عزل الخلايا النجمية النقية والدبقية الصغيرة من الحبل الشوكي للفأر البالغ للمقايسات المختبرية والدراسات النسخية

Summary

يحدد هذا البروتوكول عزل الخلايا النجمية المنقاة والخلايا الدبقية الصغيرة من الحبل الشوكي للفأر البالغ ، مما يسهل التطبيقات اللاحقة مثل تحليل الحمض النووي الريبي وزراعة الخلايا. ويشمل طرق وإجراءات تفكك الخلايا التفصيلية المصممة لتحسين جودة وإنتاجية الخلايا المعزولة.

Abstract

تلعب الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة أدوارا محورية في تطوير الجهاز العصبي المركزي ، واستجابات الإصابات ، والأمراض التنكسية العصبية. تظهر هذه الخلايا الديناميكية للغاية استجابات سريعة للتغيرات البيئية وتظهر عدم تجانس كبير من حيث التشكل وملامح النسخ والوظائف. في حين أن فهمنا لوظائف الخلايا الدبقية في الصحة والمرض قد تقدم بشكل كبير ، لا تزال هناك حاجة إلى تحليلات مخبرية خاصة بالخلايا يتم إجراؤها في سياق الإهانات أو الإصابات لتوصيف مجموعات الخلايا المتميزة بشكل شامل. يوفر عزل الخلايا من الفأر البالغ العديد من المزايا على خطوط الخلايا أو الوليدية ، لأنه يسمح بتحليل الخلايا في ظل الظروف المرضية وفي نقاط زمنية محددة. علاوة على ذلك ، فإن التركيز على العزلة الخاصة بالحبل الشوكي ، باستثناء مشاركة الدماغ ، يمكن من إجراء أبحاث في أمراض الحبل الشوكي ، بما في ذلك التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي ، وإصابة الحبل الشوكي ، والتصلب الجانبي الضموري. يقدم هذا البروتوكول طريقة فعالة لعزل الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة من الحبل الشوكي للفأر البالغ ، مما يسهل التحليل الفوري أو المستقبلي مع التطبيقات المحتملة في الدراسات الوظيفية أو الجزيئية أو البروتينية.

Introduction

الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة هي خلايا دبقية متعددة الاستخدامات تلعب أدوارا حيوية في الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، وتشمل مسؤوليات مثل تنظيم وظيفة الخلايا العصبية ، والمساهمة في تطوير الجهاز العصبي المركزي ، والحفاظ على الحاجز الدموي الدماغي ، والمشاركة في العمليات الحرجة الأخرى^1،2،3،4. إلى جانب دورها في الحفاظ على الاتزان الداخلي، تلعب هذه الخلايا الدبقية أيضا دورا محوريا في آليات الإصابة والإصلاح. تشتهر الخلايا الدبقية الصغيرة بقدراتها البلعمية والالتهابية والمهاجرة بعد الإهانات أو الإصابات^5،

Protocol

تم إجراء جميع إجراءات رعاية والتجارب بعد موافقة لجنة رعاية واستخدام في كلية الطب والعلوم الصحية بجامعة جورج واشنطن (واشنطن العاصمة ، الولايات المتحدة الأمريكية ؛ واشنطن العاصمة ، الولايات المتحدة الأمريكية ، الولايات المتحدة الأمريكية ، الولايات المتحدة الأمريكية ، الولايات المتحدة الأمريكية ، الولايات المتحدة الأمريكية ، الولايات المتحدة الأمريكية ، الولايات المتحدة الأمريكية IACUC # 2021-004). استخدمت الدراسة ذكور وإناث الفئران من النوع البري C57BL / 6J (WT) الذين تتراوح أعمارهم بين 10 أسابيع و 5 أشهر ، والتي تم الحصول عليها من مورد تجاري (انظر جدول المواد) ومقرها في جامعة جورج واشنطن. يتم تقديم نظرة عامة على سير عمل البروتوكول في

النتائج

تمكن الطرق الموضحة في هذا البروتوكول من عزل الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا النجمية النقية والقابلة للحياة من الحبل الشوكي للفأر البالغ ، مما يسهل العديد من التطبيقات النهائية ، بما في ذلك المقايسات الوظيفية أو النسيجية في المختبر وتحليل الحمض النووي الريبي.

سيؤدي ?.......

Discussion

يعد عزل الخلايا الأولية النقية القابلة للحياة أمرا بالغ الأهمية لدراسة بنية ووظيفة أنواع معينة من الخلايا. في الفأر البالغ ، وخاصة في الحبل الشوكي ، تشكل هذه المهمة تحديات كبيرة ، حيث أن البروتوكولات الحالية غالبا ما تكون غير مصممة للحبل الشوكي البالغ^10,17. ي.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma Aldrich	T48402
24 well tissue culture plate	Avantor	10861-558
2-Methyl-2-butanol, 98%	Thermo Fisher	A18304-0F
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride	Invitrogen	D1306	1:1000
45% glucose solution	Corning	25-037-CI
5 mL capped tubes	Eppendorf	30122305
Acetic acid	Sigma-Adlrich	A6283
Adult Brain Dissociation Kit	Miltenyi	103-107-677
Anti-ACSA2 Microbead Kit	Miltenyi	130-097-679
Anti-Iba1	Wako	019-1974
Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939BA
C57BL/6J wild-type (WT) mice	Jackson Laboratories
CD11b (Microglia) MicroBeads	Miltenyi	130-093-634
Celltrics 30 µm filter	Sysmex Partec	04-004-2326
Counting Chamber (Hemacytometer)	Hausser Scientific Co	3200
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma Aldrich	D4527-40KU
Distilled water	TMO	15230001
DMEM/F12	Thermo Fisher	11320074
DNase for RNA purification	Qiagen	79254
Dulbecco's phosphate-buffered saline	Thermo Fisher	14040117
Fetal bovine serum	Thermo Fisher	A5209401
GFAP antibody (mouse)	Santa Cruz	sc-33673	1:500
GFAP antibody (rabbit)	Dako	Z0334	1:500
Goat anti-mouse 594 IgG	Invitrogen	a11032	1:500
Goat anti-mouse 594 IgM	Invitrogen	a21044	1:300
Goat anti-Rabbit 488 IgG	Invitrogen	a11008	1:500
Iba1 antibody (rabbit)	Wako	019-1974	1:500
MACS Separator	Miltenyi	130-042-303
Masterflex C/L Pump System	Thermo Fisher	77122-22
MEM	Corning	15-015-CV
Methanol	Sigma-Adlrich	439193
Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000-10
MS Columns	Miltenyi	130-042-401
O4 Antibody	R&D	MAB1326
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070063
Plugged 9" glass pasteur pipette	VWR	14672-412
RNeasy Plus Micro Kit	Qiagen	74034
Royal-tek Surgical scalpel blade no. 10	Fisher scientific	22-079-683
Small Vein Infusion Set, 23 G x 19 mm	Kawasumi	D3K2-23G