בידוד אסטרוציטים טהורים ותאי מיקרוגליה מחוט השדרה של העכבר הבוגר עבור בדיקות חוץ גופיות ומחקרי שעתוק

Summary

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של אסטרוציטים מטוהרים ותאי מיקרוגליה מחוט השדרה של העכבר הבוגר, ומקל על יישומים עתידיים כגון ניתוח RNA ותרבית תאים. הוא כולל שיטות ונהלים מפורטים לדיסוציאציה של תאים שנועדו לשפר הן את האיכות והן את התפוקה של תאים מבודדים.

Abstract

אסטרוציטים ותאי מיקרוגליה ממלאים תפקידים מרכזיים בהתפתחות מערכת העצבים המרכזית, תגובות פציעה ומחלות נוירודגנרטיביות. תאים דינמיים מאוד אלה מפגינים תגובות מהירות לשינויים סביבתיים ומפגינים הטרוגניות משמעותית במונחים של מורפולוגיה, פרופילי שעתוק ופונקציות. בעוד שהבנתנו את תפקודם של תאי גלייה בבריאות ובמחלות התקדמה באופן משמעותי, עדיין יש צורך בניתוחים חוץ-גופיים, ספציפיים לתאים שנערכו בהקשר של עלבונות או פציעות כדי לאפיין באופן מקיף אוכלוסיות תאים נפרדות. בידוד תאים מהעכבר הבוגר מציע מספר יתרונות על פני קווי תאים או בעלי חיים בילוד, שכן הוא מאפשר ניתוח של תאים בתנאים פתולוגיים ובנקודות זמן ספציפיות. יתר על כן, התמקדות בבידוד ספציפי לחוט השדרה, למעט מעורבות מוחית, מאפשרת מחקר על פתולוגיות של חוט השדרה, כולל אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית, פגיעה בחוט השדרה וטרשת אמיוטרופית צידית. פרוטוקול זה מציג שיטה יעילה לבידוד אסטרוציטים ותאי מיקרוגליה מחוט השדרה של העכבר הבוגר, ומאפשר ניתוח מיידי או עתידי עם יישומים פוטנציאליים במחקרים פונקציונליים, מולקולריים או פרוטאומיים במורד הזרם.

Introduction

אסטרוציטים ותאי מיקרוגליה הם תאי גלייה רב-תכליתיים הממלאים תפקידים חיוניים במערכת העצבים המרכזית (CNS), וכוללים תחומי אחריות כגון ויסות התפקוד העצבי, תרומה להתפתחות מערכת העצבים המרכזית, שמירה על מחסום הדם-מוח והשתתפות בתהליכים קריטיים אחרים 1,2,3,4 . מלבד תפקידם בשמירה על הומאוסטזיס, תאי גלייה אלה ממלאים גם תפקיד מרכזי במנגנוני פציעה ותיקון. תאי מיקרוגליה ידועים ביכולות הפאגוציטיות, הדלקתיות והנדידה שלהם בעקבות עלבונות או פציעות ^5,6,7. תגובות אסטרוציטים במחלות מגוונות באותה מידה, וכוללות תרומות לדלקת, להיווצרות צלקות גלייה ולפשרה של מחסום הדם-מוח ^8,9. למרות שהבנתנו את התפקידים המזיקים והמשניים של מיקרוגליה ואסטרוציטים במערכת העצבים המרכזית גדלה, ההטרוגניות המובנית הן במבנה והן בתפקוד שלהם מחייבת כלים חזקים לחקור אותם בהקשרים שונים.

השגת תובנה נוספת לגבי תפקידם של מיקרוגליה ואסטרוציטים בבריאות ובמחלות דורשת גישה משולבת של חקירות in vivo ו - in vitro . טכניקות In vivo ממנפות את האינטראקציה המורכבת בין תאי גלייה ונוירונים בתוך מערכת העצבים המרכזית, בעוד שמתודולוגיות in vitro מוכיחות ערך בעת הערכת תפקודים או תגובות של תא בודד תחת גירויים ספציפיים. כל שיטה מציעה יתרונות ייחודיים; מחקרי מבחנה חיוניים להבנת התפקידים הספציפיים של סוגי תאים אלה ללא קלט ישיר או עקיף מתאים שכנים. בנוסף, בדיקות במבחנה המשתמשות בקווי תאים בני אלמוות מציגות יתרונות מסוימים, כולל היכולת להתרבות ללא הגבלת זמן, יעילות כלכלית וקלות תחזוקה. עם זאת, חשוב לציין כי תאים ראשוניים מחקים באופן הדוק יותר תגובות פיזיולוגיות נורמליות בהשוואה לקווי תאים. רלוונטיות פיזיולוגית זו חיונית בבדיקות תפקודיות ובניתוחים תעתיקים.

אחד האתגרים בהשגת תאים ראשוניים, במיוחד מחוט השדרה של עכבר בוגר, טמון בכמות ובכדאיות הדגימות. חוט השדרה הבוגר, בהיותו קטן יותר מהמוח ומכיל כמות משמעותית של מיאלין, מציב קשיים ייחודיים. בעוד שישנם מספר פרוטוקולים שפורסמו המפרטים את הבידוד של תאי גלייה טהורים וברי קיימא מבעלי חיים בילודים או ממוח העכבר הבוגר 10,11,12,13, מתודולוגיות אלה עשויות שלא להתאים לחקר מחלות ופציעות ספציפיות לחוט השדרה. בפרוטוקול זה, אנו מציעים הליך מקיף לבידוד יעיל של מיקרוגליה ואסטרוציטים טהורים וברי קיימא מחוט השדרה של העכבר הבוגר, מה שמקל על יישומים במורד הזרם בתרביות תאים ובניתוחי שעתוק. פרוטוקול זה שימש בהצלחה לבידוד תאים אלה מעכברים בוגרים בגילאי 10 שבועות עד 5 חודשים, והדגים את יעילותו בהקשרים שונים, כולל מחקרים שכללו עכברי נוקאאוט מותנה, תגובות לתרופות, מחקר התפתחותי ומודלים הקשורים לגיל.

Protocol

כל הליכי הטיפול בבעלי חיים והניסויים נערכו לאחר אישור הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים בבית הספר לרפואה ומדעי הבריאות של אוניברסיטת ג'ורג' וושינגטון (וושינגטון הבירה, ארה"ב; IACUC #2021-004). המחקר כלל עכברים זכרים ונקבות מסוג C57BL/6J (WT) בגילאי 10 שבועות עד 5 חודשים, שמקורם בספק מסחרי (ראו טבלת חומרים) ושוכנו באוניברסיטת ג'ורג' וושינגטון. סקירה כללית של זרימת העבודה של הפרוטוקול מוצגת באיור 1.

1. הכנת חוט השדרה

1. מרדימים את בעלי החיים באמצעות אברטין (12.5 מ"ג/מ"ל של 2,2,2-טריברומואתנול ו-2.5% 2-מתיל-2-בוטנול במים סטריליים) (ראו טבלת חומרים). אשר את היעדר התגובה לצביטות בבוהן ובזנב בעכברים.
2. בצע זילוח לב עם מי מלח חוצצים פוספט (DPBS) קר 1x Dulbecco כדי להסיר תאים חד-גרעיניים היקפיים בדם.
   1. מניחים את החיה על מגש רדוד ולבצע חתך לרוחב כדי לחשוף את חלל pleural. הכנס מחט זילוח 23 G המחוברת למשאבה פריסטלטית (ראה טבלת חומרים) לחדר השמאלי והפעל את המשאבה. ברגע DPBS קר זורם דרך הלב, ליצור חתך קטן באטריום הימני.
      הערה: קצב זילוח מהיר יותר עדיף בשלב זה כדי לשפר את כדאיות התא. יש לשטוף את הדם תוך פחות מדקה. ניקוי הכבד מצביע על זילוח מוצלח.
3. ערפו את ראשו של בעל החיים באמצעות מספריים גדולים והסירו את עמוד השדרה¹⁴. טבלו אותו ב-DPBS קר 1x עם Ca²⁺/Mg²⁺/0.2% גלוקוז בצלחת פטרי על קרח לשטיפת רקמות.
4. החל מעכשיו, ודא שכל השלבים מתבצעים בסביבה סטרילית. השתמש בשחול הידראולי¹⁴ כדי לבודד את חוט השדרה כולו. השתמש במחט 18 גרם ומזרק 10 מ"ל מלא DPBS קר 1x עם Ca²⁺/Mg²⁺/0.2% גלוקוז. העבירו את חוט השדרה לצלוחית פטרי המונחת על שקיות קרח המכילות מספיק DPBS קר 1x עם Ca²⁺/Mg²⁺/0.2% גלוקוז כדי לטבול את הרקמה כולה.
5. בזהירות להסיר את קרומי המוח תחת מיקרוסקופ בתוך מכסה מנוע זרימה למינרית. מעבירים את חוט השדרה לצלחת פטרי ריקה על חבילות קרח, ובאמצעות אזמל כירורגי מס '10 להב, חותכים את חוט השדרה כולו למקטעים של 2-3 מ"מ.

2. דיסוציאציה אנזימטית של תאים

1. הוסף תערובת אנזימים 1 ותערובת אנזימים 2 מערכת הדיסוציאציה המוחית למבוגרים הזמינה באופן מסחרי בהתאם לפרוטוקול היצרן (ראה טבלת חומרים). מערבלים את האנזימים בצלחת מספר פעמים כדי להבטיח ציפוי אחיד של חוט השדרה, ואז דוגרים בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות. כל 5 דקות, מערבלים בעדינות את המנה כדי למנוע גושי רקמות ולהקל על הפצה אחידה של ריאגנטים.
2. מוציאים את הצלוחית מהאינקובטור ומוסיפים 350 μL של 0.46 מ"ג/מ"ל DNAse I ב-Minimal Essential Medium (MEM) (ראה טבלת חומרים). מערבבים בעדינות.
3. יש להוסיף 1 מ"ל של DMEM קר/סרום בקר עוברי 0.5% (FBS) ולערבב בעדינות. מיד להעביר את התוכן כולו לצינור 5 מ"ל.

3. דיסוציאציה מכנית של תאים

1. באמצעות פיפטה P1000, Triturate בעדינות את הרקמה שלוש פעמים, להבטיח כי חתיכות רקמה נמשכים בכל פעם כדי לנתק עוד יותר את הרקמה. לאחר מכן, באמצעות פיפטה פסטר מזכוכית 9 אינץ' מחוברת, טרטור בעדינות חמש פעמים נוספות, כדי להבטיח שלא ייווצרו בועות במהלך התהליך.
2. מניחים את הצינור 5 מ"ל זקוף ומאפשרים לרקמה להתיישב בתחתית במשך 30 שניות. לאחר שהרקמה התיישבה, ציירו את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה P1000 והעבירו אותו דרך מסנן של 30 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי של 15 מ"ל.
3. לאותו צינור 5 מ"ל עם הרקמה הנותרת, הוסף 1 מ"ל של DMEM קר / 0.5% FBS. בעזרת פיפטה של פסטר, טריטורט בעדינות שלוש פעמים.
4. תנו לרקמה לשקוע בתחתית למשך 30 שניות, ואז העבירו את הסופרנאטנט דרך מסנן של 30 מיקרומטר ואספו אותו לאותו צינור של 15 מ"ל כמו קודם. חזור על שלב 3.3 ושלב 3.4 פעם נוספת.
5. צנטריפוגה את מתלה התא המסונן ב 300 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT). בזהירות להסיר ולהשליך את supernatant שנוצר באמצעות שואב ואקום.

4. הסרת מיאלין

1. הסר את המיאלין באמצעות הפתרון להסרת פסולת (DRS) המסופק בערכת דיסוציאציה מוחית למבוגרים בהתאם לפרוטוקול היצרן. לאחר הסרת הפסולת, הוסף 5 מ"ל של DMEM קר / 0.5% FBS לגלולת התא והפוך בעדינות את הצינור שלוש פעמים. צנטריפוגה את מתלה התא ב 300 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
   הערה: אם התאים ישמשו למחקרי מבחנה ויישארו בתרבית, יש להשתמש במקום זאת ב- DMEM / 0.5% FBS שחומם מראש.
2. יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את כדורית התא ב-1 מ"ל של DPBS/0.5% FBS (קר למחקרי RNA וחם לבדיקות במבחנה ). ספרו את התאים והעריכו את הכדאיות באמצעות Trypan Blue.
   הערה: ניתן לשלב תרחיפים של תאים מבעלי חיים מרובים כדי להגדיל את ריכוז התאים.
3. שטף את התאים על-ידי הוספת DPBS/0.5% FBS עד לנפח כולל של 5 מ"ל. צנטריפוגו את המתלים ב 300 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר והשליכו את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה.

5. בידוד מיקרוגליה ואסטרוציטים

1. תייג את התאים עם מיקרו-כדוריות אנטי-CD11b או אנטי-ACSA-2 בהתאם לפרוטוקול היצרן (ראה טבלת חומרים).
2. מיין את התאים לפי בחירה חיובית באמצעות עמודות MS בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים). לאחר המיון, צנטריפוגו את התאים הממוינים ב 300 x גרם במשך 10 דקות ולזרוק את supernatant.

6. ציפוי תאים לבדיקות חוץ גופיות

הערה: אם התאים לא יהיו מצופים וישמשו באופן מיידי לניתוח RNA, המשך לשלב 8.

1. להשעות מחדש את התאים ב 1 מ"ל של DMEM חם / 0.5% FBS. ספרו את התאים והעריכו את יכולת הקיום שלהם באמצעות המציטומטר (ראו טבלת חומרים).
2. כוונן את ריכוז התא ל- 75,000 תאים לכל 50 מיקרוליטר. הוסף 50 μL של תרחיף התא לכל כיסוי מצופה פולי-L-ליזין¹¹ בצלחת של 24 בארות.
3. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך שעתיים כדי לאפשר לתאים להיצמד לכיסוי.
4. יש להוסיף בזהירות 450 μL של DMEM חם/5% FBS/פניצילין-סטרפטומיצין (Pen-Strep, ראו טבלת חומרים) לכל באר.
5. לאחר 3 ימים, החלף מחצית מהמדיה ב- 250 μL של DMEM חם / 5% FBS / Pen-Strep. לתחזוקה, החלף לחלוטין את המדיה עם 500 μL של DMEM חם / 5% FBS / Pen-Strep כל 4-5 ימים.

7. אימונוהיסטוכימיה

הערה: עדיף לבצע ניתוחים אימונוהיסטוכימיים לאחר 3 ימים לפחות כאשר המדיה הוחלפה לפחות פעם אחת. זה מבטיח שהפסולת הוסרה והתאים נדבקו לחלוטין לכיסוי.

1. הסר את המדיה ותייג את התאים עם mAb O4 נגד עכבר (1:100) (ראה טבלת חומרים) בסרום DMEM חם/5% FBS/10% רגיל של עזים (NGS) למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT) או ב-37°C.
   הערה: דלג על שלב זה והמשך לשלב 7.3 אם התאים לא יסומנו ב- O4.
2. שטפו בעדינות את הכיסויים על ידי טבילתם ב-DMEM/5% FBS חם שלוש פעמים. הוסף עז נגד עכבר 594 IgM (1: 300) (ראה רשימת חומרים) ב- DMEM חם / 5% FBS / 10% NGS ודגור ב- RT במשך 15 דקות בחושך. יש לשטוף בעדינות שלוש פעמים ב-DMEM חם/FBS 5%.
3. תקן את התאים עם 5% חומצה אצטית / מתנול קר במשך 15 דקות ב 4 ° C. יש לשטוף שלוש פעמים עם 1x PBS, ולאחר מכן לתייג עם הנוגדן המתאים: GFAP נגד ארנבים (1: 500), GFAP נגד עכבר (1: 500), או נגד ארנב Iba1 (1: 500) ב 1% Triton-X100/10% NGS ב 1x DPBS (ראה טבלת חומרים). דגירה במשך שעה אחת ב- RT.
   הערה: יש לשמור את הכיסויים בחושך אם הם כבר הוכתמו ב-O4.
4. יש לשטוף בעדינות שלוש פעמים עם PBS. תווית עם הנוגדן המשני המתאים: נגד עכבר 594 IgG (1: 500), נגד ארנב 488 IgG (1: 500) (ראה טבלת חומרים). דגירה במשך 30 דקות ב- RT בחושך.
5. יש לשטוף בעדינות שלוש פעמים עם PBS. כתם נגדי עם DAPI (1:1000) למשך דקה אחת ב-RT. יש לשטוף שלוש פעמים עם PBS, להוסיף אמצעי הרכבה (ראו טבלת חומרים) ולהרכיב כיסויים על שקופיות.

8. מיצוי RNA

הערה: באופן אידיאלי, צריכים להיות לפחות 100,000 תאים כדי לחלץ מספיק RNA לניתוח. במידת הצורך, ניתן לשלב תאים מ 2-3 חוטי שדרה.

1. חלץ RNA באמצעות ערכת בידוד RNA מסחרית בהתאם לפרוטוקול היצרן (ראה טבלת חומרים). עבור כל שלב שטיפה עם חיץ הכביסה RW1 המסופק בערכה, השאירו את התאים במאגר הכביסה למשך 2 דקות נוספות.
2. הסר את כל הדנ"א הגנומי שנותר באמצעות DNase I בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים). יש לדגור עם DNase ב-RT למשך 15 דקות, ולאחר מכן לשטוף עם חיץ RW1.
3. כדי להגדיל את תפוקת הרנ"א, לפני ההדבקה, יש לדגור על הדגימות במים נטולי RNAse ב-RT למשך 10 דקות. להעריך את שלמות הרנ"א ואת כמותו, באמצעות ביואנלייזר¹⁵ (ראה טבלת חומרים).

תוצאות

השיטות המתוארות בפרוטוקול זה מאפשרות בידוד של מיקרוגליה ואסטרוציטים טהורים וברי קיימא מחוט השדרה של העכבר הבוגר, ומקלות על יישומים שונים במורד הזרם, כולל בדיקות פונקציונליות או היסטולוגיות במבחנה וניתוח RNA.

בידוד מוצלח למחקרי מבחנה יביא להתרבות תאים רציפה במשך מ...

Discussion

הבידוד של תאים ראשוניים טהורים וברי קיימא הוא בעל חשיבות עליונה לחקר המבנה והתפקוד של סוגי תאים ספציפיים. בעכבר בוגר, במיוחד בחוט השדרה, משימה זו מציבה אתגרים משמעותיים, מכיוון שהפרוטוקולים הקיימים לרוב אינם מותאמים לחוט השדרה הבוגר^10,17. פרוטוקול זה מציג שי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma Aldrich	T48402
24 well tissue culture plate	Avantor	10861-558
2-Methyl-2-butanol, 98%	Thermo Fisher	A18304-0F
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride	Invitrogen	D1306	1:1000
45% glucose solution	Corning	25-037-CI
5 mL capped tubes	Eppendorf	30122305
Acetic acid	Sigma-Adlrich	A6283
Adult Brain Dissociation Kit	Miltenyi	103-107-677
Anti-ACSA2 Microbead Kit	Miltenyi	130-097-679
Anti-Iba1	Wako	019-1974
Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939BA
C57BL/6J wild-type (WT) mice	Jackson Laboratories
CD11b (Microglia) MicroBeads	Miltenyi	130-093-634
Celltrics 30 µm filter	Sysmex Partec	04-004-2326
Counting Chamber (Hemacytometer)	Hausser Scientific Co	3200
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma Aldrich	D4527-40KU
Distilled water	TMO	15230001
DMEM/F12	Thermo Fisher	11320074
DNase for RNA purification	Qiagen	79254
Dulbecco's phosphate-buffered saline	Thermo Fisher	14040117
Fetal bovine serum	Thermo Fisher	A5209401
GFAP antibody (mouse)	Santa Cruz	sc-33673	1:500
GFAP antibody (rabbit)	Dako	Z0334	1:500
Goat anti-mouse 594 IgG	Invitrogen	a11032	1:500
Goat anti-mouse 594 IgM	Invitrogen	a21044	1:300
Goat anti-Rabbit 488 IgG	Invitrogen	a11008	1:500
Iba1 antibody (rabbit)	Wako	019-1974	1:500
MACS Separator	Miltenyi	130-042-303
Masterflex C/L Pump System	Thermo Fisher	77122-22
MEM	Corning	15-015-CV
Methanol	Sigma-Adlrich	439193
Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000-10
MS Columns	Miltenyi	130-042-401
O4 Antibody	R&D	MAB1326
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070063
Plugged 9" glass pasteur pipette	VWR	14672-412
RNeasy Plus Micro Kit	Qiagen	74034
Royal-tek Surgical scalpel blade no. 10	Fisher scientific	22-079-683
Small Vein Infusion Set, 23 G x 19 mm	Kawasumi	D3K2-23G