Isolement d’astrocytes purs et de microglies de la moelle épinière de souris adulte pour des essais in vitro et des études transcriptomiques

Résumé

Ce protocole décrit l’isolement des astrocytes purifiés et de la microglie de la moelle épinière de souris adulte, facilitant ainsi les applications ultérieures telles que l’analyse de l’ARN et la culture cellulaire. Il comprend des méthodes et des procédures détaillées de dissociation cellulaire conçues pour améliorer à la fois la qualité et le rendement des cellules isolées.

Résumé

Les astrocytes et les microglies jouent un rôle central dans le développement du système nerveux central, les réponses aux blessures et les maladies neurodégénératives. Ces cellules très dynamiques présentent des réponses rapides aux changements environnementaux et présentent une hétérogénéité significative en termes de morphologie, de profils transcriptionnels et de fonctions. Bien que notre compréhension des fonctions des cellules gliales dans la santé et la maladie ait considérablement progressé, il reste nécessaire de procéder à des analyses in vitro spécifiques aux cellules dans le contexte d’agressions ou de blessures afin de caractériser de manière exhaustive des populations cellulaires distinctes. L’isolement des cellules de la souris adulte offre plusieurs avantages par rapport aux lignées cellulaires ou aux animaux nouveau-nés, car il permet d’analyser les cellules dans des conditions pathologiques et à des moments précis. De plus, l’accent mis sur l’isolement spécifique de la moelle épinière, à l’exclusion de l’atteinte cérébrale, permet la recherche sur les pathologies de la moelle épinière, y compris l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale, les lésions de la moelle épinière et la sclérose latérale amyotrophique. Ce protocole présente une méthode efficace pour isoler les astrocytes et la microglie de la moelle épinière de souris adulte, facilitant l’analyse immédiate ou future avec des applications potentielles dans des études fonctionnelles, moléculaires ou protéomiques en aval.

Introduction

Les astrocytes et les microglies sont des cellules gliales polyvalentes qui jouent un rôle vital dans le système nerveux central (SNC), englobant des responsabilités telles que la régulation de la fonction neuronale, la contribution au développement du SNC, le maintien de la barrière hémato-encéphalique et la participation à d’autres processus critiques 1,2,3,4 . Outre leur rôle dans le maintien de l’homéostasie, ces cellules gliales jouent également un rôle central dans les mécanismes de blessure et de réparation. Les microglies sont bien c....

Protocole

Toutes les procédures expérimentales et de soins aux animaux ont été menées à la suite de l’approbation du Comité de protection et d’utilisation des animaux de l’École de médecine et des sciences de la santé de l’Université George Washington (Washington, D.C., États-Unis ; IACUC#2021-004). L’étude a utilisé des souris mâles et femelles de type sauvage (WT) C57BL/6J âgées de 10 semaines à 5 mois, provenant d’un fournisseur commercial (voir le tableau des matériaux) et hébergées à l’Université George Washington. Une vue d’ensemble du flux de travail du protocole est présentée à la figure 1.

Discussion

L’isolement de cellules primaires pures et viables est primordial pour étudier la structure et la fonction de types cellulaires spécifiques. Chez la souris adulte, en particulier dans la moelle épinière, cette tâche pose des défis importants, car les protocoles existants ne sont souvent pas adaptés à la moelle épinière adulte^10,17. Ce protocole présente une méthode efficace et rentable applicable à diverses applications en aval, notamment la cultur.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma Aldrich	T48402
24 well tissue culture plate	Avantor	10861-558
2-Methyl-2-butanol, 98%	Thermo Fisher	A18304-0F
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride	Invitrogen	D1306	1:1000
45% glucose solution	Corning	25-037-CI
5 mL capped tubes	Eppendorf	30122305
Acetic acid	Sigma-Adlrich	A6283
Adult Brain Dissociation Kit	Miltenyi	103-107-677
Anti-ACSA2 Microbead Kit	Miltenyi	130-097-679
Anti-Iba1	Wako	019-1974
Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939BA
C57BL/6J wild-type (WT) mice	Jackson Laboratories
CD11b (Microglia) MicroBeads	Miltenyi	130-093-634
Celltrics 30 µm filter	Sysmex Partec	04-004-2326
Counting Chamber (Hemacytometer)	Hausser Scientific Co	3200
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma Aldrich	D4527-40KU
Distilled water	TMO	15230001
DMEM/F12	Thermo Fisher	11320074
DNase for RNA purification	Qiagen	79254
Dulbecco's phosphate-buffered saline	Thermo Fisher	14040117
Fetal bovine serum	Thermo Fisher	A5209401
GFAP antibody (mouse)	Santa Cruz	sc-33673	1:500
GFAP antibody (rabbit)	Dako	Z0334	1:500
Goat anti-mouse 594 IgG	Invitrogen	a11032	1:500
Goat anti-mouse 594 IgM	Invitrogen	a21044	1:300
Goat anti-Rabbit 488 IgG	Invitrogen	a11008	1:500
Iba1 antibody (rabbit)	Wako	019-1974	1:500
MACS Separator	Miltenyi	130-042-303
Masterflex C/L Pump System	Thermo Fisher	77122-22
MEM	Corning	15-015-CV
Methanol	Sigma-Adlrich	439193
Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000-10
MS Columns	Miltenyi	130-042-401
O4 Antibody	R&D	MAB1326
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070063
Plugged 9" glass pasteur pipette	VWR	14672-412
RNeasy Plus Micro Kit	Qiagen	74034
Royal-tek Surgical scalpel blade no. 10	Fisher scientific	22-079-683
Small Vein Infusion Set, 23 G x 19 mm	Kawasumi	D3K2-23G