Isolierung von reinen Astrozyten und Mikroglia aus dem Rückenmark adulter Mäuse für In-vitro-Assays und Transkriptomstudien

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von gereinigten Astrozyten und Mikroglia aus dem Rückenmark der erwachsenen Maus und erleichtert spätere Anwendungen wie RNA-Analyse und Zellkultur. Es umfasst detaillierte Zelldissoziationsmethoden und -verfahren, die darauf ausgelegt sind, sowohl die Qualität als auch die Ausbeute isolierter Zellen zu verbessern.

Zusammenfassung

Astrozyten und Mikroglia spielen eine zentrale Rolle bei der Entwicklung des zentralen Nervensystems, bei Verletzungsreaktionen und bei neurodegenerativen Erkrankungen. Diese hochdynamischen Zellen reagieren schnell auf Umweltveränderungen und weisen eine signifikante Heterogenität in Bezug auf Morphologie, Transkriptionsprofile und Funktionen auf. Während unser Verständnis der Funktionen von Gliazellen in Gesundheit und Krankheit erheblich fortgeschritten ist, besteht nach wie vor Bedarf an zellspezifischen In-vitro-Analysen, die im Zusammenhang mit Beleidigungen oder Verletzungen durchgeführt werden, um unterschiedliche Zellpopulationen umfassend zu charakterisieren. Die Isolierung von Zellen aus der adulten Maus bietet mehrere Vorteile gegenüber Zelllinien oder neonatalen Tieren, da sie die Analyse von Zellen unter pathologischen Bedingungen und zu bestimmten Zeitpunkten ermöglicht. Darüber hinaus ermöglicht die Fokussierung auf die rückenmarksspezifische Isolierung unter Ausschluss der Hirnbeteiligung die Erforschung von Rückenmarkspathologien, einschließlich experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis, Rückenmarksverletzungen und amyotropher Lateralsklerose. Dieses Protokoll stellt eine effiziente Methode zur Isolierung von Astrozyten und Mikroglia aus dem Rückenmark der erwachsenen Maus dar und erleichtert die unmittelbare oder zukünftige Analyse mit potenziellen Anwendungen in funktionellen, molekularen oder proteomischen Downstream-Studien.

Einleitung

Astrozyten und Mikroglia sind vielseitige Gliazellen, die eine wichtige Rolle im zentralen Nervensystem (ZNS) spielen und Aufgaben wie die Regulierung der neuronalen Funktion, den Beitrag zur Entwicklung des ZNS, die Aufrechterhaltung der Blut-Hirn-Schranke und die Beteiligung an anderen kritischen Prozessen übernehmen 1,2,3,4 . Neben ihrer Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase spielen diese Gliazellen auch eine zentrale Rolle bei Verletzungs- und Reparaturmechanismen. Mikroglia sind bekannt für ihre phagozytären, entzündlichen und ....

Protokoll

Alle Tierpflege- und Versuchsverfahren wurden nach Genehmigung des Animal Care and Use Committee an der George Washington University School of Medicine and Health Sciences (Washington, D.C., USA; IACUC#2021-004). Für die Studie wurden männliche und weibliche C57BL/6J-Wildtyp-Mäuse (WT) im Alter von 10 Wochen bis 5 Monaten verwendet, die von einem kommerziellen Lieferanten bezogen wurden (siehe Materialtabelle) und an der George Washington University untergebracht waren. Eine Übersicht über den Protokollworkflow ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Vorbereitung des Rückenmarks

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Diskussion

Die Isolierung reiner, lebensfähiger Primärzellen ist von größter Bedeutung, um die Struktur und Funktion bestimmter Zelltypen zu untersuchen. Bei der adulten Maus, insbesondere im Rückenmark, stellt diese Aufgabe erhebliche Herausforderungen dar, da bestehende Protokolle oft nicht auf das adulte Rückenmark zugeschnitten sind^10,17. Dieses Protokoll stellt eine effiziente und kostengünstige Methode dar, die für verschiedene nachgelagerte Anwendungen anwend.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma Aldrich	T48402
24 well tissue culture plate	Avantor	10861-558
2-Methyl-2-butanol, 98%	Thermo Fisher	A18304-0F
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride	Invitrogen	D1306	1:1000
45% glucose solution	Corning	25-037-CI
5 mL capped tubes	Eppendorf	30122305
Acetic acid	Sigma-Adlrich	A6283
Adult Brain Dissociation Kit	Miltenyi	103-107-677
Anti-ACSA2 Microbead Kit	Miltenyi	130-097-679
Anti-Iba1	Wako	019-1974
Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939BA
C57BL/6J wild-type (WT) mice	Jackson Laboratories
CD11b (Microglia) MicroBeads	Miltenyi	130-093-634
Celltrics 30 µm filter	Sysmex Partec	04-004-2326
Counting Chamber (Hemacytometer)	Hausser Scientific Co	3200
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma Aldrich	D4527-40KU
Distilled water	TMO	15230001
DMEM/F12	Thermo Fisher	11320074
DNase for RNA purification	Qiagen	79254
Dulbecco's phosphate-buffered saline	Thermo Fisher	14040117
Fetal bovine serum	Thermo Fisher	A5209401
GFAP antibody (mouse)	Santa Cruz	sc-33673	1:500
GFAP antibody (rabbit)	Dako	Z0334	1:500
Goat anti-mouse 594 IgG	Invitrogen	a11032	1:500
Goat anti-mouse 594 IgM	Invitrogen	a21044	1:300
Goat anti-Rabbit 488 IgG	Invitrogen	a11008	1:500
Iba1 antibody (rabbit)	Wako	019-1974	1:500
MACS Separator	Miltenyi	130-042-303
Masterflex C/L Pump System	Thermo Fisher	77122-22
MEM	Corning	15-015-CV
Methanol	Sigma-Adlrich	439193
Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000-10
MS Columns	Miltenyi	130-042-401
O4 Antibody	R&D	MAB1326
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070063
Plugged 9" glass pasteur pipette	VWR	14672-412
RNeasy Plus Micro Kit	Qiagen	74034
Royal-tek Surgical scalpel blade no. 10	Fisher scientific	22-079-683
Small Vein Infusion Set, 23 G x 19 mm	Kawasumi	D3K2-23G