Выделение чистых астроцитов и микроглии из спинного мозга взрослой мыши для анализов in vitro и транскриптомных исследований

Резюме

В этом протоколе описывается выделение очищенных астроцитов и микроглии из спинного мозга взрослой мыши, что облегчает последующие применения, такие как анализ РНК и культивирование клеток. Он включает в себя подробные методы и процедуры клеточной диссоциации, предназначенные для повышения качества и выхода изолированных клеток.

Аннотация

Астроциты и микроглия играют ключевую роль в развитии центральной нервной системы, реакциях на травмы и нейродегенеративных заболеваниях. Эти высокодинамичные клетки демонстрируют быструю реакцию на изменения окружающей среды и демонстрируют значительную гетерогенность с точки зрения морфологии, транскрипционных профилей и функций. Несмотря на то, что наше понимание функций глиальных клеток в норме и при болезнях значительно продвинулось, по-прежнему существует потребность в клеточно-специфическом анализе in vitro, проводимом в контексте повреждений или травм, чтобы всесторонне охарактеризовать отдельные клеточные популяции. Изоляция клеток взрослой мыши имеет ряд преимуществ по сравнению с клеточными линиями или новорожденными животными, поскольку позволяет проводить анализ клеток в патологических условиях и в определенные моменты времени. Кроме того, сосредоточение внимания на специфической изоляции спинного мозга, исключая поражение головного мозга, позволяет исследовать патологии спинного мозга, включая экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит, травму спинного мозга и боковой амиотрофический склероз. Этот протокол представляет собой эффективный метод выделения астроцитов и микроглии из спинного мозга взрослой мыши, облегчающий немедленный или будущий анализ с потенциальными приложениями в функциональных, молекулярных или протеомных исследованиях.

Введение

Астроциты и микроглия являются универсальными глиальными клетками, которые играют жизненно важную роль в центральной нервной системе (ЦНС), выполняя такие обязанности, как регуляция функции нейронов, содействие развитию ЦНС, поддержание гематоэнцефалического барьера и участие в других критических процессах 1,2,3,4 . Помимо своей роли в поддержании гомеостаза, эти глиальные клетки также играют ключевую роль в механизмах повреждения и восстановления. Микроглия хорошо известна своими фагоцитарными, воспалительными и миграционными способностями после инсультов или травм ^5,6,7. Реакция астроцитов при заболевании столь же разнообразна, включая вклад в воспаление, образование глиальных рубцов и нарушение гематоэнцефалического барьера ^8,9. Несмотря на то, что наше понимание пагубной и репаративной роли микроглии и астроцитов в ЦНС выросло, присущая им гетерогенность как в структуре, так и в функциях требует надежных инструментов для их изучения в различных контекстах.

Для получения более глубокого понимания роли микроглии и астроцитов в здоровье и заболевании требуется комбинированный подход исследований in vivo и in vitro . Методы in vivo используют сложные перекрестные помехи между глиальными клетками и нейронами в ЦНС, в то время как методологии in vitro оказываются полезными при оценке функций или ответов отдельных клеток под конкретными стимулами. Каждый метод обладает уникальными преимуществами; Исследования in vitro необходимы для понимания специфической роли этих типов клеток без прямого или косвенного влияния соседних клеток. Кроме того, анализы in vitro с использованием бессмертных клеточных линий имеют определенные преимущества, включая способность к бесконечному размножению, экономическую эффективность и простоту обслуживания. Тем не менее, важно отметить, что первичные клетки более точно имитируют нормальные физиологические реакции по сравнению с клеточными линиями. Эта физиологическая значимость имеет решающее значение в функциональных анализах и транскриптомных анализах.

Одна из проблем при получении первичных клеток, особенно из спинного мозга взрослой мыши, заключается в количестве и жизнеспособности образцов. Спинной мозг взрослого человека, будучи меньше головного мозга и содержащий значительное количество миелина, представляет собой уникальные трудности. Несмотря на то, что существует несколько опубликованных протоколов с подробным описанием выделения чистых, жизнеспособных глиальных клеток из неонатальных животных или головного мозга взрослой мыши 10,11,12,13, эти методики могут не подходить для изучения заболеваний и травм, специфичных для спинного мозга. В этом протоколе мы предлагаем комплексную процедуру эффективного выделения чистой, жизнеспособной микроглии и астроцитов из спинного мозга взрослой мыши, облегчая последующее применение в клеточных культурах и транскриптомных анализах. Этот протокол был успешно использован для изоляции этих клеток от взрослых мышей в возрасте от 10 недель до 5 месяцев, демонстрируя его полезность в различных контекстах, включая исследования с участием мышей с условным нокаутом, реакцию на лекарственные препараты, исследования развития и возрастные модели.

протокол

Все процедуры по уходу за животными и экспериментальные процедуры были проведены после одобрения Комитета по уходу за животными и их использованию в Школе медицины и медицинских наук Университета Джорджа Вашингтона (Вашингтон, округ Колумбия, США; IACUC#2021-004). В исследовании использовались самцы и самки мышей дикого типа C57BL/6J (WT) в возрасте от 10 недель до 5 месяцев, которые были получены от коммерческого поставщика (см. таблицу материалов) и размещены в Университете Джорджа Вашингтона. Обзор рабочего процесса протокола представлен на рисунке 1.

1. Подготовка спинного мозга

1. Обезболивайте животных препаратом Авертин (12,5 мг/мл 2,2,2-трибромэтанола и 2,5% 2-метил-2-бутанола в стерильной воде) (см. таблицу материалов). Подтвердите отсутствие реакции на пощипывание пальцев ног и хвостов у мышей.
2. Выполняйте сердечную перфузию с помощью холодного 1x фосфатно-солевого буфера Dulbecco (DPBS) для удаления мононуклеарных клеток периферической крови.
   1. Поместите животное на неглубокий лоток и сделайте боковой разрез, чтобы обнажить плевральную полость. Введите перфузионную иглу 23 G, подключенную к перистальтическому насосу (см. таблицу материалов), в левый желудочек и активируйте помпу. После того, как холодный ДПБС пройдет через сердце, сделайте небольшой разрез в правом предсердии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе предпочтительна более высокая скорость перфузии для повышения жизнеспособности клеток. Кровь должна быть смыта менее чем за 1 минуту. Очищение печени свидетельствует об успешной перфузии.
3. Обезглавьте животное большими ножницами и удалите позвоночный столб¹⁴. Погрузите его в холодный 1x DPBS с Ca²⁺/Mg²⁺/0,2% глюкозы в чашке Петри на льду для полоскания тканей.
4. Начиная с этого момента, убедитесь, что все этапы выполняются в стерильной среде. Используйте гидравлическую экструзию¹⁴ для изоляции всего спинного мозга. Используйте иглу 18 G и шприц объемом 10 мл, наполненный холодным 1x DPBS с Ca²⁺/Mg²⁺/0,2% глюкозы. Перенесите спинной мозг в чашку Петри, помещенную на пакеты со льдом, содержащие достаточное количество холодного 1x DPBS с Ca²⁺/Mg²⁺/0,2% глюкозы, чтобы погрузить всю ткань.
5. Осторожно удалите мозговые оболочки под микроскопом в ламинарном колпаке. Перенесите спинной мозг в пустую чашку Петри на пакетах со льдом и с помощью хирургического скальпеля с лезвием No 10 разрежьте весь спинной мозг на отрезки по 2-3 мм.

2. Ферментативная диссоциация клеток

1. Добавьте смесь ферментов 1 и смесь ферментов 2 из коммерчески доступного набора для диссоциации мозга у взрослых в соответствии с протоколом производителя (см. таблицу материалов). Перемешайте ферменты в чашке несколько раз, чтобы обеспечить равномерное покрытие спинного мозга, затем инкубируйте при 37 °C в течение 30 минут. Каждые 5 минут аккуратно встряхивайте чашку, чтобы предотвратить слипание тканей и способствовать равномерному распределению реагентов.
2. Извлеките чашку из инкубатора и добавьте 350 мкл 0,46 мг/мл ДНКазы I в минимальную эссенциальную среду (МЭМ) (см. таблицу материалов). Перемешайте, аккуратно взбивая.
3. Добавьте 1 мл холодной сыворотки DMEM/0,5% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и перемешайте, слегка взбалтывая. Сразу же перелейте все содержимое в пробирку объемом 5 мл.

3. Механическая диссоциация клеток

1. С помощью пипетки P1000 аккуратно растирайте ткань три раза, каждый раз следя за тем, чтобы кусочки ткани вытягивались для дальнейшего диссоциирования ткани. Затем, используя заткнутую стеклянную пипетку Пастера диаметром 9 дюймов, осторожно разотрите еще пять раз, следя за тем, чтобы во время процесса не образовывались пузырьки.
2. Поместите пробирку объемом 5 мл вертикально и дайте ткани осесть на дне в течение 30 с. После того, как ткань осядет, наберите надосадочную жидкость с помощью пипетки P1000 и пропустите ее через фильтр 30 мкм в коническую пробирку объемом 15 мл.
3. В ту же пробирку объемом 5 мл с оставшейся тканью добавляют 1 мл холодного ДМЕМ/0,5% FBS. С помощью пипетки Пастера аккуратно разотрите три раза.
4. Дайте ткани осесть на дне в течение 30 с, затем пропустите надосадочную жидкость через фильтр 30 мкм и соберите ее в ту же пробирку объемом 15 мл, что и раньше. Повторите шаги 3.3 и 3.4 еще раз.
5. Центрифугируют отфильтрованную клеточную суспензию при 300 x g в течение 10 мин при комнатной температуре (RT). Аккуратно извлеките и выбросьте образовавшуюся надосадочную жидкость с помощью вакуумного аспиратора.

4. Удаление миелина

1. Удалите миелин с помощью раствора для удаления мусора (DRS), входящего в комплект для диссоциации мозга взрослого человека, в соответствии с протоколом производителя. После удаления мусора добавьте 5 мл холодного DMEM/0,5% FBS к грануле ячейки и осторожно переверните пробирку три раза. Центрифугируйте клеточную суспензию при 300 x g в течение 10 мин при комнатной температуре (RT).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если клетки будут использоваться для исследований in vitro и останутся в культуре, вместо них следует использовать предварительно подогретый DMEM/0,5% FBS.
2. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 1 мл DPBS/0,5% FBS (холодный для исследований РНК и теплый для анализов in vitro ). Подсчитайте клетки и оцените жизнеспособность с помощью Trypan Blue.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточные суспензии нескольких животных могут быть объединены для увеличения концентрации клеток.
3. Промойте клетки, добавив DPBS/0,5% FBS до общего объема 5 мл. Центрифугу суспензии при 300 х г в течение 10 мин при комнатной температуре и выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки.

5. Выделение микроглии и астроцитов

1. Пометьте клетки микрогранулами анти-CD11b или анти-ACSA-2 в соответствии с протоколом производителя (см. таблицу материалов).
2. Отсортируйте ячейки методом положительного отбора с помощью столбцов MS в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов). После сортировки центрифугируют отсортированные клетки при 300 x g в течение 10 мин и выбрасывают надосадочную жидкость.

6. Гальванические ячейки для анализов in vitro

ПРИМЕЧАНИЕ: Если клетки не будут покрыты плакировкой и будут использоваться сразу для анализа РНК, перейдите к шагу 8.

1. Ресуспендант клеток в 1 мл теплого ДМЭМ/0,5% FBS. Подсчитайте количество клеток и оцените их жизнеспособность с помощью гемацитометра (см. таблицу материалов).
2. Отрегулируйте концентрацию клеток до 75 000 клеток на 50 мкл. Добавьте 50 мкл клеточной суспензии к каждому покрытию 11 с поли-L-лизиновым покрытием¹¹ в 24-луночном планшете.
3. Инкубируют при 37 °C в течение 2 ч, чтобы клетки прилипли к покровному стеклу.
4. Осторожно добавьте в каждую лунку 450 мкл теплого DMEM/5% FBS/пенициллина-стрептомицина (Pen-Streptoctin, см. таблицу материалов).
5. Через 3 дня замените половину носителя 250 мкл теплого DMEM/5% FBS/Pen-Strep. Для обслуживания полностью заменяйте носитель 500 мкл теплого DMEM/5% FBS/Pen-Strep каждые 4-5 дней.

7. Иммуногистохимия

ПРИМЕЧАНИЕ: Иммуногистохимический анализ лучше всего проводить не менее чем через 3 дня, когда среда была заменена хотя бы один раз. Это гарантирует, что мусор будет удален, а ячейки полностью прилипнут к покровному стеклу.

1. Удалите носитель и пометьте клетки антимышиным mAb O4 (1:100) (см. Таблицу материалов) в теплой DMEM/5% FBS/10% обычной козьей сыворотке (NGS) в течение 15 минут при комнатной температуре (RT) или при 37 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пропустите этот шаг и перейдите к шагу 7.3, если ячейки не будут помечены O4.
2. Аккуратно промойте покровные стекла, трижды окунув их в теплый DMEM/5% FBS. Добавьте козий антимышиный 594 IgM (1:300) (см. таблицу материалов) в теплый DMEM/5% FBS/10% NGS и инкубируйте при RT в течение 15 мин в темноте. Аккуратно прополощите три раза в теплом ДМЕМ/5% FBS.
3. Зафиксируйте клетки холодной 5%-ной уксусной кислотой/метанолом в течение 15 мин при 4 °C. Промойте три раза 1x PBS, затем пометьте соответствующими антителами: антикроличий GFAP (1:500), антимышиный GFAP (1:500) или антикроличий Iba1 (1:500) в 1% Triton-X100/10% NGS в 1x DPBS (см. Таблицу материалов). Инкубируют в течение 1 ч при РТ.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Храните покровные листы в темноте, если они уже были испачканы O4.
4. Аккуратно смойте три раза PBS. Метка с соответствующими вторичными антителами: антимышиный 594 IgG (1:500), антикроличий 488 IgG (1:500) (см. таблицу материалов). Инкубируют в течение 30 мин при РТ в темноте.
5. Аккуратно смойте три раза PBS. Контрокрашивать DAPI (1:1000) в течение 1 мин при RT. Трижды промыть PBS, добавить монтажную среду (см. Таблицу материалов) и установить покровные стекла на предметные стекла.

8. Экстракция РНК

ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале должно быть не менее 100 000 клеток, чтобы извлечь достаточное количество РНК для анализа. При необходимости могут быть объединены клетки из 2-3 спинного мозга.

1. Экстрагируйте РНК с помощью коммерчески доступного набора для выделения РНК в соответствии с протоколом производителя (см. таблицу материалов). Для каждого этапа промывки с помощью буфера для промывки RW1, входящего в комплект, оставляйте ячейки в буфере для стирки еще на 2 минуты.
2. Удалите всю оставшуюся геномную ДНК с помощью ДНКазы I в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов). Инкубируют с ДНКазой при RT в течение 15 мин, затем промывают буфером RW1.
3. Для увеличения выхода РНК перед элюированием образцы инкубируют в воде, не содержащей РНКазы, при РТ в течение 10 мин. Оценивают целостность и количество РНК с помощью биоанализатора¹⁵ (см. таблицу материалов).

Результаты

Методы, описанные в этом протоколе, позволяют выделять чистую и жизнеспособную микроглию и астроциты из спинного мозга взрослой мыши, облегчая различные последующие применения, включая функциональные или гистологические анализы in vitro и анализ РНК.

Успешная изоляци...

Обсуждение

Выделение чистых, жизнеспособных первичных клеток имеет первостепенное значение для изучения структуры и функций конкретных типов клеток. У взрослых мышей, особенно в спинном мозге, эта задача представляет значительные трудности, поскольку существующие протоколы часто не адаптирова...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma Aldrich	T48402
24 well tissue culture plate	Avantor	10861-558
2-Methyl-2-butanol, 98%	Thermo Fisher	A18304-0F
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride	Invitrogen	D1306	1:1000
45% glucose solution	Corning	25-037-CI
5 mL capped tubes	Eppendorf	30122305
Acetic acid	Sigma-Adlrich	A6283
Adult Brain Dissociation Kit	Miltenyi	103-107-677
Anti-ACSA2 Microbead Kit	Miltenyi	130-097-679
Anti-Iba1	Wako	019-1974
Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939BA
C57BL/6J wild-type (WT) mice	Jackson Laboratories
CD11b (Microglia) MicroBeads	Miltenyi	130-093-634
Celltrics 30 µm filter	Sysmex Partec	04-004-2326
Counting Chamber (Hemacytometer)	Hausser Scientific Co	3200
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma Aldrich	D4527-40KU
Distilled water	TMO	15230001
DMEM/F12	Thermo Fisher	11320074
DNase for RNA purification	Qiagen	79254
Dulbecco's phosphate-buffered saline	Thermo Fisher	14040117
Fetal bovine serum	Thermo Fisher	A5209401
GFAP antibody (mouse)	Santa Cruz	sc-33673	1:500
GFAP antibody (rabbit)	Dako	Z0334	1:500
Goat anti-mouse 594 IgG	Invitrogen	a11032	1:500
Goat anti-mouse 594 IgM	Invitrogen	a21044	1:300
Goat anti-Rabbit 488 IgG	Invitrogen	a11008	1:500
Iba1 antibody (rabbit)	Wako	019-1974	1:500
MACS Separator	Miltenyi	130-042-303
Masterflex C/L Pump System	Thermo Fisher	77122-22
MEM	Corning	15-015-CV
Methanol	Sigma-Adlrich	439193
Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000-10
MS Columns	Miltenyi	130-042-401
O4 Antibody	R&D	MAB1326
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070063
Plugged 9" glass pasteur pipette	VWR	14672-412
RNeasy Plus Micro Kit	Qiagen	74034
Royal-tek Surgical scalpel blade no. 10	Fisher scientific	22-079-683
Small Vein Infusion Set, 23 G x 19 mm	Kawasumi	D3K2-23G