Isolation of Pure Astrocytes and Microglia from the Adult Mouse Spinal Cord For In Vitro Assays and Transcriptomic Studies( 체외 분석 및 전사체 연구를 위한 성인 마우스 척수에서 순수 성상교세포 및 미세아교세포의 분리)

요약

이 프로토콜은 성체 마우스 척수에서 정제된 성상교세포와 미세아교세포를 분리하여 RNA 분석 및 세포 배양과 같은 후속 응용 분야를 용이하게 합니다. 여기에는 분리된 세포의 품질과 수율을 모두 향상시키기 위해 고안된 상세한 세포 해리 방법 및 절차가 포함됩니다.

초록

성상교세포와 미세아교세포는 중추신경계 발달, 부상 반응 및 신경퇴행성 질환에 중추적인 역할을 합니다. 이러한 매우 역동적인 세포는 환경 변화에 빠르게 반응하며 형태학, 전사 프로파일 및 기능 측면에서 상당한 이질성을 나타냅니다. 건강과 질병에서 신경교세포의 기능에 대한 우리의 이해가 크게 발전했지만, 뚜렷한 세포 집단을 포괄적으로 특성화하기 위해 모욕 또는 부상의 맥락에서 수행된 체외 세포 특이적 분석의 필요성은 여전히 남아 있습니다. 성체 마우스에서 세포를 분리하면 병리학적 조건 및 특정 시점에서의 세포 분석이 가능하기 때문에 세포주 또는 신생아 동물에 비해 여러 가지 이점이 있습니다. 또한 뇌 침범을 제외한 척수 특이적 분리에 초점을 맞추면 실험적 자가면역 뇌척수염, 척수 손상 및 근위축성 측삭 경화증을 포함한 척수 병리학에 대한 연구가 가능합니다. 이 프로토콜은 성체 마우스 척수에서 성상교세포와 미세아교세포를 분리하기 위한 효율적인 방법을 제시하여 기능적, 분자적 또는 단백질체 다운스트림 연구에서 잠재적인 응용 분야를 통해 즉각적인 또는 향후 분석을 용이하게 합니다.

서문

성상교세포(astrocyte)와 미세아교세포(microglia)는 중추신경계(CNS)에서 중요한 역할을 하는 다재다능한 신경교세포로, 신경 기능 조절, 중추신경계 발달에 기여, 혈액뇌장벽 유지, 기타 중요한 과정 참여 등의 역할을 포함합니다 1,2,3,4 . 항상성을 유지하는 역할 외에도 이 신경교세포는 부상 및 복구 메커니즘에서 중추적인 역할을 합니다. 미세아교세포(Microglia)는 모욕이나 부상 후 식세포, 염증 및 이동 능력으로 잘 알려져 있다 ^5,6,7. 질병에서 성상교세포의 반응은 염증, 신경교세포의 형성, 혈액뇌장벽의 손상에 대한 기여를 포함하여 똑같이 다양합니다 ^8,9. 중추신경계에서 미세아교세포와 성상교세포의 해로운 역할과 회복 역할에 대한 이해가 높아졌지만, 구조와 기능 모두에....

프로토콜

모든 동물 관리 및 실험 절차는 조지 워싱턴 대학교 의과 대학 및 보건 과학 대학 (워싱턴 DC, 미국; IACUC#2021-004)를 참조하십시오. 이 연구는 생후 10주에서 5개월 사이의 수컷과 암컷 C57BL/6J 야생형(WT) 마우스를 사용했으며, 이 마우스는 상업 공급업체( 재료 표 참조)에서 공급받아 조지 워싱턴 대학교에 보관되었습니다. 프로토콜 워크플로의 개요는 그림 1에 나와 있습니다.

1. 척수의 준비

1. 아베르틴(멸균수에 2,2,2-트리브로모에탄올 12.5mg/mL 및 2-메틸-2-부탄올 12.5mg/mL)을 사용하여 동물을 마취시킵니다( 재료 표 참조). 마우스에서 발가락과 꼬리 꼬집음에 대한 반응이 없는지 확인합니다.
2. 말초 혈액 단핵 세포를 제거하기 위해 차가운 1x Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)로 심장 관류를 수행합니다.
   1. 동물을 얕은 쟁반에 놓고 흉막을 노출시키기 위해 측면을 절개합니다. 연동 펌프에 연결된 23G 관류 바늘( 재료 표 참조)을 좌심실에 삽입하고 펌프를 활성화합니다. 차....

토론

순수하고 생존 가능한 일차 세포의 분리는 특정 세포 유형의 구조와 기능을 조사하는 데 가장 중요합니다. 성체 마우스에서, 특히 척수에서, 이 작업은 현존하는 프로토콜이 종종 성체 척수에 맞추어지지 않기 때문에 상당한 도전을 제기한다^(10,17). 이 프로토콜은 세포 배양, 유세포 분석, 조직학 및 전사체 연구를 포함한 다양한 다운스트림 응용 분야에.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma Aldrich	T48402
24 well tissue culture plate	Avantor	10861-558
2-Methyl-2-butanol, 98%	Thermo Fisher	A18304-0F
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride	Invitrogen	D1306	1:1000
45% glucose solution	Corning	25-037-CI
5 mL capped tubes	Eppendorf	30122305
Acetic acid	Sigma-Adlrich	A6283
Adult Brain Dissociation Kit	Miltenyi	103-107-677
Anti-ACSA2 Microbead Kit	Miltenyi	130-097-679
Anti-Iba1	Wako	019-1974
Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939BA
C57BL/6J wild-type (WT) mice	Jackson Laboratories
CD11b (Microglia) MicroBeads	Miltenyi	130-093-634
Celltrics 30 µm filter	Sysmex Partec	04-004-2326
Counting Chamber (Hemacytometer)	Hausser Scientific Co	3200
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma Aldrich	D4527-40KU
Distilled water	TMO	15230001
DMEM/F12	Thermo Fisher	11320074
DNase for RNA purification	Qiagen	79254
Dulbecco's phosphate-buffered saline	Thermo Fisher	14040117
Fetal bovine serum	Thermo Fisher	A5209401
GFAP antibody (mouse)	Santa Cruz	sc-33673	1:500
GFAP antibody (rabbit)	Dako	Z0334	1:500
Goat anti-mouse 594 IgG	Invitrogen	a11032	1:500
Goat anti-mouse 594 IgM	Invitrogen	a21044	1:300
Goat anti-Rabbit 488 IgG	Invitrogen	a11008	1:500
Iba1 antibody (rabbit)	Wako	019-1974	1:500
MACS Separator	Miltenyi	130-042-303
Masterflex C/L Pump System	Thermo Fisher	77122-22
MEM	Corning	15-015-CV
Methanol	Sigma-Adlrich	439193
Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000-10
MS Columns	Miltenyi	130-042-401
O4 Antibody	R&D	MAB1326
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070063
Plugged 9" glass pasteur pipette	VWR	14672-412
RNeasy Plus Micro Kit	Qiagen	74034
Royal-tek Surgical scalpel blade no. 10	Fisher scientific	22-079-683
Small Vein Infusion Set, 23 G x 19 mm	Kawasumi	D3K2-23G