a obtenção de alta expressão de CAR sem a necessidade de concentração viral através da ultracentrifugação. Estratégias para alterar a antigenespecificidade do construto CAR são discutidas, além da co-expressão de transgenes adicionais.

Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram realizados com aprovação do Institutional Animal Care and Use Committee (Columbia University, protocolos AC-AABQ5551 e AC-AAAZ4470) em camundongos fêmeas BALB/c ou CF57BL/6 com 6-8 semanas de idade, pesando entre 20-25 g. Os animais foram obtidos de fonte comercial (ver Tabela de Materiais). Este protocolo é estruturado em torno dos "dias pós-ativação" das células T murinas, e a produção viral começa no Dia -2. O retrovírus pode ser armazenado a -80 °C após a produção inicial e, para uso futuro deste protocolo, pode-se iniciar com a etapa 2, isolamento e ativação de células T no Dia 0.

1. Produção de vetor retroviral

NOTA: Os produtos virais tornaram-se defeituosos de replicação pela separação dos genes de embalagem em dois plasmídeos separados (ver Tabela de Materiais), reduzindo consideravelmente a probabilidade de eventos de recombinação e produção inadvertida de vírus competente em replicação.

1. Preparar células Phoenix Eco um dia antes da transfecção (procedimento Dia -2).
   1. Placa aproximadamente 1 x 10⁷ células em placa tratada com CT de 15 cm ou frasco de cultura T150, utilizando 30 mL de meio de cultura (meio de cultura Phoenix Eco, conforme detalhado na Tabela 1).
   2. Incubar durante a noite a 37 °C. Após 18-24 h, as células devem ser aproximadamente 70% confluentes e uniformemente distribuídas para garantir um alto rendimento viral sem crescimento excessivo.
      NOTA: Para obter os melhores resultados, use células com uma passagem baixa e passe-as no dia anterior ao plaqueamento para a produção viral. Não permita que as células Phoenix Eco cresçam demais durante a cultura de rotina.
2. Preparar a mistura de transfecção contendo os reagentes de lipofecção e intensificador, pCL-Eco (Gag/Pol) e plasmídeo de expressão de pMSCV (pMSCV_PGK_mGFP28z) em meios de soro reduzido (ver Tabela de Materiais) (procedimento Dia -1).
   NOTA: A co-transfecção deve ser realizada na proporção de 1:1 de pMSCV e pCL-Eco.
   1. Preparar o tubo A: Diluir 105 μL do reagente de transfecção em 3,75 mL de meio de soro reduzido por placa de 15 cm e misturar completamente por vórtice ou pipetagem para cima e para baixo.
   2. Preparar o tubo B: diluir o plasmídeo de expressão de pMSCV (21 μg) e pCL-Eco (21 μg) com 90 μL de reagente intensificador em 3,75 mL de meio de soro reduzido por placa de 15 cm. Misture bem pipetando para cima e para baixo.
      NOTA: Se gerar vários produtos virais, configure uma mistura mestre contendo pCL-Eco e o reagente intensificador.
   3. Adicione o tubo A ao tubo B e misture bem por pipetagem. Incubar por 10-20 min à temperatura ambiente, resultando em um volume total de aproximadamente 7,5 mL.
   4. Remover cuidadosamente 10 mL de meio de cultura celular da(s) placa(s) Phoenix Eco e adicionar todo o volume da mistura de transfecção ao meio restante, inclinando a placa e pipetando gota a gota. Células de retorno para uma incubadora de 37 °C.
3. Trocar a mídia em células Phoenix Eco transfectadas 16-20 h pós-transfecção (procedimento Dia 0).
   1. Meio de células T murino pré-aquecido e β-mercaptoetanol (2-ME, ver Tabela de Materiais) (colheita viral mTCM, conforme listado na Tabela 1) a 37 °C usando água ou banho de contas.
   2. Remova cuidadosamente o meio de cultura Phoenix Eco inclinando a placa e colocando a ponta da pipeta no canto inferior, usando um vácuo, se possível. Evite secar demais as células.
   3. Adicione suavemente o meio de colheita mTCM-viral aquecido ao lado da placa inclinada pipetando 30 mL na configuração mais lenta. Células de retorno para uma incubadora de 37 °C.
      NOTA: Esta etapa pode fazer com que as células Phoenix Eco se desprenda da placa e reduzam os títulos virais. A mídia pré-aquecida e a pipetagem suave minimizarão a interrupção.
4. Colher o sobrenadante viral 48 h pós-transfecção (procedimento Dia 1).
   1. Recolher o sobrenadante viral e filtrá-lo através de filtros PVDF de 0,45 μm (ver Tabela de Materiais) para remover células e detritos. Aliquot e congelar o vírus a -80 °C ou prosseguir diretamente para o Dia 1 da etapa 3 se estiver usando vírus novo.
   2. Determinar o título viral (unidades de transdução/mL) por citometria de fluxo, conforme descrito anteriormente⁹. Esta etapa é opcional.
      1. Determinar o título viral por transdução em pequena escala de 1 x 10⁵ células T murinas ativadas em placas de 96 poços tratadas com cultura de tecidos (TC) não tratadas com TC, pré-revestidas com retronectina (ver Tabela de Materiais) e carregadas com diluições seriadas triplas de sobrenadante retroviral em um volume final de 100 μL de meio de colheita viral mTCM.
         NOTA: Consulte as etapas 2 e 3 abaixo para obter instruções detalhadas sobre isolamento, ativação e transdução de células T.
      2. Determinar a expressão da superfície do CAR 4-5 dias após a transdução por citometria de fluxo.
      3. Calcular o título viral de acordo com a fórmula¹⁰: (N x F x D)/V, onde N é o número de células transduzidas, F é a frequência de células CAR-positivas, D é o fator de diluição e V é o volume de transdução em mL para obter unidades de transdução (UT)/mL.
         NOTA: O título viral pode diminuir após o congelamento/descongelamento; portanto, o título viral é idealmente determinado no vírus congelado e subsequentemente descongelado.

2. Isolamento de células T murinas

1. Isolar e ativar células T murinas (procedimento Dia 0).
   NOTA: Estas etapas podem ser realizadas à temperatura ambiente (TR) ou 4 °C e devem ser realizadas em um ambiente estéril.
   1. Colher o(s) baço(s) da cepa de camundongo de interesse (por exemplo, Balb/c, C57BL/6) conforme descrito anteriormente¹¹ e obter uma suspensão unicelular por dissociação mecânica.
   2. Usando a parte de trás de uma seringa estéril, esmague o(s) baço(s) através de um filtro de células de 70-100 μm em um tubo cônico de 50 mL.
   3. Após deixar a seringa de lado, lave o filtro com 5 mL de tampão de isolamento de células T (solução salina tamponada com fosfato, PBS, suplementado com soro fetal bovino a 2%, FBS).
   4. Repita a etapa de trituração e lave o filtro novamente com 5 mL de tampão de isolamento de células T. Levar o volume final para 50 mL com tampão de isolamento de células T.
   5. Conte as células vivas usando um hemocitômetro manual ou um contador automático de células diluindo na proporção de 1:20 e, em seguida, misturando a 1:1 com azul de tripano.
   6. Pellet as células por centrifugação por 10 min a 450 x g, a 4 °C (ou RT), e ressuspender os espleenócitos a 1 x 10⁸/mL se usar o kit de isolamento de células T recomendado (ver Tabela de Materiais).
      NOTA: Os espleenócitos podem ser re-esticados através de um filtro de 40-70 μm nesta fase para remover aglomerados.
2. Isolar células T CD3⁺ por seleção negativa seguindo as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais). Após a separação magnética, transferir o isolado para um tubo cônico de 15 mL e realizar uma contagem final de células vivas.
3. Pastilhar as células T isoladas por centrifugação por 10 min a 450 x g, a 4 °C (ou RT), e ressuspendê-las a 1 x 10⁶/mL em meio de ativação mTCM (Tabela 1).
4. Ativar células T adicionando esferas magnéticas murinas revestidas com anticorpos monoclonais anti-CD3/anti-CD28 (ver Tabela de Materiais) na proporção de 25 μL/1 x 10⁶ células T e 100 U/mL IL-2.
5. Coloque as células numa incubadora a 37 °C e deixe-as durante a noite.
   NOTA: Devido ao pequeno tamanho das células T, uma contagem de células T vivas mais precisa pode ser obtida diluindo-se em uma proporção de 1:10-1:20 e misturando-se a 1:1 com azul de tripano para contagem manual usando um hemocitômetro. A pureza pode ser determinada por citometria de fluxo pela coloração das células com um anticorpo αCD3 conjugado fluorescentemente. Cada baço produzirá entre 7-10 x 10⁶ células T, dependendo da idade e cepa do camundongo.

3. Transdução de células T murinas

1. Preparar placas para transdução (procedimento Dia 0).
   1. Pré-revestir placas estéreis de 24 poços não tratadas com 0,5 mL de reagente intensificador de transdução de fibronectina humana (ver Tabela de Materiais) a uma concentração final de 20-40 μg/mL, diluindo-o em PBS estéril e armazenando a 4 °C durante a noite.
      NOTA: Esta etapa também pode ser realizada no Dia 1 revestindo-se placas de 24 poços não tratadas com o reagente de transdução e incubando-as à temperatura ambiente por 2 h.
2. Realizar transdução de células T (procedimento Dia 1).
   1. Prepare a placa pré-revestida para transdução. Remova o reagente de transdução de cada poço da placa pré-revestida de 24 poços e bloqueie com um volume equivalente de PBS filtrado estéril + albumina de soro bovino (BSA) a 2% (0,5 mL) por 30 min na RT.
   2. Lavar uma vez com 0,5-1 mL de PBS.
3. Adicionar 0,5-1 mL de retrovírus puro da etapa 1 ou diluído com base no título viral a cada poço pré-revestido e centrifugar por 90 min a 2.000 x g e 32 °C.
4. Adicionar 1 ml de células T activadas a cada poço carregado com vírus e centrifugar durante 10 minutos a 450 x g e 32 °C. Retornar as células para uma incubadora de 37 °C durante a noite.
5. 24 h após a transdução, remova 1-1,5 mL de meio de cultura celular e substitua-o por 1-1,5 mL de mTCM-completo e 10 ng/mL de IL-7 e IL-15 humanas recombinantes (ver Tabela de Materiais). Células de retorno para uma incubadora de 37 °C (procedimento do dia 2).
   NOTA: Durante a cultura ex vivo , 10 ng/mL de citocinas devem ser adicionados à cultura a cada 48 h, e as células T não devem ser diluídas além de 1 x 10⁶/mL.
6. 48 h após a transdução, transferir as células da placa de transdução para uma placa fresca de 24 ou 6 poços e retornar as células para uma incubadora de 37 °C (procedimento do Dia 3).
   NOTA: A viabilidade das células T pode melhorar transferindo células em 24 h a 2 dias após a transdução, dependendo da viabilidade inicial das células T e do título viral.
7. De-bead as células T e confirmar a expressão CAR (procedimento Dia 5-6).
   1. Ressuspenda completamente as células para dissociar as células T ativadas das esferas revestidas com αCD3/CD28 (ver Tabela de Materiais) e coloque a suspensão celular em um ímã por 30 s. Transferir a suspensão celular para o recipiente de cultura ex vivo desejado e devolvê-la a uma incubadora a 37 °C.
      NOTA: As células T podem ser cultivadas em frascos de cultura ou placas de cultura de poço profundo. Recomenda-se plaquear um mínimo de 5 x 10⁶ células T em 30 mL de meio mTCM-completo por poço em um poço profundo de uma placa de formato de 6 poços (ver Tabela de Materiais).
   2. Determinar a expressão do CAR por citometria de fluxo⁸.
      Nota: A expressão de GFP-CAR foi determinada por incubação com 100 ng/mL de GFP purificada. A incorporação de um epítopo N-terminal facilitará a detecção de construções alternativas do CAR.
8. Realizar cultura ex vivo de células CAR-T (procedimento Dia 7-10).
   1. Durante o cultivo ex vivo , manter as células removendo 50% do meio de cultura e substituindo-o por mTCM-completo fresco + 2x 10 ng/mL de IL-7 e IL-15 a cada 48 h.
      NOTA: As células CAR-T murinas estão prontas para uso em aplicações a jusante 7 dias após a ativação e não devem ser criopreservadas devido à baixa viabilidade pós-descongelamento.

Resultados

O protocolo aqui descrito visa padronizar o processo de transdução de células T murinas para a geração de células CAR-T de camundongo. A Figura 1 fornece uma descrição detalhada das etapas envolvidas. O processo começa com a produção de vetores retrovirais via co-transfecção de componentes virais em células Phoenix Eco. A Figura 2 fornece uma imagem da densidade ideal de células Phoenix Eco no dia da transfecção. As células T isoladas ...

Discussão

Este protocolo descreve as etapas e reagentes necessários para a transdução retroviral de células T murinas para gerar células CAR-T para estudos in vivo . A otimização das condições de transdução retroviral alcança uma expressão robusta de CAR sem a necessidade de concentração viral por ultracentrifugação ou reagentes adicionais. No entanto, há múltiplas modificações que podem ser aplicadas a essa metodologia.

Enquanto este protocolo descreve a geração de exemp...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 μm filters	MilliporeSigma	SLHVR33RS
1 mL syringe	Fisher Scientific	14-955-450
1.5 mL microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-135
10 mL syringe	BD	14-823-16E
100 μm strainer	Corning	07-201-432
15 cm TC treated cell culture dishes	ThermoFisher Scientific	130183
15 mL conical tubes	Falcon	14-959-70C
40 μm strainer	Corning	07-201-430
50 mL conical tubes	Falcon	14-959-49A
70 μm strainer	Corning	07-201-431
Attune NxT Flow Cytometer	ThermoFisher Scientific
BALB/C, 6-8 week old	Jackson Laboratory	651
B-Mercaptoethanol	Gibco	21985023
Bovine Serum Albumin	GOLDBIO	A-420-500
DMEM Medium	Gibco	11965092
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), without Calcium and Magnesium	Gibco	14-190-250
DynaMag-2 Magnet	Invitrogen	12-321-D
EasySep Magnet	Stemcell Technologies	18000
EasySep Mouse T cell Isolation Kit	Stemcell Technologies	19851
FACS buffer	BD	BDB554657
Fetal bovine serum (FBS)	Corning	MT35011CV
GlutaMAX	Gibco	35-050-061
G-Rex6	Wilson Wolf	80240M
HEPES Buffer Solution	Gibco	15-630-080
Human recombinant IL-15	Miltenyi Biotec	130-095-765
Human recombinant IL-2	Miltenyi Biotec	130-097-748
Human recombinant IL-7	Miltenyi Biotec	130-095-363
Lipofectamine 3000	Invitrogen	L3000008
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140-050
Mouse Anti-CD3 BV421	Biolegend	100228
Mouse Anti-CD3/CD28 Dynabeads	Gibco	11-453-D
Mouse Anti-CD4 BV605	BD	563151
Mouse Anti-CD44 APC	Biolegend	103011
Mouse Anti-CD62L PE-Cy7	Tonbo	SKU 60-0621-U025
Mouse Anti-CD8 APC-Cy7	Tonbo	SKU 25-0081-U025
Nikon Ti2 with Prime 95B camera	Nikon
Non-treated 24 well plates	CytoOne	CC7672-7524
Opti-MEM	Gibco	31-985-062
pCL-Eco	Addgene	#12371
Penicillin/Streptomycin Solution	Gibco	15-070-063
Phoenix Eco cells	ATCC	CRL-3214
pMDG.2	Addgene	#12259
pMSCV_PGK_GFP28z	N/A	Produced by R.LV.
Purified sfGFP	N/A	Produced by R.LV.
RetroNectin ('transduction reagent')	Takara Bio	T100B
RPMI 1640	Gibco	21875
Serological pipette 10 mL	Fisher Scientific	13-678-11E
Serological pipette 25 mL	Fisher Scientific	13-678-11
Serological pipette 5 mL	Fisher Scientific	13-678-11D
Sodium Pyruvate	Gibco	11-360-070
TC-treated 24 well plates	Corning	08-772-1
Trypan blue	Gibco	15-250-061