JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מייעל את הייצור הווקטורי הרטרו-ויראלי ואת התמרת תאי T מורין, ומאפשר ייצור יעיל של תאי CAR-T בעכבר.

Abstract

טיפולים תאיים מהונדסים המשתמשים בתאי קולטן אנטיגן כימרי (CAR)-T השיגו יעילות יוצאת דופן באנשים עם ממאירויות המטולוגיות ונמצאים כעת בפיתוח לטיפול בגידולים מוצקים מגוונים. עד כה, ההערכה הראשונית של תוצרי תאי CAR-T חדשים התרחשה בעיקר במודלים של גידולי קסנוגרפט באמצעות עכברים מדוכאי חיסון. גישה זו נבחרה כדי להקל על קליטה מוצלחת של תאי CAR-T אנושיים בסביבה הניסויית. עם זאת, מודלים סינגניים של עכברים, שבהם גידולים ותאי CAR-T נגזרים מאותו זן עכבר, מאפשרים הערכה של טכנולוגיות CAR חדשות בהקשר של מערכת חיסון מתפקדת ומיקרו-סביבה מקיפה של הגידול (TME). הפרוטוקול המתואר כאן נועד לייעל את תהליך ייצור תאי CAR-T בעכבר על ידי הצגת שיטות סטנדרטיות להתמרה רטרו-ויראלית ולתרבית תאי T ex vivo . השיטות המתוארות בפרוטוקול זה יכולות להיות מיושמות על מבני CAR אחרים מעבר לאלה המשמשים במחקר זה כדי לאפשר הערכה שגרתית של טכנולוגיות CAR חדשות במערכות הכשירות למערכת החיסון.

Introduction

טיפולים מאומצים בתאי T המבטאים קולטני אנטיגן כימריים (CARs) חוללו מהפכה בתחום האימונותרפיה לסרטן על ידי רתימת כוחה של מערכת החיסון הנרכשת כדי להתמקד ספציפית בתאי סרטן חיוביים לאנטיגןולחסל אותם 1. בעוד ההצלחה של טיפולים בתאי CAR-T המכוונים לממאירויות של תאי B אוששה קלינית, מחקרים פרה-קליניים שבוצעו במודלים של בעלי חיים נותרו חיוניים לפיתוח CARs חדשים המכוונים לגידולים מוצקים. עם זאת, יעילות קלינית מוגבלת הוכחה באינדיקציות גידול מוצקות עד כה, ומתברר יותר ויותר כי מודלים פרה-קליניים בודדים אינם מנבאים במדויק את הפרמקודינמיקה והיעילות הקלינית של תרופה חיה 2,3. לכן, החוקרים החלו להרחיב את המחקר הפרה-קליני של תוצרי תאי CAR-T כך שיכלול הערכות מקבילות בקסנוגרפט ובמודלים סינגניים של סרטן אנושי וסרטן מורין, בהתאמה.

בניגוד למודלים של קסנוגרפט, שבהם גידולים אנושיים ותאי T מושתלים בעכברים מדוכאי חיסון, מודלים סינגניים מאפשרים לבחון תגובות של תאי CAR-T בהקשר של מערכת חיסון מתפקדת. באופן ספציפי, עכברים בעלי כשירות חיסונית הנושאים גידולים סינגניים מספקים מערכת לחקר האינטראקציה בין תאי T שהועברו באופן מאומץ לבין מילייה ספציפי להקשר - כולל מקרופאגים הקשורים לגידול (TAMs) ותאי T רגולטוריים (Tregs) הידועים כמדכאים את תפקוד תאי T במיקרו-סביבה של הגידול (TME)4,5,6. יתר על כן, מודלים סינגניים מציעים פלטפורמה נוספת להערכת רעילות ממוקדת, מחוץ לגידול, ואינטראקציה של תאי CAR-T עם גורמים מארחים שעלולים להוביל לרעילות נוספת, כולל תסמונת שחרור ציטוקינים7.

למרות יתרונות אלה, מספר המחקרים הסינגניים בתאי CAR-T נותר מוגבל. יש לציין כי מודלים סינגניים דורשים הנדסה אוטולוגית של תאי CAR-T מאותו זן עכבר ולכן מהווים אתגר נוסף בשל היעדר מתודולוגיה להתמרה יעילה של תאי T מורין והרחבת ex vivo 2,8. פרוטוקול זה מתאר את השיטות להשגת ביטוי CAR יציב באמצעות ייצור וקטורים רטרו-ויראליים והתמרה אופטימלית של תאי T. סכמה של התהליך כולו מוצגת באיור 1. השימוש בגישה זו מדגים התמרה רטרו-ויראלית יעילה של תאי CAR-T מורין והשגת ביטוי CAR גבוה ללא צורך בריכוז נגיפי באמצעות אולטרה-צנטריפוגה. אסטרטגיות לשינוי ספציפיות האנטיגן של מבנה CAR נדונות בנוסף לביטוי משותף של טרנסגנים נוספים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו באישור הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (אוניברסיטת קולומביה, פרוטוקולים AC-AABQ5551 ו-AC-AAAZ4470) באמצעות עכברות BALB/c או CF57BL/6 בנות 6-8 שבועות במשקל של בין 20-25 גרם. בעלי החיים התקבלו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים). פרוטוקול זה בנוי סביב "הימים שלאחר ההפעלה" של תאי T מורין, וייצור נגיפים מתחיל ביום -2. רטרו-וירוס יכול להיות מאוחסן ב -80 ° C לאחר הייצור הראשוני, ולשימוש עתידי של פרוטוקול זה, ניתן להתחיל עם שלב 2, בידוד תאי T והפעלה ביום 0.

1. ייצור וקטור רטרו-ויראלי

הערה: המוצרים הנגיפיים נעשו פגומים בשכפול על ידי הפרדת גני האריזה לשני פלסמידים נפרדים (ראה טבלת חומרים), מה שמקטין מאוד את הסבירות לאירועי רקומבינציה וייצור לא מכוון של וירוס כשיר שכפול.

  1. הכינו את תאי הפניקס אקו יום אחד לפני הטרנספקציה (הליך יום -2).
    1. צלחת בערך 1 x 107 תאים בצלחת 15 ס"מ מטופלת TC או צלוחיות תרבית T150, באמצעות 30 מ"ל של מדיום תרבית (מדיום תרבית הפניקס אקו, כמפורט בטבלה 1).
    2. לדגור לילה ב 37 °C (77 °F). לאחר 18-24 שעות, התאים צריכים להיות כ 70% confluent ומופץ באופן אחיד כדי להבטיח תשואה ויראלית גבוהה ללא צמיחת יתר.
      הערה: לקבלת תוצאות מיטביות, יש להשתמש בתאים עם מעבר נמוך ולעבור אותם יום לפני הציפוי לייצור נגיפי. אין לאפשר לתאי הפניקס אקו לגדול יתר על המידה במהלך תרבית שגרתית.
  2. הכינו את תערובת הטרנספקציה המכילה את ריאגנטים ליפופקציה ומשפרים, pCL-Eco (Gag/Pol) ופלסמיד ביטוי pMSCV (pMSCV_PGK_mGFP28z) במדיה מופחתת בסרום (ראו טבלת חומרים) (הליך יום -1).
    הערה: יש לבצע טרנספקציה משותפת ביחס של 1:1 של pMSCV ו-pCL-Eco.
    1. הכינו את צינור A: דללו 105 מיקרוליטר של מגיב הטרנספקציה ב-3.75 מ"ל של מדיום סרום מופחת לכל צלחת של 15 ס"מ וערבבו היטב על ידי ערבול או פיפטינג למעלה ולמטה.
    2. הכן צינור B: לדלל פלסמיד ביטוי pMSCV (21 מיקרוגרם) ו- pCL-Eco (21 מיקרוגרם) עם מגיב משפר 90 מיקרוליטר ל- 3.75 מ"ל של מדיום סרום מופחת לכל צלחת של 15 ס"מ. מערבבים היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.
      הערה: אם אתם מייצרים מוצרים נגיפיים מרובים, הגדירו תערובת אב המכילה pCL-Eco ואת מגיב המשפר.
    3. מוסיפים את צינור A לצינור B ומערבבים היטב על ידי פיפטינג. יש לדגור במשך 10-20 דקות בטמפרטורת החדר, והתוצאה היא נפח כולל של כ-7.5 מ"ל.
    4. הסר בזהירות 10 מ"ל של מדיה של תרבית תאים מלוח Phoenix Eco והוסף את כל נפח תערובת הטרנספקציה למדיה הנותרת על ידי הטיית הצלחת והפיפטינג כלפי מטה. החזרת תאים לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס.
  3. שנה את המדיה על תאי Phoenix Eco נגועים 16-20 שעות לאחר הטרנספקציה (הליך יום 0).
    1. סרום טרום חם ו-β-מרקפטואתנול (2-ME, ראו טבלת חומרים) ללא תאי מורין T בינוניים (קציר נגיפי mTCM, כמפורט בטבלה 1) עד 37°C באמצעות אמבט מים או חרוזים.
    2. הסר בזהירות את מדיום התרבות Phoenix Eco על ידי הטיית הצלחת והנחת קצה פיפטה בפינה התחתונה, באמצעות ואקום במידת האפשר. הימנעו מייבוש יתר של התאים.
    3. הוסיפו בעדינות את מדיום הקציר הנגיפי mTCM המחומם לצד הצלחת המוטה על ידי פיפטציה של 30 מ"ל במצב האיטי ביותר. החזרת תאים לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס.
      הערה: שלב זה יכול לגרום לתאי Phoenix Eco להתנתק מהצלחת ולהפחית את הטיטרים הנגיפיים. מדיה מחוממת מראש ופיפטינג עדין ימזערו את ההפרעה.
  4. קצור את supernatant ויראלי 48 שעות לאחר transfection (הליך יום 1).
    1. קצרו את הסופרנאטנט הנגיפי וסננו אותו דרך מסנני PVDF של 0.45 מיקרומטר (ראו טבלת חומרים) כדי להסיר תאים ופסולת. Aliquot ולהקפיא את הנגיף ב -80 ° C או להמשיך ישירות ליום 1 של שלב 3 אם באמצעות וירוס טרי.
    2. לקבוע את titer ויראלי (יחידות מתמר/mL) על ידי ציטומטריית זרימה,כפי שתואר קודם 9. שלב זה הוא אופציונלי.
      1. קבע את הטיטר הנגיפי על ידי התמרה בקנה מידה קטן של 1 x 105 תאי T מורין פעילים בלוחות 96 בארות שאינם מטופלים בתרבית רקמה (TC), מצופים מראש ברטרונקטין (ראה טבלת חומרים) ועמוסים בדילול סדרתי משולש של סופרנאטנט רטרו-ויראלי בנפח סופי של 100 μL של מדיום קציר נגיפי mTCM.
        הערה: ראה שלבים 2 ו- 3 להלן לקבלת הוראות מפורטות על בידוד, הפעלה והעברה של תאי T.
      2. קביעת ביטוי פני השטח של CAR 4-5 ימים לאחר הטרנסדוקציה על ידי ציטומטריית זרימה.
      3. חשב את הטיטר הנגיפי על פי הנוסחה10: (N x F x D)/V, כאשר N הוא מספר התאים המותמרים, F הוא התדירות של תאים חיוביים ל- CAR, D הוא גורם הדילול, ו- V הוא נפח ההמרה ב- mL לקבלת יחידות מתמרים (TU)/mL.
        הערה: טיטר נגיפי עשוי לרדת בעת הקפאה/הפשרה; לכן, titer ויראלי נקבע באופן אידיאלי על וירוס קפוא ולאחר מכן מופשר.

2. בידוד תאי T מורין

  1. בודד והפעל תאי T מורין (הליך יום 0).
    הערה: שלבים אלה יכולים להתבצע בטמפרטורת החדר (RT) או 4 °C ויש לבצע אותם בסביבה סטרילית.
    1. קצרו את הטחול מזן העכבר המעניין (למשל, Balb/c, C57BL/6) כפי שתואר קודם לכן11 וקבלו תרחיף חד-תאי באמצעות דיסוציאציה מכנית.
    2. בעזרת גב מזרק סטרילי, מרסקים את הטחול דרך מסננת תאים של 70-100 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי של 50 מ"ל.
    3. לאחר הנחת המזרק בצד, שטפו את המסננת עם 5 מ"ל של מאגר בידוד תאי T (מלח חוצץ פוספט, PBS, בתוספת סרום בקר עוברי 2%, FBS).
    4. חזור על שלב המעיכה ושטוף את המסננת פעם נוספת עם 5 מ"ל של מאגר בידוד תאי T. הבא את הנפח הסופי ל- 50 מ"ל עם מאגר בידוד תאי T.
    5. ספור תאים חיים באמצעות המוציטומטר ידני או מונה תאים אוטומטי על-ידי דילול ביחס של 1:20 ולאחר מכן ערבוב ביחס של 1:1 עם כחול טריפאן.
    6. גלול את התאים על ידי צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 450 x גרם, ב 4 ° C (או RT), ו resuspend spleenocytes ב 1 x 108/mL אם באמצעות ערכת בידוד תאי T המומלצת (ראה טבלה של חומרים).
      הערה: ניתן למתוח מחדש טחול באמצעות מסננת של 40-70 מיקרומטר בשלב זה כדי להסיר גושים.
  2. בודד תאי CD3+ T על-ידי בחירה שלילית בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים). לאחר ההפרדה המגנטית, העבירו את המבודד לצינור חרוטי של 15 מ"ל ובצעו ספירת תאים חיים סופית.
  3. שחררו את תאי ה-T המבודדים באמצעות צנטריפוגה למשך 10 דקות ב-450 x גרם, ב-4°C (או RT), והשהו אותם מחדש ב-1 x 106/mL בתווך הפעלת mTCM (טבלה 1).
  4. הפעל תאי T על ידי הוספת חרוזים מגנטיים מצופים נוגדנים חד-שבטיים נגד CD3/anti-CD28 (ראה טבלת חומרים) ביחס של 25 μL/1 x 10,6 תאי T ו-100 U/mL IL-2.
  5. הניחו את התאים באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס והשאירו אותם למשך הלילה.
    הערה: בשל גודלם הקטן של תאי T, ניתן להשיג ספירה מדויקת יותר של תאי T חיים על ידי דילול ביחס של 1:10-1:20 וערבוב של 1:1 עם כחול טריפאן לספירה ידנית באמצעות המוציטומטר. טוהר עשוי להיקבע על ידי ציטומטריית זרימה על ידי צביעת תאים עם נוגדן αCD3 מצומד פלואורסצנטית. כל טחול יניב בין 7-10 x 10 6תאי T בהתאם לגיל ולזן של העכבר.

3. התמרת תאי T מורין

  1. הכינו צלחות להתמרה (הליך יום 0).
    1. ציפוי מראש צלחות סטריליות 24 בארות לא מטופלות עם 0.5 מ"ל של מגיב משפר התמרה פיברונקטין אנושי (ראה טבלת חומרים) בריכוז סופי של 20-40 מיקרוגרם / מ"ל על ידי דילול אותו PBS סטרילי ולאחסן ב 4 ° C למשך הלילה.
      הערה: שלב זה יכול להתבצע גם ביום הראשון על ידי ציפוי צלחות 24 בארות שאינן מטופלות עם מגיב הטרנסדוקציה ודגירתן בטמפרטורת החדר למשך שעתיים.
  2. בצע התמרה של תאי T (הליך יום 1).
    1. מכינים את הצלחת המצופה מראש להתמרה. הסר את מגיב ההעברה מכל באר של צלחת 24 בארות מצופה מראש ובלוק עם נפח שווה ערך של PBS מסונן סטרילי + אלבומין בסרום בקר 2% (BSA) (0.5 מ"ל) למשך 30 דקות ב- RT.
    2. לשטוף פעם אחת עם 0.5-1 מ"ל של PBS.
  3. הוסף 0.5-1 מ"ל של רטרו-וירוס מסודר משלב 1 או מדולל על בסיס טיטר נגיפי לכל באר מצופה מראש וצנטריפוגה למשך 90 דקות ב 2,000 x גרם ו 32 ° C.
  4. הוסף 1 מ"ל של תאי T פעילים לכל באר טעונה נגיפית וצנטריפוגה למשך 10 דקות ב 450 x גרם ו 32 ° C. להחזיר תאים לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס בן לילה.
  5. 24 שעות לאחר הטרנסדוקציה, הסר 1-1.5 מ"ל של מדיה של תרבית תאים והחלף אותה ב- 1-1.5 מ"ל של mTCM-שלם ו- 10 ננוגרם/מ"ל של IL-7 ו- IL-15 אנושיים רקומביננטיים (ראה טבלת חומרים). החזרת תאים לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס (הליך יום 2).
    הערה: במהלך תרבית ex vivo , יש להוסיף 10 ng/mL של ציטוקינים לתרבית כל 48 שעות, ואין לדלל תאי T מעבר ל-1 x 106/mL.
  6. 48 שעות לאחר הטרנסדוקציה, מעבירים תאים מצלחת הטרנסדוקציה לצלחת טרייה של 24 בארות או 6 בארות ומחזירים תאים לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס (הליך יום 3).
    הערה: יכולת הקיום של תאי T עשויה להשתפר על-ידי העברת תאים ב-24 שעות עד יומיים לאחר הטרנסדוקציה, בהתאם ליכולת הקיום של תאי T מתחילים ולטיטר נגיפי.
  7. בטל את חרוז תאי T ואשר ביטוי CAR (הליך יום 5-6).
    1. השהה מחדש ביסודיות תאים כדי לנתק תאי T פעילים מהחרוזים המצופים αCD3 / CD28 (ראה טבלת חומרים) והנח את תרחיף התא על מגנט למשך 30 שניות. מעבירים את תרחיף התא לכלי התרבית הרצוי ex vivo ומחזירים אותו לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס.
      הערה: תאי T עשויים להיות מתורבתים בצלוחיות תרבית או בצלחות תרבית עמוקות. מומלץ לצלוח לפחות 5 x 106 תאי T ב 30 מ"ל של מדיום mTCM-שלם לכל באר בבאר עמוקה של צלחת בפורמט 6 בארות (ראה טבלת חומרים).
    2. קביעת ביטוי CAR לפי ציטומטריית זרימה8.
      הערה: ביטוי GFP-CAR נקבע על ידי דגירה עם 100 ננוגרם/מ"ל של GFP מטוהר. שילוב של תג אפיטופ N-terminal יקל על איתור מבני CAR חלופיים.
  8. בצע תרבית ex vivo של תאי CAR-T (הליך יום 7-10).
    1. במהלך תרבית ex vivo , שמור על התאים על ידי הסרת 50% ממדיום התרבית והחלפתו ב- mTCM-Complete טרי + 2x 10 ng/mL של IL-7 ו- IL-15 כל 48 שעות.
      הערה: תאי CAR-T של Murine מוכנים לשימוש ביישומים במורד הזרם 7 ימים לאחר ההפעלה ואין לשמור אותם בהקפאה עקב כדאיות ירודה לאחר ההפשרה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

הפרוטוקול המתואר כאן נועד לתקנן את תהליך התמרה של תאי T מורין ליצירת תאי CAR-T עכבריים. איור 1 מספק תיאור מפורט של השלבים המעורבים. התהליך מתחיל בייצור וקטורים רטרו-ויראליים באמצעות טרנספקציה משותפת של רכיבים נגיפיים לתאי Phoenix Eco. איור 2 מספק תמונה של הצפיפ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר את השלבים והריאגנטים הדרושים להתמרה רטרו-ויראלית של תאי T מורין כדי ליצור תאי CAR-T עבור מחקרי in vivo . אופטימיזציה של תנאי התמרה רטרו-ויראלית משיגה ביטוי CAR חזק ללא צורך בריכוז נגיפי באמצעות אולטרה-צנטריפוגה או ריאגנטים נוספים. עם זאת, ישנם שינויים מרובים שניתן ליישם על מת...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

לא הוכרז על ניגוד עניינים.

Acknowledgements

אנו מודים לל. ברוקמן על הביקורת על כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי NIH 1R01EB030352 ו- UL1 TR001873.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.45 μm filtersMilliporeSigmaSLHVR33RS
1 mL syringe Fisher Scientific 14-955-450
1.5 mL microcentrifuge tubes Fisher Scientific 05-408-135
10 mL syringe BD14-823-16E
100 μm strainerCorning07-201-432
15 cm TC treated cell culture dishesThermoFisher Scientific 130183
15 mL conical tubes Falcon14-959-70C
40 μm strainer Corning07-201-430
50 mL conical tubes Falcon14-959-49A
70 μm strainerCorning07-201-431
Attune NxT Flow Cytometer ThermoFisher Scientific 
BALB/C, 6-8 week old Jackson Laboratory651
B-Mercaptoethanol Gibco21985023
Bovine Serum Albumin GOLDBIOA-420-500
DMEM MediumGibco11965092
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), without Calcium and Magnesium Gibco14-190-250
DynaMag-2 Magnet Invitrogen12-321-D
EasySep Magnet Stemcell Technologies18000
EasySep Mouse T cell Isolation KitStemcell Technologies19851
FACS buffer BDBDB554657
Fetal bovine serum (FBS) CorningMT35011CV
GlutaMAXGibco35-050-061
G-Rex6Wilson Wolf80240M 
HEPES Buffer Solution Gibco15-630-080
Human recombinant IL-15 Miltenyi Biotec130-095-765
Human recombinant IL-2Miltenyi Biotec130-097-748
Human recombinant IL-7Miltenyi Biotec130-095-363
Lipofectamine 3000InvitrogenL3000008
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Gibco11140-050
Mouse Anti-CD3 BV421Biolegend100228
Mouse Anti-CD3/CD28 DynabeadsGibco11-453-D
Mouse Anti-CD4 BV605BD563151
Mouse Anti-CD44 APC Biolegend103011
Mouse Anti-CD62L PE-Cy7TonboSKU 60-0621-U025
Mouse Anti-CD8 APC-Cy7TonboSKU 25-0081-U025
Nikon Ti2 with Prime 95B camera Nikon
Non-treated 24 well plates CytoOneCC7672-7524
Opti-MEMGibco31-985-062
pCL-EcoAddgene#12371
Penicillin/Streptomycin SolutionGibco15-070-063
Phoenix Eco cellsATCCCRL-3214
pMDG.2Addgene#12259
pMSCV_PGK_GFP28zN/AProduced by R.LV.
Purified sfGFPN/AProduced by R.LV.
RetroNectin ('transduction reagent')Takara BioT100B
RPMI 1640Gibco21875
Serological pipette 10 mLFisher Scientific 13-678-11E
Serological pipette 25 mLFisher Scientific 13-678-11
Serological pipette 5 mLFisher Scientific 13-678-11D
Sodium PyruvateGibco11-360-070
TC-treated 24 well plates Corning08-772-1
Trypan blue Gibco15-250-061

References

  1. June, C. H., Sadelain, M. Chimeric antigen receptor therapy. N Engl J Med. 379 (1), 64-73 (2018).
  2. Duncan, B. B., Dunbar, C. E., Ishii, K. Applying a clinical lens to animal models of car-t cell therapies. Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 17-31 (2022).
  3. Hou, A. J., Chen, L. C., Chen, Y. Y. Navigating CAR-T cells through the solid-tumour microenvironment. Nat Rev Drug Discov. 20 (7), 531-550 (2021).
  4. Campesato, L. F., et al. Blockade of the ahr restricts a treg-macrophage suppressive axis induced by l-kynurenine. Nat Commun. 11 (1), 4011(2020).
  5. Kaneda, M. M., et al. Pi3kgamma is a molecular switch that controls immune suppression. Nature. 539 (7629), 437-442 (2016).
  6. Hyrenius-Wittsten, A., Roybal, K. T. Paving new roads for cars. Trends Cancer. 5 (10), 583-592 (2019).
  7. Giavridis, T., et al. CAR T cell-induced cytokine release syndrome is mediated by macrophages and abated by il-1 blockade. Nat Med. 24 (6), 731-738 (2018).
  8. Lanitis, E., et al. Optimized gene engineering of murine CAR-T cells reveals the beneficial effects of il-15 coexpression. J Exp Med. 218 (2), e20192203(2021).
  9. Lambeth, C. R., White, L. J., Johnston, R. E., De Silva, A. M. Flow cytometry-based assay for titrating dengue virus. J Clin Microbiol. 43 (7), 3267-3272 (2005).
  10. Agarwal, S., Wellhausen, N., Levine, B. L., June, C. H. Production of human crispr-engineered CAR-T cells. J Vis Exp. 169, e62299(2021).
  11. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Sterile Tissue Harvest. , JoVE, Cambridge, MA. (2023).
  12. Giordano-Attianese, G., et al. A computationally designed chimeric antigen receptor provides a small-molecule safety switch for t-cell therapy. Nat Biotechnol. 38 (4), 426-432 (2020).
  13. Kuhn, N. F., et al. Cd40 ligand-modified chimeric antigen receptor T cells enhance antitumor function by eliciting an endogenous antitumor response. Cancer Cell. 35 (3), 473-488.e6 (2019).
  14. Jin, C., Ma, J., Ramachandran, M., Yu, D., Essand, M. CAR T cells expressing a bacterial virulence factor trigger potent bystander antitumour responses in solid cancers. Nat Biomed Eng. 6 (7), 830-841 (2022).
  15. Kurachi, M., et al. Optimized retroviral transduction of mouse T cells for in vivo assessment of gene function. Nat Protoc. 12 (9), 1980-1998 (2017).
  16. Jafarzadeh, L., Masoumi, E., Fallah-Mehrjardi, K., Mirzaei, H. R., Hadjati, J. Prolonged persistence of chimeric antigen receptor (CAR) T cell in adoptive cancer immunotherapy: Challenges and ways forward. Front Immunol. 11, 702(2020).
  17. Elkassar, N., Gress, R. E. An overview of IL-7 biology and its use in immunotherapy. J Immunotoxicol. 7 (1), 1-7 (2010).
  18. Osinalde, N., et al. Simultaneous dissection and comparison of IL-2 and IL-15 signaling pathways by global quantitative phosphoproteomics. Proteomics. 15 (2-3), 520-531 (2015).
  19. Eremenko, E., et al. An optimized protocol for the retroviral transduction of mouse CD4 T cells. STAR Protoc. 2 (3), 100719(2021).
  20. Lewis, M. D., et al. A reproducible method for the expansion of mouse CD8+ T lymphocytes. J Immunol Methods. 417, 134-138 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE204

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved