成体マウス脊髄からの純粋なアストロサイトおよびミクログリアの単離(Isolation of Pure Astrocytes and Microglia from the Adult Mouse Spinal Cord for the In Vitro Assays and Transcriptomic Studies)

要約

このプロトコルはRNAの分析および細胞培養のようなそれに続く適用を促進する大人のマウス脊髄からの浄化されたastrocytesそしてミクログリアの隔離を概説する。これには、単離された細胞の品質と収量の両方を向上させるように設計された詳細な細胞解離方法と手順が含まれています。

要約

アストロサイトとミクログリアは、中枢神経系の発達、損傷反応、神経変性疾患において極めて重要な役割を果たしています。これらの非常に動的な細胞は、環境変化に迅速に応答し、形態、転写プロファイル、および機能の点で有意な不均一性を示します。健康と疾患におけるグリア細胞の機能に関する理解は大幅に進歩しましたが、異なる細胞集団を包括的に特徴付けるために、侮辱または損傷の文脈で実施される in vitroの細胞特異的分析の必要性が残っています。成体マウスから細胞を単離すると、病理学的条件下および特定の時点での細胞の分析が可能になるため、細胞株や新生児動物に比べていくつかの利点があります。さらに、脳病変を除いた脊髄特異的な単離に着目することで、実験的自己免疫性脳脊髄炎、脊髄損傷、筋萎縮性側索硬化症などの脊髄病態の研究が可能になります。このプロトコルは、成体マウスの脊髄からアストロサイトとミクログリアを分離するための効率的な方法を示し、機能的、分子的、またはプロテオミクス下流研究における潜在的なアプリケーションとの即時または将来の分析を促進します。

概要

アストロサイトとミクログリアは、中枢神経系(CNS)で重要な役割を果たす汎用性の高いグリア細胞であり、神経機能の調節、中枢神経系の発達への寄与、血液脳関門の維持、その他の重要なプロセスへの参加などの役割を担っています^1,2,3,4.これらのグリア細胞は、ホメオスタシスの維持における役割に加えて、損傷や修復のメカニズムにおいても極めて重要な役割を果たしています。ミクログリアは、侮辱や傷害に続く貪食、炎症、および遊走能力でよく知られています^5,6,7。疾患におけるアストロサイトの応答も同様に多様であり、炎症、グリア瘢痕の形成、および血液脳関門の損傷への寄与を網羅しています^8,9。中枢神経系におけるミクログリアとアストロサイトの有害および修復的な役割についての理解は深まっていますが、それらの構造と機能の両方に固有の不均一性は、さまざまな状況でそれらを研究するための堅牢なツールを必要と....

プロトコル

すべての動物飼育および実験手順は、ジョージワシントン大学医学部および健康科学部(米国ワシントンD.C.;IACUC#2021-004)です。この研究では、生後10週間から5ヶ月の雌雄のC57BL/6J野生型(WT)マウスを使用し、ジョージワシントン大学に収容された商業サプライヤー( 資料表を参照)から調達しました。プロトコルのワークフローの概要を 図1に示します。

1.脊髄の準備

1. アベルチン(滅菌水中で12.5 mg / mLの2,2,2-トリブロモエタノールおよび2.5%2-メチル-2-ブタノール)を使用して動物を麻酔します( 材料表を参照)。マウスのつま先と尾のつまみに対する反応がないことを確認します。
2. 冷たい1x Dulbeccoのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で心臓灌流を行い、末梢血単核球を除去します。
   1. 動物を浅いトレイに置き、横方向に切開して胸膜腔を露出させます。蠕動ポンプ( 材料表を参照)に接続された23Gの灌流針を左心室に挿入し、ポンプを作動させます。.冷たいDPBSが心臓を流れたら、右心房に小さな切開を作ります。
      注:このステップでは、細胞の生存率を高めるために、より速い灌流速度が好ましい。血液は1分以内に....

ディスカッション

純粋で生存可能な初代細胞の単離は、特定の細胞タイプの構造と機能を調べるために最も重要です。成体マウス、特に脊髄では、既存のプロトコルが成体の脊髄に合わせて調整されていないことが多いため、このタスクは重大な課題を提起します^10,17。このプロトコルは、細胞培養、フローサイトメトリー、組織学、トランスクリプトーム研究など.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma Aldrich	T48402
24 well tissue culture plate	Avantor	10861-558
2-Methyl-2-butanol, 98%	Thermo Fisher	A18304-0F
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride	Invitrogen	D1306	1:1000
45% glucose solution	Corning	25-037-CI
5 mL capped tubes	Eppendorf	30122305
Acetic acid	Sigma-Adlrich	A6283
Adult Brain Dissociation Kit	Miltenyi	103-107-677
Anti-ACSA2 Microbead Kit	Miltenyi	130-097-679
Anti-Iba1	Wako	019-1974
Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939BA
C57BL/6J wild-type (WT) mice	Jackson Laboratories
CD11b (Microglia) MicroBeads	Miltenyi	130-093-634
Celltrics 30 µm filter	Sysmex Partec	04-004-2326
Counting Chamber (Hemacytometer)	Hausser Scientific Co	3200
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma Aldrich	D4527-40KU
Distilled water	TMO	15230001
DMEM/F12	Thermo Fisher	11320074
DNase for RNA purification	Qiagen	79254
Dulbecco's phosphate-buffered saline	Thermo Fisher	14040117
Fetal bovine serum	Thermo Fisher	A5209401
GFAP antibody (mouse)	Santa Cruz	sc-33673	1:500
GFAP antibody (rabbit)	Dako	Z0334	1:500
Goat anti-mouse 594 IgG	Invitrogen	a11032	1:500
Goat anti-mouse 594 IgM	Invitrogen	a21044	1:300
Goat anti-Rabbit 488 IgG	Invitrogen	a11008	1:500
Iba1 antibody (rabbit)	Wako	019-1974	1:500
MACS Separator	Miltenyi	130-042-303
Masterflex C/L Pump System	Thermo Fisher	77122-22
MEM	Corning	15-015-CV
Methanol	Sigma-Adlrich	439193
Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000-10
MS Columns	Miltenyi	130-042-401
O4 Antibody	R&D	MAB1326
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070063
Plugged 9" glass pasteur pipette	VWR	14672-412
RNeasy Plus Micro Kit	Qiagen	74034
Royal-tek Surgical scalpel blade no. 10	Fisher scientific	22-079-683
Small Vein Infusion Set, 23 G x 19 mm	Kawasumi	D3K2-23G