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要約

このプロトコルはRNAの分析および細胞培養のようなそれに続く適用を促進する大人のマウス脊髄からの浄化されたastrocytesそしてミクログリアの隔離を概説する。これには、単離された細胞の品質と収量の両方を向上させるように設計された詳細な細胞解離方法と手順が含まれています。

要約

アストロサイトとミクログリアは、中枢神経系の発達、損傷反応、神経変性疾患において極めて重要な役割を果たしています。これらの非常に動的な細胞は、環境変化に迅速に応答し、形態、転写プロファイル、および機能の点で有意な不均一性を示します。健康と疾患におけるグリア細胞の機能に関する理解は大幅に進歩しましたが、異なる細胞集団を包括的に特徴付けるために、侮辱または損傷の文脈で実施される in vitroの細胞特異的分析の必要性が残っています。成体マウスから細胞を単離すると、病理学的条件下および特定の時点での細胞の分析が可能になるため、細胞株や新生児動物に比べていくつかの利点があります。さらに、脳病変を除いた脊髄特異的な単離に着目することで、実験的自己免疫性脳脊髄炎、脊髄損傷、筋萎縮性側索硬化症などの脊髄病態の研究が可能になります。このプロトコルは、成体マウスの脊髄からアストロサイトとミクログリアを分離するための効率的な方法を示し、機能的、分子的、またはプロテオミクス下流研究における潜在的なアプリケーションとの即時または将来の分析を促進します。

概要

アストロサイトとミクログリアは、中枢神経系(CNS)で重要な役割を果たす汎用性の高いグリア細胞であり、神経機能の調節、中枢神経系の発達への寄与、血液脳関門の維持、その他の重要なプロセスへの参加などの役割を担っています1,2,3,4.これらのグリア細胞は、ホメオスタシスの維持における役割に加えて、損傷や修復のメカニズムにおいても極めて重要な役割を果たしています。ミクログリアは、侮辱や傷害に続く貪食、炎症、および遊走能力でよく知られています5,6,7。疾患におけるアストロサイトの応答も同様に多様であり、炎症、グリア瘢痕の形成、および血液脳関門の損傷への寄与を網羅しています8,9。中枢神経系におけるミクログリアとアストロサイトの有害および修復的な役割についての理解は深まっていますが、それらの構造と機能の両方に固有の不均一性は、さまざまな状況でそれらを研究するための堅牢なツールを必要とします。

健康と疾患におけるミクログリアとアストロサイトの役割についてさらに洞察を得るには、 in vivo と in vitro での研究を組み合わせたアプローチが必要です。 in vivo 法では、中枢神経系内のグリア細胞とニューロン間の複雑なクロストークを活用し、 in vitro の方法論は、特定の刺激下での単一細胞の機能や応答を評価する際に有用であることが証明されています。それぞれの方法には独自の利点があります。 in vitro 研究は、隣接する細胞からの直接的または間接的なインプットなしに、これらの細胞タイプの特定の役割を理解するために不可欠です。さらに、不死化細胞株を用いた in vitro アッセイは、無期限に増殖する能力、費用対効果、メンテナンスの容易さなど、一定の利点をもたらします。ただし、初代細胞は細胞株と比較して、正常な生理学的応答をより厳密に模倣していることに注意することが重要です。この生理学的関連性は、機能アッセイやトランスクリプトーム解析において非常に重要です。

特に成体マウスの脊髄から初代細胞を得る際の課題の1つは、サンプルの量と生存率にあります。成人の脊髄は、脳よりも小さく、かなりの量のミエリンを含んでいるため、独特の困難があります。新生仔動物または成体マウスの脳からの純粋で生存可能なグリア細胞の分離を詳述するいくつかの公開プロトコルがありますが10,11,12,13、これらの方法論は、脊髄に特異的な疾患や損傷の研究には適していない可能性があります。このプロトコルでは、成体マウスの脊髄から純粋で生存可能なミクログリアとアストロサイトを効率的に分離するための包括的な手順を提供し、細胞培養およびトランスクリプトーム解析におけるダウンストリームアプリケーションを促進します。このプロトコルは、10週から5ヶ月の成体マウスからこれらの細胞を単離するために使用され、条件付きノックアウトマウス、薬物反応、発生研究、加齢モデルを含む研究など、さまざまな状況でその有用性を実証しています。

プロトコル

すべての動物飼育および実験手順は、ジョージワシントン大学医学部および健康科学部(米国ワシントンD.C.;IACUC#2021-004)です。この研究では、生後10週間から5ヶ月の雌雄のC57BL/6J野生型(WT)マウスを使用し、ジョージワシントン大学に収容された商業サプライヤー( 資料表を参照)から調達しました。プロトコルのワークフローの概要を 図1に示します。

1.脊髄の準備

  1. アベルチン(滅菌水中で12.5 mg / mLの2,2,2-トリブロモエタノールおよび2.5%2-メチル-2-ブタノール)を使用して動物を麻酔します( 材料表を参照)。マウスのつま先と尾のつまみに対する反応がないことを確認します。
  2. 冷たい1x Dulbeccoのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で心臓灌流を行い、末梢血単核球を除去します。
    1. 動物を浅いトレイに置き、横方向に切開して胸膜腔を露出させます。蠕動ポンプ( 材料表を参照)に接続された23Gの灌流針を左心室に挿入し、ポンプを作動させます。.冷たいDPBSが心臓を流れたら、右心房に小さな切開を作ります。
      注:このステップでは、細胞の生存率を高めるために、より速い灌流速度が好ましい。血液は1分以内に洗い流す必要があります。肝臓のクリア化は、灌流が成功したことを示します。
  3. 大きなハサミを使用して動物の首を切り落とし、脊柱14を取り除きます。Ca2+/Mg2+/0.2%グルコースを氷上のペトリ皿に入れた冷たい1x DPBSに浸し、組織をすすぎます。
  4. 今から、すべてのステップが無菌環境で行われるようにしてください。油圧押し出し14 を使用して、脊髄全体を分離します。18 G の針と 10 mL のシリンジに、Ca2+/Mg2+/0.2% グルコースを含む冷たい 1x DPBS を充填します。組織全体を沈めるのに十分な冷冷1x DPBSとCa2+/Mg2+/0.2%グルコースを含むアイスパックの上に置かれたペトリ皿に脊髄を移します。
  5. 髄膜を層流フード内の顕微鏡で慎重に除去します。脊髄を保冷剤の上の空のシャーレに移し、No.10ブレード外科用メスを使用して、脊髄全体を2〜3mmのセクションに切断します。

2. 酵素細胞解離

  1. メーカーのプロトコルに従って、市販の成人脳解離キットから酵素ミックス1と酵素ミックス2を追加します( 材料表を参照)。ディッシュ内で酵素を数回渦巻いて脊髄を均一にコーティングし、37°Cで30分間インキュベートします。5分ごとに皿を静かに渦巻きさせて、組織の凝集を防ぎ、試薬の均一な分布を促進します。
  2. ディッシュをインキュベーターから取り出し、350 μL の 0.46 mg/mL DNAse I を最小必須培地(MEM)に添加します( 材料表を参照)。静かに渦を巻いて混ぜます。
  3. 1 mLの冷DMEM/0.5%ウシ胎児血清(FBS)を加え、静かに渦巻いて混合します。ただちに内容物全体を5 mLチューブに移します。

3. 機械的細胞解離

  1. P1000ピペットを使用して、組織を3回穏やかにトリチュレーションし、そのたびに組織片が引き出され、組織がさらに解離するようにします。次に、プラグを閉めた9インチのガラス製パスツールピペットを使用して、さらに5回静かにトリチュリングし、プロセス中に気泡が発生しないようにします。
  2. 5 mLチューブを直立させ、組織を底に30秒間沈殿させます。組織が落ち着いたら、P1000ピペットを使用して上清を吸い上げ、30 μmフィルターを通して15 mLのコニカルチューブに入れます。
  3. 残りの組織と同じ 5 mL チューブに、1 mL のコールド DMEM/0.5% FBS を加えます。パスツールピペットを使用して、3回静かにトリチュレーションします。
  4. 組織を底部に30秒間沈殿させてから、上清を30 μmフィルターに通し、以前と同じ15 mLチューブに集めます。手順3.3と手順3.4をもう一度繰り返します。
  5. ろ過した細胞懸濁液を300 x g で室温(RT)で10分間遠心分離します。得られた上清を真空吸引器で慎重に除去し、廃棄する。

4.ミエリン除去

  1. Adult Brain Dissociation Kitに同梱されている破片除去溶液(DRS)を使用して、メーカーのプロトコルに従ってミエリンを除去します。破片を除去した後、5 mLのコールドDMEM/0.5% FBSを細胞ペレットに加え、チューブを3回静かに反転させます。細胞懸濁液を300 x g で室温(RT)で10分間遠心分離します。
    注:細胞を in vitro 研究に使用し、培養中に残す場合は、代わりに予熱したDMEM/0.5%FBSを使用する必要があります。
  2. 上清を廃棄し、細胞ペレットを 1 mL の DPBS/0.5% FBS(RNA 研究の場合はコールド、 in vitro アッセイの場合はウォーム)に再懸濁します。細胞をカウントし、トリパンブルーを使用して生存率を評価します。
    注:複数の動物由来の細胞懸濁液を組み合わせて、細胞濃度を高めることができます。
  3. DPBS/0.5% FBSを添加して、総容量5 mLまで細胞を洗浄します。懸濁液を室温で300 x g で10分間遠心分離し、ピペットを使用して上清を廃棄します。

5. ミクログリアとアストロサイトの単離

  1. メーカーのプロトコルに従って、抗CD11bまたは抗ACSA-2マイクロビーズで細胞を標識します( 材料表を参照)。
  2. メーカーの指示に従って、MSカラムを使用してポジティブ選択でセルをソートします( 材料表を参照)。選別後、選別した細胞を300× g で10分間遠心分離し、上清を捨てます。

6. in vitro アッセイ用細胞のプレーティング

注:細胞を播種せず、すぐに RNA 分析に使用する場合は、ステップ 8 に進みます。

  1. 細胞を1 mLのウォームDMEM/0.5%FBSに再懸濁します。細胞を数え、血球計算盤を使用してその生存率を評価します( 材料表を参照)。
  2. 細胞濃度を50μLあたり75,000細胞に調整します。 50 μLの細胞懸濁液を、24ウェルプレート内の各ポリ-L-リジンでコーティングされたカバーガラス11 に加えます。
  3. 37°Cで2時間インキュベートし、細胞がカバーガラスに付着するようにします。
  4. 450 μLの温かいDMEM/5% FBS/ペニシリン-ストレプトマイシン(ペン連鎖球菌、 材料表を参照)を各ウェルに慎重に添加します。
  5. 3日後、培地の半分を250 μLの温かいDMEM/5% FBS/Pen-Strepと交換します。メンテナンスのために、培地を4〜5日ごとに500μLの温かいDMEM/5%FBS/Pen-Strepと完全に交換してください。

7. 免疫組織化学

注:免疫組織化学分析は、培地を少なくとも1回交換した場合、少なくとも3日後に行うのが最善です。これにより、破片が除去され、細胞がカバーガラスに完全に付着します。

  1. 培地を除去し、細胞を抗マウスモノクローナル抗体 O4(1:100)( 材料表参照)で、温DMEM/5% FBS/10%正常ヤギ血清(NGS)中で室温(RT)または37°Cで15分間標識します。
    注:セルにO4のラベルが付かない場合は、この手順をスキップして手順7.3に進みます。
  2. カバーガラスを温かいDMEM/5% FBSに3回浸して、やさしくすすぎます。ヤギ抗マウス594 IgM(1:300)( 材料表参照)を温かいDMEM/5% FBS/10% NGSに添加し、室温で暗所で15分間インキュベートします。温かいDMEM/5% FBSで3回静かにすすいでください。
  3. セルを冷たい5%酢酸/メタノールで4°Cで15分間固定します。 1x PBSで3回洗浄し、適切な抗体で標識します:抗ウサギGFAP(1:500)、抗マウスGFAP(1:500)、または抗ウサギIba1(1:500)を1% Triton-X100/10% NGSに1x DPBSで含みます( 材料表を参照)。室温で1時間インキュベートします。
    注意: カバーガラスがすでにO4で染色されている場合は、暗所に保管してください。
  4. PBSで3回やさしくすすいでください。適切な二次抗体で標識します:抗マウス594 IgG(1:500)、抗ウサギ488 IgG(1:500)( 材料表を参照)。暗闇のRTで30分間インキュベートします。
  5. PBSで3回やさしくすすいでください。室温でDAPI(1:1000)で1分間対比染色し、PBSで3回すすぎ、封入剤を添加し( 材料表を参照)、カバーガラスをスライドに取り付けます。

8. RNA抽出

注:理想的には、分析に十分な RNA を抽出するために、少なくとも 100,000 個の細胞が必要です。必要に応じて、2〜3個の脊髄の細胞を組み合わせることができます。

  1. メーカーのプロトコルに従って、市販のRNA単離キットを使用してRNAを抽出します( 材料表を参照)。キットに付属のRW1洗浄バッファーを使用した各洗浄ステップで、細胞を洗浄バッファーにさらに2分間放置します。
  2. メーカーの指示に従って、DNase Iを使用して残っているゲノムDNAを除去します( 材料表を参照)。DNaseと室温で15分間インキュベートした後、RW1バッファーで洗浄します。
  3. RNAの収量を増やすには、溶出前にサンプルをRNAseフリー水で室温で10分間インキュベートします。バイオアナライザー15 ( 材料表を参照)を使用してRNAの完全性と量を評価します。

結果

このプロトコルで概説されている方法は、成体マウス脊髄から純粋で生存可能なミクログリアおよびアストロサイトの単離を可能にし、 in vitro の機能的または組織学的アッセイやRNA分析など、さまざまなダウンストリームアプリケーションを促進します。

in vitro試験の単離が成功すると、数日間にわたって細胞が連続的に増殖します。成体細胞は、新生児?...

ディスカッション

純粋で生存可能な初代細胞の単離は、特定の細胞タイプの構造と機能を調べるために最も重要です。成体マウス、特に脊髄では、既存のプロトコルが成体の脊髄に合わせて調整されていないことが多いため、このタスクは重大な課題を提起します10,17。このプロトコルは、細胞培養、フローサイトメトリー、組織学、トランスクリプトーム研究など...

開示事項

何一つ

謝辞

ジョージ・ワシントン大学ゲノミクス・コアの Castle Raley 氏には RNA 解析を、Q2 Lab Solutions には RNA シーケンシング解析をお願いいたします。この研究は、National Institute of Neurological Disorders and Stroke [grant number F31NS117085] と Vivian Gill Research Endowment to Dr. Robert H. Miller の支援を受けた。 図 1 は BioRender.com で作成されました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
2,2,2-TribromoethanolSigma AldrichT48402
24 well tissue culture plateAvantor10861-558
2-Methyl-2-butanol, 98%Thermo FisherA18304-0F
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, DihydrochlorideInvitrogenD13061:1000
45% glucose solutionCorning25-037-CI
5 mL capped tubesEppendorf30122305
Acetic acidSigma-AdlrichA6283
Adult Brain Dissociation KitMiltenyi103-107-677
Anti-ACSA2 Microbead KitMiltenyi130-097-679
Anti-Iba1Wako019-1974
BioanalyzerAgilent TechnologiesG2939BA
C57BL/6J wild-type (WT) mice Jackson Laboratories
CD11b (Microglia) MicroBeadsMiltenyi130-093-634
Celltrics 30 µm filterSysmex Partec04-004-2326
Counting Chamber (Hemacytometer)Hausser Scientific Co3200
Deoxyribonuclease I from bovine pancreasSigma AldrichD4527-40KU
Distilled waterTMO15230001
DMEM/F12Thermo Fisher11320074
DNase for RNA purificationQiagen79254
Dulbecco's phosphate-buffered salineThermo Fisher14040117
Fetal bovine serumThermo FisherA5209401
GFAP antibody (mouse)Santa Cruzsc-336731:500
GFAP antibody (rabbit)DakoZ03341:500
Goat anti-mouse 594 IgGInvitrogena110321:500
Goat anti-mouse 594 IgMInvitrogena210441:300
Goat anti-Rabbit 488 IgGInvitrogena110081:500
Iba1 antibody (rabbit)Wako019-19741:500
MACS SeparatorMiltenyi130-042-303
Masterflex C/L Pump SystemThermo Fisher77122-22
MEMCorning15-015-CV
MethanolSigma-Adlrich439193
Mounting MediumVector LaboratoriesH-1000-10
MS ColumnsMiltenyi130-042-401
O4 AntibodyR&DMAB1326
Penicillin-StreptomycinGibco15070063
Plugged 9" glass pasteur pipetteVWR14672-412
RNeasy Plus Micro KitQiagen74034
Royal-tek Surgical scalpel blade no. 10Fisher scientific22-079-683
Small Vein Infusion Set, 23 G x 19 mmKawasumiD3K2-23G

参考文献

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  18. Neuschulz, A., et al. A single-cell RNA labeling strategy for measuring stress response upon tissue dissociation. Mol Syst Biol. 19, 11147 (2023).
  19. CB, S., et al. One brain-all cells: a comprehensive protocol to isolate all principal cns-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 1-25 (2021).

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