A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של אסטרוציטים מטוהרים ותאי מיקרוגליה מחוט השדרה של העכבר הבוגר, ומקל על יישומים עתידיים כגון ניתוח RNA ותרבית תאים. הוא כולל שיטות ונהלים מפורטים לדיסוציאציה של תאים שנועדו לשפר הן את האיכות והן את התפוקה של תאים מבודדים.

Abstract

אסטרוציטים ותאי מיקרוגליה ממלאים תפקידים מרכזיים בהתפתחות מערכת העצבים המרכזית, תגובות פציעה ומחלות נוירודגנרטיביות. תאים דינמיים מאוד אלה מפגינים תגובות מהירות לשינויים סביבתיים ומפגינים הטרוגניות משמעותית במונחים של מורפולוגיה, פרופילי שעתוק ופונקציות. בעוד שהבנתנו את תפקודם של תאי גלייה בבריאות ובמחלות התקדמה באופן משמעותי, עדיין יש צורך בניתוחים חוץ-גופיים, ספציפיים לתאים שנערכו בהקשר של עלבונות או פציעות כדי לאפיין באופן מקיף אוכלוסיות תאים נפרדות. בידוד תאים מהעכבר הבוגר מציע מספר יתרונות על פני קווי תאים או בעלי חיים בילוד, שכן הוא מאפשר ניתוח של תאים בתנאים פתולוגיים ובנקודות זמן ספציפיות. יתר על כן, התמקדות בבידוד ספציפי לחוט השדרה, למעט מעורבות מוחית, מאפשרת מחקר על פתולוגיות של חוט השדרה, כולל אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית, פגיעה בחוט השדרה וטרשת אמיוטרופית צידית. פרוטוקול זה מציג שיטה יעילה לבידוד אסטרוציטים ותאי מיקרוגליה מחוט השדרה של העכבר הבוגר, ומאפשר ניתוח מיידי או עתידי עם יישומים פוטנציאליים במחקרים פונקציונליים, מולקולריים או פרוטאומיים במורד הזרם.

Introduction

אסטרוציטים ותאי מיקרוגליה הם תאי גלייה רב-תכליתיים הממלאים תפקידים חיוניים במערכת העצבים המרכזית (CNS), וכוללים תחומי אחריות כגון ויסות התפקוד העצבי, תרומה להתפתחות מערכת העצבים המרכזית, שמירה על מחסום הדם-מוח והשתתפות בתהליכים קריטיים אחרים 1,2,3,4 . מלבד תפקידם בשמירה על הומאוסטזיס, תאי גלייה אלה ממלאים גם תפקיד מרכזי במנגנוני פציעה ותיקון. תאי מיקרוגליה ידועים ביכולות הפאגוציטיות, הדלקתיות והנדידה שלהם בעקבות עלבונות או פציעות 5,6,7. תגובות אסטרו....

Protocol

כל הליכי הטיפול בבעלי חיים והניסויים נערכו לאחר אישור הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים בבית הספר לרפואה ומדעי הבריאות של אוניברסיטת ג'ורג' וושינגטון (וושינגטון הבירה, ארה"ב; IACUC #2021-004). המחקר כלל עכברים זכרים ונקבות מסוג C57BL/6J (WT) בגילאי 10 שבועות עד 5 חודשים, שמקורם בספק מסחרי (ראו טבלת חומרים) ושוכנו באוניברסיטת ג'ורג' וושינגטון. סקירה כללית של זרימת העבודה של הפרוטוקול מוצגת באיור 1.

1. הכנת חוט השדרה

  1. מרדימים את בעלי החיים באמצעות אברטין (12.5 מ"ג/מ"ל של 2,2,2-טריברומואתנול ו-2.5% 2-מתיל-2-בוטנול במים סטריליים) (ראו טבלת חומרים). אשר את הי....

תוצאות

השיטות המתוארות בפרוטוקול זה מאפשרות בידוד של מיקרוגליה ואסטרוציטים טהורים וברי קיימא מחוט השדרה של העכבר הבוגר, ומקלות על יישומים שונים במורד הזרם, כולל בדיקות פונקציונליות או היסטולוגיות במבחנה וניתוח RNA.

בידוד מוצלח למחקרי מבחנה יביא להתרבות תאים רציפה במשך מ.......

Discussion

הבידוד של תאים ראשוניים טהורים וברי קיימא הוא בעל חשיבות עליונה לחקר המבנה והתפקוד של סוגי תאים ספציפיים. בעכבר בוגר, במיוחד בחוט השדרה, משימה זו מציבה אתגרים משמעותיים, מכיוון שהפרוטוקולים הקיימים לרוב אינם מותאמים לחוט השדרה הבוגר10,17. פרוטוקול זה מציג שי?.......

Disclosures

ללא

Acknowledgements

אנו מודים לקאסל ראלי ב-George Washington University Genomics Core עבור ניתוחי RNA ול-Q2 Lab Solutions עבור ניתוחי ריצוף RNA. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ מוחי [מענק מספר F31NS117085] וקרן המחקר ע"ש ויויאן גיל לד"ר רוברט ה. מילר. איור 1 נוצר באמצעות BioRender.com.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2,2,2-TribromoethanolSigma AldrichT48402
24 well tissue culture plateAvantor10861-558
2-Methyl-2-butanol, 98%Thermo FisherA18304-0F
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, DihydrochlorideInvitrogenD13061:1000
45% glucose solutionCorning25-037-CI
5 mL capped tubesEppendorf30122305
Acetic acidSigma-AdlrichA6283
Adult Brain Dissociation KitMiltenyi103-107-677
Anti-ACSA2 Microbead KitMiltenyi130-097-679
Anti-Iba1Wako019-1974
BioanalyzerAgilent TechnologiesG2939BA
C57BL/6J wild-type (WT) mice Jackson Laboratories
CD11b (Microglia) MicroBeadsMiltenyi130-093-634
Celltrics 30 µm filterSysmex Partec04-004-2326
Counting Chamber (Hemacytometer)Hausser Scientific Co3200
Deoxyribonuclease I from bovine pancreasSigma AldrichD4527-40KU
Distilled waterTMO15230001
DMEM/F12Thermo Fisher11320074
DNase for RNA purificationQiagen79254
Dulbecco's phosphate-buffered salineThermo Fisher14040117
Fetal bovine serumThermo FisherA5209401
GFAP antibody (mouse)Santa Cruzsc-336731:500
GFAP antibody (rabbit)DakoZ03341:500
Goat anti-mouse 594 IgGInvitrogena110321:500
Goat anti-mouse 594 IgMInvitrogena210441:300
Goat anti-Rabbit 488 IgGInvitrogena110081:500
Iba1 antibody (rabbit)Wako019-19741:500
MACS SeparatorMiltenyi130-042-303
Masterflex C/L Pump SystemThermo Fisher77122-22
MEMCorning15-015-CV
MethanolSigma-Adlrich439193
Mounting MediumVector LaboratoriesH-1000-10
MS ColumnsMiltenyi130-042-401
O4 AntibodyR&DMAB1326
Penicillin-StreptomycinGibco15070063
Plugged 9" glass pasteur pipetteVWR14672-412
RNeasy Plus Micro KitQiagen74034
Royal-tek Surgical scalpel blade no. 10Fisher scientific22-079-683
Small Vein Infusion Set, 23 G x 19 mmKawasumiD3K2-23G

References

  1. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nat Rev Neurosci. 7, 41-53 (2006).
  2. Heithoff, B. P., et al. Astrocytes are necessary for blo....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE200

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved