JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يحدد هذا البروتوكول عزل الخلايا النجمية المنقاة والخلايا الدبقية الصغيرة من الحبل الشوكي للفأر البالغ ، مما يسهل التطبيقات اللاحقة مثل تحليل الحمض النووي الريبي وزراعة الخلايا. ويشمل طرق وإجراءات تفكك الخلايا التفصيلية المصممة لتحسين جودة وإنتاجية الخلايا المعزولة.

Abstract

تلعب الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة أدوارا محورية في تطوير الجهاز العصبي المركزي ، واستجابات الإصابات ، والأمراض التنكسية العصبية. تظهر هذه الخلايا الديناميكية للغاية استجابات سريعة للتغيرات البيئية وتظهر عدم تجانس كبير من حيث التشكل وملامح النسخ والوظائف. في حين أن فهمنا لوظائف الخلايا الدبقية في الصحة والمرض قد تقدم بشكل كبير ، لا تزال هناك حاجة إلى تحليلات مخبرية خاصة بالخلايا يتم إجراؤها في سياق الإهانات أو الإصابات لتوصيف مجموعات الخلايا المتميزة بشكل شامل. يوفر عزل الخلايا من الفأر البالغ العديد من المزايا على خطوط الخلايا أو الوليدية ، لأنه يسمح بتحليل الخلايا في ظل الظروف المرضية وفي نقاط زمنية محددة. علاوة على ذلك ، فإن التركيز على العزلة الخاصة بالحبل الشوكي ، باستثناء مشاركة الدماغ ، يمكن من إجراء أبحاث في أمراض الحبل الشوكي ، بما في ذلك التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي ، وإصابة الحبل الشوكي ، والتصلب الجانبي الضموري. يقدم هذا البروتوكول طريقة فعالة لعزل الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة من الحبل الشوكي للفأر البالغ ، مما يسهل التحليل الفوري أو المستقبلي مع التطبيقات المحتملة في الدراسات الوظيفية أو الجزيئية أو البروتينية.

Introduction

الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة هي خلايا دبقية متعددة الاستخدامات تلعب أدوارا حيوية في الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، وتشمل مسؤوليات مثل تنظيم وظيفة الخلايا العصبية ، والمساهمة في تطوير الجهاز العصبي المركزي ، والحفاظ على الحاجز الدموي الدماغي ، والمشاركة في العمليات الحرجة الأخرى1،2،3،4. إلى جانب دورها في الحفاظ على الاتزان الداخلي، تلعب هذه الخلايا الدبقية أيضا دورا محوريا في آليات الإصابة والإصلاح. تشتهر الخلايا الدبقية الصغيرة بقدراتها البلعمية والالتهابية والمهاجرة بعد الإهانات أو الإصابات5،6،7. تتنوع استجابات الخلايا النجمية في المرض بنفس القدر ، وتشمل المساهمات في الالتهاب ، وتشكيل الندوب الدبقية ، وتسوية الحاجز الدموي الدماغي 8,9. على الرغم من أن فهمنا للأدوار الضارة والتعويضية للخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا النجمية في الجهاز العصبي المركزي قد نما ، إلا أن عدم التجانس المتأصل في كل من هيكلها ووظيفتها يتطلب أدوات قوية لدراستها في سياقات مختلفة.

يتطلب اكتساب مزيد من التبصر في أدوار الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا النجمية في الصحة والمرض اتباع نهج مشترك للتحقيقات في الجسم الحي وفي المختبر . تستفيد التقنيات في الجسم الحي من الحديث المتبادل المعقد بين الخلايا الدبقية والخلايا العصبية داخل الجهاز العصبي المركزي ، بينما تثبت المنهجيات في المختبر قيمتها عند تقييم وظائف الخلية الواحدة أو الاستجابات تحت محفزات محددة. كل طريقة تقدم مزايا فريدة ؛ تعد الدراسات في المختبر ضرورية لفهم الأدوار المحددة لأنواع الخلايا هذه دون مدخلات مباشرة أو غير مباشرة من الخلايا المجاورة. بالإضافة إلى ذلك ، تقدم المقايسات في المختبر التي تستخدم خطوط الخلايا الخالدة فوائد معينة ، بما في ذلك القدرة على التكاثر إلى أجل غير مسمى ، وفعالية التكلفة ، وسهولة الصيانة. لكن من المهم ملاحظة أن الخلايا الأولية تحاكي الاستجابات الفسيولوجية الطبيعية بشكل أوثق مقارنة بخطوط الخلايا. هذه الأهمية الفسيولوجية حاسمة في المقايسات الوظيفية والتحليلات النسخية.

يكمن أحد التحديات في الحصول على الخلايا الأولية ، خاصة من الحبل الشوكي للفأر البالغ ، في كمية العينات وصلاحيتها. الحبل الشوكي البالغ ، كونه أصغر من الدماغ ويحتوي على كمية كبيرة من المايلين ، يشكل صعوبات فريدة. في حين أن هناك العديد من البروتوكولات المنشورة التي توضح بالتفصيل عزل الخلايا الدبقية النقية القابلة للحياة من الوليدية أو دماغ الفأر البالغ10،11،12،13 ، قد لا تكون هذه المنهجيات مناسبة لدراسة الأمراض والإصابات الخاصة بالحبل الشوكي. في هذا البروتوكول ، نقدم إجراء شاملا لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا النجمية النقية والقابلة للحياة بكفاءة من الحبل الشوكي للفأر البالغ ، مما يسهل التطبيقات النهائية في زراعة الخلايا وتحليلات النسخ. تم استخدام هذا البروتوكول بنجاح لعزل هذه الخلايا عن الفئران البالغة التي تتراوح أعمارها بين 10 أسابيع و 5 أشهر ، مما يدل على فائدتها عبر سياقات مختلفة ، بما في ذلك الدراسات التي تشمل الفئران بالضربة القاضية المشروطة ، والاستجابات الدوائية ، والبحوث التنموية ، والنماذج المرتبطة بالعمر.

Protocol

تم إجراء جميع إجراءات رعاية والتجارب بعد موافقة لجنة رعاية واستخدام في كلية الطب والعلوم الصحية بجامعة جورج واشنطن (واشنطن العاصمة ، الولايات المتحدة الأمريكية ؛ واشنطن العاصمة ، الولايات المتحدة الأمريكية ، الولايات المتحدة الأمريكية ، الولايات المتحدة الأمريكية ، الولايات المتحدة الأمريكية ، الولايات المتحدة الأمريكية ، الولايات المتحدة الأمريكية ، الولايات المتحدة الأمريكية IACUC # 2021-004). استخدمت الدراسة ذكور وإناث الفئران من النوع البري C57BL / 6J (WT) الذين تتراوح أعمارهم بين 10 أسابيع و 5 أشهر ، والتي تم الحصول عليها من مورد تجاري (انظر جدول المواد) ومقرها في جامعة جورج واشنطن. يتم تقديم نظرة عامة على سير عمل البروتوكول في الشكل 1.

1. إعداد الحبل الشوكي

  1. تخدير باستخدام Avertin (12.5 مجم / مل من 2،2،2-ثلاثي برومو إيثانول و 2.5٪ 2-ميثيل-2-بيوتانول في الماء المعقم) (انظر جدول المواد). تأكد من عدم وجود استجابة لقرصات إصبع القدم والذيل في الفئران.
  2. قم بإجراء التروية القلبية باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (DPBS) لإزالة خلايا الدم أحادية النواة المحيطية.
    1. ضع على صينية ضحلة وقم بعمل شق جانبي لفضح التجويف الجنبي. أدخل إبرة تروية 23 جم متصلة بمضخة تمعجية (انظر جدول المواد) في البطين الأيسر وقم بتنشيط المضخة. بمجرد تدفق DPBS البارد عبر القلب ، قم بعمل شق صغير في الأذين الأيمن.
      ملاحظة: يفضل معدل نضح أسرع في هذه الخطوة لتعزيز صلاحية الخلية. يجب مسح الدم في أقل من 1 دقيقة. تطهير الكبد يشير إلى نضح ناجح.
  3. قطع رأس باستخدام مقص كبير وإزالة العمود الفقري14. اغمره في 1x DPBS بارد مع الجلوكوزCa 2 + / Mg2 + / 0.2٪ في طبق بتري على الثلج لشطف الأنسجة.
  4. بدءا من الآن ، تأكد من إجراء جميع الخطوات في بيئة معقمة. استخدم البثق الهيدروليكي14 لعزل الحبل الشوكي بأكمله. استخدم إبرة 18 جم وحقنة سعة 10 مل مملوءة ب 1x DPBS بارد مع جلوكوزCa 2 + / Mg2 + / 0.2٪. انقل الحبل الشوكي إلى طبق بتري يوضع على أكياس ثلج تحتوي على كمية كافية من البرودة 1x DPBS مع الجلوكوزCa 2 + / Mg2 + / 0.2٪ لغمر الأنسجة بأكملها.
  5. قم بإزالة السحايا بعناية تحت المجهر داخل غطاء التدفق الصفحي. انقل الحبل الشوكي إلى طبق بتري فارغ على أكياس ثلج ، وباستخدام مشرط جراحي رقم 10 ، قم بقطع الحبل الشوكي بالكامل إلى أقسام 2-3 مم.

2. تفكك الخلايا الأنزيمية

  1. أضف مزيج الإنزيم 1 ومزيج الإنزيم 2 من مجموعة تفكك دماغ البالغين المتاحة تجاريا وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة (انظر جدول المواد). قم بتدوير الإنزيمات في الطبق عدة مرات لضمان طلاء موحد للحبل الشوكي ، ثم احتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. كل 5 دقائق ، قم بتدوير الطبق برفق لمنع تكتل الأنسجة وتسهيل التوزيع المتساوي للكواشف.
  2. أخرج الطبق من الحاضنة وأضف 350 ميكرولتر من 0.46 مجم / مل DNAse I في الحد الأدنى من الوسط الأساسي (MEM) (انظر جدول المواد). تخلط عن طريق تحريك بلطف.
  3. أضف 1 مل من DMEM البارد / 0.5٪ مصل بقري جنيني (FBS) واخلطه عن طريق التدوير برفق. نقل المحتويات بالكامل على الفور إلى أنبوب 5 مل.

3. تفكك الخلية الميكانيكية

  1. باستخدام ماصة P1000 ، قم بسحن الأنسجة برفق ثلاث مرات ، مع التأكد من سحب قطع الأنسجة في كل مرة لمزيد من فصل الأنسجة. بعد ذلك ، باستخدام ماصة باستور الزجاجية مقاس 9 بوصات ، قم بالسحن برفق خمس مرات أخرى ، مما يضمن عدم إنشاء فقاعات أثناء العملية.
  2. ضع الأنبوب سعة 5 مل في وضع مستقيم واترك الأنسجة تستقر في الأسفل لمدة 30 ثانية. بمجرد أن يستقر النسيج ، ارسم المادة الطافية باستخدام ماصة P1000 وقم بتمريرها عبر مرشح 30 ميكرومتر إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
  3. إلى نفس الأنبوب سعة 5 مل مع الأنسجة المتبقية ، أضف 1 مل من DMEM البارد / 0.5٪ FBS. باستخدام ماصة باستور ، سحن بلطف ثلاث مرات.
  4. اترك الأنسجة تستقر في القاع لمدة 30 ثانية ، ثم مرر المادة الطافية من خلال مرشح 30 ميكرومتر واجمعها في نفس الأنبوب سعة 15 مل كما كان من قبل. كرر الخطوتين 3.3 و3.4 مرة أخرى.
  5. جهاز طرد مركزي تعليق الخلية المفلترة عند 300 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). قم بإزالة وتجاهل المادة الطافية الناتجة بعناية باستخدام شفاط فراغ.

4. إزالة المايلين

  1. قم بإزالة المايلين باستخدام محلول إزالة الحطام (DRS) المقدم في مجموعة تفكك الدماغ للبالغين وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. بعد إزالة الحطام ، أضف 5 مل من DMEM البارد / 0.5٪ FBS إلى حبيبات الخلية واقلب الأنبوب برفق ثلاث مرات. جهاز طرد مركزي تعليق الخلية عند 300 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
    ملاحظة: إذا كانت الخلايا ستستخدم في الدراسات المختبرية وستبقى في الثقافة ، فيجب استخدام DMEM / 0.5٪ FBS قبل التسخين بدلا من ذلك.
  2. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من DPBS / 0.5٪ FBS (بارد لدراسات الحمض النووي الريبي ودافئ للمقايسات في المختبر ). عد الخلايا وتقييم صلاحيتها باستخدام Trypan Blue.
    ملاحظة: يمكن الجمع بين معلقات الخلايا من متعددة لزيادة تركيز الخلايا.
  3. اغسل الخلايا بإضافة DPBS / 0.5٪ FBS حتى إجمالي حجم 5 مل. أجهزة الطرد المركزي التعليق عند 300 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة وتخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة.

5. الخلايا الدبقية الصغيرة وعزل الخلايا النجمية

  1. قم بتسمية الخلايا بميكروبيدات مضادة ل CD11b أو مضادة ل ACSA-2 وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
  2. قم بفرز الخلايا حسب التحديد الإيجابي باستخدام أعمدة MS وفقا لإرشادات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد). بعد الفرز ، قم بطرد الخلايا التي تم فرزها عند 300 × جم لمدة 10 دقائق وتخلص من المادة الطافية.

6. خلايا الطلاء للمقايسات في المختبر

ملاحظة: إذا لم يتم طلاء الخلايا وسيتم استخدامها على الفور لتحليل الحمض النووي الريبي ، فانتقل إلى الخطوة 8.

  1. أعد تعليق الخلايا في 1 مل من DMEM الدافئ / 0.5٪ FBS. عد الخلايا وتقييم صلاحيتها باستخدام مقياس الدم (انظر جدول المواد).
  2. اضبط تركيز الخلية على 75000 خلية لكل 50 ميكرولتر. أضف 50 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل غطاء مغطى ب Poly-L-lysine11 في لوحة 24 بئرا.
  3. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة للسماح للخلايا بالالتصاق بغطاء الغطاء.
  4. أضف بعناية 450 ميكرولتر من DMEM الدافئ / 5٪ FBS / البنسلين - الستربتومايسين (Pen-Strep ، انظر جدول المواد) إلى كل بئر.
  5. بعد 3 أيام، استبدل نصف الوسائط ب 250 ميكرولتر من DMEM الدافئ / 5٪ FBS / Pen-Strep. للصيانة، استبدل الوسائط تماما ب 500 ميكرولتر من DMEM الدافئ / 5٪ FBS/Pen-Strep كل 4-5 أيام.

7. الكيمياء الهيستولوجية المناعية

ملاحظة: من الأفضل إجراء تحليلات الكيمياء الهيستولوجية المناعية بعد 3 أيام على الأقل عندما يتم استبدال الوسائط مرة واحدة على الأقل. هذا يضمن إزالة الحطام والتصاق الخلايا تماما بغطاء الغطاء.

  1. قم بإزالة الوسائط وقم بتسمية الخلايا باستخدام mAb O4 المضاد للفأر (1: 100) (انظر جدول المواد) في DMEM الدافئ / 5٪ FBS / 10٪ مصل الماعز العادي (NGS) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) أو عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: تخطي هذه الخطوة وانتقل إلى الخطوة 7.3 إذا لم يتم تسمية الخلايا ب O4.
  2. اشطف أغطية الغطاء برفق عن طريق غمسها في DMEM / 5٪ FBS الدافئ ثلاث مرات. أضف مضاد الماعز 594 IgM (1: 300) (انظر جدول المواد) في DMEM الدافئ / 5٪ FBS / 10٪ NGS واحتضانه في RT لمدة 15 دقيقة في الظلام. اشطفيه بلطف ثلاث مرات في DMEM الدافئ / 5٪ FBS.
  3. ثبت الخلايا بحمض الخليك / الميثانول البارد 5٪ لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. اغسل ثلاث مرات باستخدام 1x PBS ، ثم قم بالتسمية بالجسم المضاد المناسب: GFAP المضاد للأرانب (1: 500) ، GFAP المضاد للفأر (1: 500) ، أو Iba1 المضاد للأرانب (1: 500) في 1٪ Triton-X100 / 10٪ NGS في 1x DPBS (انظر جدول المواد). احتضان لمدة 1 ساعة في RT.
    ملاحظة: احتفظ بأغطية الغطاء في الظلام إذا كانت ملطخة بالفعل ب O4.
  4. شطف بلطف ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. التسمية مع الجسم المضاد الثانوي المناسب: مضاد للفأر 594 IgG (1: 500) ، مضاد للأرانب 488 IgG (1: 500) (انظر جدول المواد). احتضان لمدة 30 دقيقة في RT في الظلام.
  5. شطف بلطف ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. Counterstain مع DAPI (1: 1000) لمدة 1 دقيقة في RT. شطف ثلاث مرات مع PBS ، إضافة وسيط التثبيت (انظر جدول المواد) ، وتركيب أغطية على الشرائح.

8. استخراج الحمض النووي الريبي

ملاحظة: من الناحية المثالية ، يجب أن يكون هناك ما لا يقل عن 100000 خلية لاستخراج الحمض النووي الريبي الكافي للتحليل. إذا لزم الأمر ، يمكن الجمع بين خلايا من 2-3 حبال نخاعية.

  1. استخرج الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة عزل الحمض النووي الريبي المتاحة تجاريا وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة (انظر جدول المواد). لكل خطوة غسيل مع المخزن المؤقت للغسيل RW1 المتوفر في المجموعة ، اترك الخلايا في المخزن المؤقت للغسيل لمدة دقيقتين إضافيتين.
  2. قم بإزالة أي حمض نووي جينومي متبقي باستخدام DNase I وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد). احتضان مع DNase في RT لمدة 15 دقيقة ، ثم يغسل مع العازلة RW1.
  3. لزيادة إنتاجية الحمض النووي الريبي ، قبل الشطف ، احتضان العينات في ماء خال من الحمض النووي الريبي في RT لمدة 10 دقائق. تقييم سلامة الحمض النووي الريبي وكميته باستخدام محلل حيوي15 (انظر جدول المواد).

النتائج

تمكن الطرق الموضحة في هذا البروتوكول من عزل الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا النجمية النقية والقابلة للحياة من الحبل الشوكي للفأر البالغ ، مما يسهل العديد من التطبيقات النهائية ، بما في ذلك المقايسات الوظيفية أو النسيجية في المختبر وتحليل الحمض النووي الريبي.

سيؤدي ?...

Discussion

يعد عزل الخلايا الأولية النقية القابلة للحياة أمرا بالغ الأهمية لدراسة بنية ووظيفة أنواع معينة من الخلايا. في الفأر البالغ ، وخاصة في الحبل الشوكي ، تشكل هذه المهمة تحديات كبيرة ، حيث أن البروتوكولات الحالية غالبا ما تكون غير مصممة للحبل الشوكي البالغ10,17. ي...

Disclosures

اي

Acknowledgements

نشكر Castle Raley في مركز الجينوم بجامعة جورج واشنطن لتحليلات الحمض النووي الريبي وحلول Q2 Lab لتحليلات تسلسل الحمض النووي الريبي. تم دعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية [رقم المنحة F31NS117085] ووقف أبحاث فيفيان جيل للدكتور روبرت إتش ميلر. تم إنشاء الشكل 1 باستخدام BioRender.com.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2,2,2-TribromoethanolSigma AldrichT48402
24 well tissue culture plateAvantor10861-558
2-Methyl-2-butanol, 98%Thermo FisherA18304-0F
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, DihydrochlorideInvitrogenD13061:1000
45% glucose solutionCorning25-037-CI
5 mL capped tubesEppendorf30122305
Acetic acidSigma-AdlrichA6283
Adult Brain Dissociation KitMiltenyi103-107-677
Anti-ACSA2 Microbead KitMiltenyi130-097-679
Anti-Iba1Wako019-1974
BioanalyzerAgilent TechnologiesG2939BA
C57BL/6J wild-type (WT) mice Jackson Laboratories
CD11b (Microglia) MicroBeadsMiltenyi130-093-634
Celltrics 30 µm filterSysmex Partec04-004-2326
Counting Chamber (Hemacytometer)Hausser Scientific Co3200
Deoxyribonuclease I from bovine pancreasSigma AldrichD4527-40KU
Distilled waterTMO15230001
DMEM/F12Thermo Fisher11320074
DNase for RNA purificationQiagen79254
Dulbecco's phosphate-buffered salineThermo Fisher14040117
Fetal bovine serumThermo FisherA5209401
GFAP antibody (mouse)Santa Cruzsc-336731:500
GFAP antibody (rabbit)DakoZ03341:500
Goat anti-mouse 594 IgGInvitrogena110321:500
Goat anti-mouse 594 IgMInvitrogena210441:300
Goat anti-Rabbit 488 IgGInvitrogena110081:500
Iba1 antibody (rabbit)Wako019-19741:500
MACS SeparatorMiltenyi130-042-303
Masterflex C/L Pump SystemThermo Fisher77122-22
MEMCorning15-015-CV
MethanolSigma-Adlrich439193
Mounting MediumVector LaboratoriesH-1000-10
MS ColumnsMiltenyi130-042-401
O4 AntibodyR&DMAB1326
Penicillin-StreptomycinGibco15070063
Plugged 9" glass pasteur pipetteVWR14672-412
RNeasy Plus Micro KitQiagen74034
Royal-tek Surgical scalpel blade no. 10Fisher scientific22-079-683
Small Vein Infusion Set, 23 G x 19 mmKawasumiD3K2-23G

References

  1. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nat Rev Neurosci. 7, 41-53 (2006).
  2. Heithoff, B. P., et al. Astrocytes are necessary for blood-brain barrier maintenance in the adult mouse brain. Glia. 69 (2), 436-472 (2021).
  3. Badimon, A., et al. Negative feedback control of neuronal activity by microglia. Nature. 586, 417-423 (2020).
  4. Yanuck, S. F. Microglial phagocytosis of neurons: diminishing neuronal loss in traumatic, infectious, inflammatory, and autoimmune CNS disorders. Front Psychiatry. 10, 712 (2019).
  5. Xu, Y. J., Au, N. P. B., Ma, C. H. E. Functional and phenotypic diversity of microglia: implication for microglia-based therapies for alzheimer’s disease. Front Aging Neurosci. 14, 896852 (2022).
  6. Song, S., et al. Microglial-oligodendrocyte interactions in myelination and neurological function recovery after traumatic brain injury. J Neuroinflammation. 19 (1), 246 (2022).
  7. Butler, C. A., et al. Microglial phagocytosis of neurons in neurodegeneration, and its regulation. J Neurochem. 158 (3), 621-639 (2021).
  8. Voskuhl, R. R., et al. Reactive astrocytes form scar-like perivascular barriers to leukocytes during adaptive immune inflammation of the CNS. J Neurosci. 29 (37), 11511-11522 (2009).
  9. Bordon, Y. MAFG activity in astrocytes drives CNS inflammation. Nature Reviews Immunology. 20, 205 (2020).
  10. Agalave, N. M., Lane, B. T., Mody, P. H., Szabo-Pardi, T. A., Burton, M. D. Isolation, culture, and downstream characterization of primary microglia and astrocytes from adult rodent brain and spinal cord. J Neurosci Methods. 340, 108742 (2020).
  11. Kerstetter, A. E., Miller, R. H. Isolation and culture of spinal cord astrocytes. Methods in Molecular Biology. 814, 93-104 (2012).
  12. Hersbach, B. A., Simon, T., Masserdotti, G. Isolation and direct neuronal reprogramming of mouse astrocytes. J Vis Exp. (185), 64175 (2022).
  13. Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. J Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
  14. Richner, M., Jager, S. B., Siupka, P., Vaegter, C. B. Hydraulic extrusion of the spinal cord and isolation of dorsal root ganglia in rodents. J Vis Exp. (119), e55226 (2017).
  15. Davies, J., Denyer, T., Hadfield, J. Bioanalyzer chips can be used interchangeably for many analyses of DNA or RNA. Biotechniques. 60 (4), 197-199 (2016).
  16. Ahn, J. J., Islam, Y., Miller, R. H. Cell type specific isolation of primary astrocytes and microglia from adult mouse spinal cord. J Neurosci Methods. 375, 109599 (2022).
  17. Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. J Immunol Methods. 486, 112834 (2020).
  18. Neuschulz, A., et al. A single-cell RNA labeling strategy for measuring stress response upon tissue dissociation. Mol Syst Biol. 19, 11147 (2023).
  19. CB, S., et al. One brain-all cells: a comprehensive protocol to isolate all principal cns-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 1-25 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 200

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved