Isolamento di astrociti puri e microglia dal midollo spinale di topo adulto per saggi in vitro e studi trascrittomici

Riepilogo

Questo protocollo delinea l'isolamento di astrociti e microglia purificati dal midollo spinale del topo adulto, facilitando le successive applicazioni come l'analisi dell'RNA e la coltura cellulare. Include metodi e procedure dettagliati di dissociazione cellulare progettati per migliorare sia la qualità che la resa delle cellule isolate.

Abstract

Gli astrociti e le microglia svolgono un ruolo fondamentale nello sviluppo del sistema nervoso centrale, nelle risposte alle lesioni e nelle malattie neurodegenerative. Queste cellule altamente dinamiche mostrano risposte rapide ai cambiamenti ambientali e mostrano una significativa eterogeneità in termini di morfologia, profili trascrizionali e funzioni. Mentre la nostra comprensione delle funzioni delle cellule gliali nella salute e nella malattia è progredita notevolmente, rimane la necessità di analisi in vitro, specifiche per cellule, condotte nel contesto di insulti o lesioni per caratterizzare in modo completo popolazioni cellulari distinte. L'isolamento delle cellule dal topo adulto offre diversi vantaggi rispetto alle linee cellulari o agli animali neonatali, in quanto consente l'analisi delle cellule in condizioni patologiche e in punti temporali specifici. Inoltre, concentrandosi sull'isolamento specifico del midollo spinale, escludendo il coinvolgimento cerebrale, consente la ricerca sulle patologie del midollo spinale, tra cui l'encefalomielite autoimmune sperimentale, la lesione del midollo spinale e la sclerosi laterale amiotrofica. Questo protocollo presenta un metodo efficiente per isolare astrociti e microglia dal midollo spinale del topo adulto, facilitando l'analisi immediata o futura con potenziali applicazioni in studi funzionali, molecolari o proteomici a valle.

Introduzione

Gli astrociti e le microglia sono cellule gliali versatili che svolgono ruoli vitali nel sistema nervoso centrale (SNC), comprendendo responsabilità come la regolazione della funzione neuronale, contribuendo allo sviluppo del SNC, mantenendo la barriera emato-encefalica e partecipando ad altri processi critici 1,2,3,4 . Oltre al loro ruolo nel mantenimento dell'omeostasi, queste cellule gliali svolgono anche un ruolo fondamentale nei meccanismi di lesione e riparazione. Le microglia sono ben note per le loro capacità fagocitarie, infiammator....

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali e di cura degli animali sono state condotte a seguito dell'approvazione del Comitato per la cura e l'uso degli animali presso la George Washington University School of Medicine and Health Sciences (Washington, D.C., USA; IACUC#2021-004). Lo studio ha utilizzato topi maschi e femmine C57BL/6J wild-type (WT) di età compresa tra 10 settimane e 5 mesi, provenienti da un fornitore commerciale (vedi Tabella dei materiali) e ospitati presso la George Washington University. Nella Figura 1 viene presentata una panoramica del flusso di lavoro del protocollo.

1. Prepa....

Discussione

L'isolamento di cellule primarie pure e vitali è fondamentale per studiare la struttura e la funzione di specifici tipi di cellule. Nel topo adulto, in particolare nel midollo spinale, questo compito pone sfide significative, poiché i protocolli esistenti spesso non sono adattati al midollo spinale adulto^10,17. Questo protocollo presenta un metodo efficiente ed economico applicabile a varie applicazioni a valle, tra cui colture cellulari, citometria a flusso, i.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma Aldrich	T48402
24 well tissue culture plate	Avantor	10861-558
2-Methyl-2-butanol, 98%	Thermo Fisher	A18304-0F
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride	Invitrogen	D1306	1:1000
45% glucose solution	Corning	25-037-CI
5 mL capped tubes	Eppendorf	30122305
Acetic acid	Sigma-Adlrich	A6283
Adult Brain Dissociation Kit	Miltenyi	103-107-677
Anti-ACSA2 Microbead Kit	Miltenyi	130-097-679
Anti-Iba1	Wako	019-1974
Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939BA
C57BL/6J wild-type (WT) mice	Jackson Laboratories
CD11b (Microglia) MicroBeads	Miltenyi	130-093-634
Celltrics 30 µm filter	Sysmex Partec	04-004-2326
Counting Chamber (Hemacytometer)	Hausser Scientific Co	3200
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma Aldrich	D4527-40KU
Distilled water	TMO	15230001
DMEM/F12	Thermo Fisher	11320074
DNase for RNA purification	Qiagen	79254
Dulbecco's phosphate-buffered saline	Thermo Fisher	14040117
Fetal bovine serum	Thermo Fisher	A5209401
GFAP antibody (mouse)	Santa Cruz	sc-33673	1:500
GFAP antibody (rabbit)	Dako	Z0334	1:500
Goat anti-mouse 594 IgG	Invitrogen	a11032	1:500
Goat anti-mouse 594 IgM	Invitrogen	a21044	1:300
Goat anti-Rabbit 488 IgG	Invitrogen	a11008	1:500
Iba1 antibody (rabbit)	Wako	019-1974	1:500
MACS Separator	Miltenyi	130-042-303
Masterflex C/L Pump System	Thermo Fisher	77122-22
MEM	Corning	15-015-CV
Methanol	Sigma-Adlrich	439193
Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000-10
MS Columns	Miltenyi	130-042-401
O4 Antibody	R&D	MAB1326
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070063
Plugged 9" glass pasteur pipette	VWR	14672-412
RNeasy Plus Micro Kit	Qiagen	74034
Royal-tek Surgical scalpel blade no. 10	Fisher scientific	22-079-683
Small Vein Infusion Set, 23 G x 19 mm	Kawasumi	D3K2-23G