Aislamiento de astrocitos puros y microglía de la médula espinal de ratón adulto para ensayos in vitro y estudios transcriptómicos

Resumen

Este protocolo describe el aislamiento de astrocitos y microglía purificados de la médula espinal de ratones adultos, lo que facilita aplicaciones posteriores como el análisis de ARN y el cultivo celular. Incluye métodos detallados de disociación celular y procedimientos diseñados para mejorar tanto la calidad como el rendimiento de las células aisladas.

Resumen

Los astrocitos y la microglía desempeñan un papel fundamental en el desarrollo del sistema nervioso central, las respuestas a lesiones y las enfermedades neurodegenerativas. Estas células altamente dinámicas exhiben respuestas rápidas a los cambios ambientales y muestran una heterogeneidad significativa en términos de morfología, perfiles transcripcionales y funciones. Si bien nuestra comprensión de las funciones de las células gliales en la salud y la enfermedad ha avanzado sustancialmente, sigue siendo necesario realizar análisis in vitro específicos de células en el contexto de lesiones o lesiones para caracterizar de manera exhaustiva las distintas poblaciones celulares. El aislamiento de células del ratón adulto ofrece varias ventajas sobre las líneas celulares o los animales neonatos, ya que permite el análisis de células en condiciones patológicas y en momentos específicos. Además, centrarse en el aislamiento específico de la médula espinal, excluyendo la afectación cerebral, permite investigar patologías de la médula espinal, incluida la encefalomielitis autoinmune experimental, la lesión de la médula espinal y la esclerosis lateral amiotrófica. Este protocolo presenta un método eficiente para aislar astrocitos y microglía de la médula espinal del ratón adulto, lo que facilita el análisis inmediato o futuro con aplicaciones potenciales en estudios funcionales, moleculares o proteómicos posteriores.

Introducción

Los astrocitos y la microglía son células gliales versátiles que desempeñan funciones vitales en el sistema nervioso central (SNC), abarcando responsabilidades como la regulación de la función neuronal, la contribución al desarrollo del SNC, el mantenimiento de la barrera hematoencefálica y la participación en otros procesos críticos 1,2,3,4 . Además de su papel en el mantenimiento de la homeostasis, estas células gliales también desempeñan un papel fundamental en los mecanismos de lesión y reparación. Las microglías son bien conocidas por s....

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales y de cuidado de los animales se llevaron a cabo tras la aprobación del Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud de la Universidad George Washington (Washington, D.C., EE. UU.; IACUC#2021-004). El estudio utilizó ratones machos y hembras C57BL/6J de tipo salvaje (WT) de 10 semanas a 5 meses, que se obtuvieron de un proveedor comercial (ver Tabla de materiales) y se alojaron en la Universidad George Washington. En la Figura 1 se presenta una descripción general del flujo de trabajo del protocolo.

1. Prepara....

Discusión

El aislamiento de células primarias puras y viables es primordial para investigar la estructura y función de tipos celulares específicos. En el ratón adulto, particularmente en la médula espinal, esta tarea plantea desafíos significativos, ya que los protocolos existentes a menudo no se adaptan a la médula espinal adulta^10,17. Este protocolo presenta un método eficiente y rentable aplicable a diversas aplicaciones posteriores, incluidos los cultivos celul.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma Aldrich	T48402
24 well tissue culture plate	Avantor	10861-558
2-Methyl-2-butanol, 98%	Thermo Fisher	A18304-0F
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride	Invitrogen	D1306	1:1000
45% glucose solution	Corning	25-037-CI
5 mL capped tubes	Eppendorf	30122305
Acetic acid	Sigma-Adlrich	A6283
Adult Brain Dissociation Kit	Miltenyi	103-107-677
Anti-ACSA2 Microbead Kit	Miltenyi	130-097-679
Anti-Iba1	Wako	019-1974
Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939BA
C57BL/6J wild-type (WT) mice	Jackson Laboratories
CD11b (Microglia) MicroBeads	Miltenyi	130-093-634
Celltrics 30 µm filter	Sysmex Partec	04-004-2326
Counting Chamber (Hemacytometer)	Hausser Scientific Co	3200
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma Aldrich	D4527-40KU
Distilled water	TMO	15230001
DMEM/F12	Thermo Fisher	11320074
DNase for RNA purification	Qiagen	79254
Dulbecco's phosphate-buffered saline	Thermo Fisher	14040117
Fetal bovine serum	Thermo Fisher	A5209401
GFAP antibody (mouse)	Santa Cruz	sc-33673	1:500
GFAP antibody (rabbit)	Dako	Z0334	1:500
Goat anti-mouse 594 IgG	Invitrogen	a11032	1:500
Goat anti-mouse 594 IgM	Invitrogen	a21044	1:300
Goat anti-Rabbit 488 IgG	Invitrogen	a11008	1:500
Iba1 antibody (rabbit)	Wako	019-1974	1:500
MACS Separator	Miltenyi	130-042-303
Masterflex C/L Pump System	Thermo Fisher	77122-22
MEM	Corning	15-015-CV
Methanol	Sigma-Adlrich	439193
Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000-10
MS Columns	Miltenyi	130-042-401
O4 Antibody	R&D	MAB1326
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070063
Plugged 9" glass pasteur pipette	VWR	14672-412
RNeasy Plus Micro Kit	Qiagen	74034
Royal-tek Surgical scalpel blade no. 10	Fisher scientific	22-079-683
Small Vein Infusion Set, 23 G x 19 mm	Kawasumi	D3K2-23G