Выделение чистых астроцитов и микроглии из спинного мозга взрослой мыши для анализов in vitro и транскриптомных исследований

Резюме

В этом протоколе описывается выделение очищенных астроцитов и микроглии из спинного мозга взрослой мыши, что облегчает последующие применения, такие как анализ РНК и культивирование клеток. Он включает в себя подробные методы и процедуры клеточной диссоциации, предназначенные для повышения качества и выхода изолированных клеток.

Аннотация

Астроциты и микроглия играют ключевую роль в развитии центральной нервной системы, реакциях на травмы и нейродегенеративных заболеваниях. Эти высокодинамичные клетки демонстрируют быструю реакцию на изменения окружающей среды и демонстрируют значительную гетерогенность с точки зрения морфологии, транскрипционных профилей и функций. Несмотря на то, что наше понимание функций глиальных клеток в норме и при болезнях значительно продвинулось, по-прежнему существует потребность в клеточно-специфическом анализе in vitro, проводимом в контексте повреждений или травм, чтобы всесторонне охарактеризовать отдельные клеточные популяции. Изоляция клеток взрослой мыши имеет ряд преимуществ по сравнению с клеточными линиями или новорожденными животными, поскольку позволяет проводить анализ клеток в патологических условиях и в определенные моменты времени. Кроме того, сосредоточение внимания на специфической изоляции спинного мозга, исключая поражение головного мозга, позволяет исследовать патологии спинного мозга, включая экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит, травму спинного мозга и боковой амиотрофический склероз. Этот протокол представляет собой эффективный метод выделения астроцитов и микроглии из спинного мозга взрослой мыши, облегчающий немедленный или будущий анализ с потенциальными приложениями в функциональных, молекулярных или протеомных исследованиях.

Введение

Астроциты и микроглия являются универсальными глиальными клетками, которые играют жизненно важную роль в центральной нервной системе (ЦНС), выполняя такие обязанности, как регуляция функции нейронов, содействие развитию ЦНС, поддержание гематоэнцефалического барьера и участие в других критических процессах 1,2,3,4 . Помимо своей роли в поддержании гомеостаза, эти глиальные клетки также играют ключевую роль в механизмах повреждения и восстановления. Микроглия хорошо известна своими фагоцитарными, воспалительными и миграционными способностями....

протокол

Все процедуры по уходу за животными и экспериментальные процедуры были проведены после одобрения Комитета по уходу за животными и их использованию в Школе медицины и медицинских наук Университета Джорджа Вашингтона (Вашингтон, округ Колумбия, США; IACUC#2021-004). В исследовании использовались самцы и самки мышей дикого типа C57BL/6J (WT) в возрасте от 10 недель до 5 месяцев, которые были получены от коммерческого поставщика (см. таблицу материалов) и размещены в Университете Джорджа Вашингтона. Обзор рабочего процесса протокола представлен на рисунке 1.

1. Подготовка спинного мозга

Результаты

Методы, описанные в этом протоколе, позволяют выделять чистую и жизнеспособную микроглию и астроциты из спинного мозга взрослой мыши, облегчая различные последующие применения, включая функциональные или гистологические анализы in vitro и анализ РНК.

Успешная изоляци.......

Обсуждение

Выделение чистых, жизнеспособных первичных клеток имеет первостепенное значение для изучения структуры и функций конкретных типов клеток. У взрослых мышей, особенно в спинном мозге, эта задача представляет значительные трудности, поскольку существующие протоколы часто не адаптирова.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma Aldrich	T48402
24 well tissue culture plate	Avantor	10861-558
2-Methyl-2-butanol, 98%	Thermo Fisher	A18304-0F
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride	Invitrogen	D1306	1:1000
45% glucose solution	Corning	25-037-CI
5 mL capped tubes	Eppendorf	30122305
Acetic acid	Sigma-Adlrich	A6283
Adult Brain Dissociation Kit	Miltenyi	103-107-677
Anti-ACSA2 Microbead Kit	Miltenyi	130-097-679
Anti-Iba1	Wako	019-1974
Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939BA
C57BL/6J wild-type (WT) mice	Jackson Laboratories
CD11b (Microglia) MicroBeads	Miltenyi	130-093-634
Celltrics 30 µm filter	Sysmex Partec	04-004-2326
Counting Chamber (Hemacytometer)	Hausser Scientific Co	3200
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma Aldrich	D4527-40KU
Distilled water	TMO	15230001
DMEM/F12	Thermo Fisher	11320074
DNase for RNA purification	Qiagen	79254
Dulbecco's phosphate-buffered saline	Thermo Fisher	14040117
Fetal bovine serum	Thermo Fisher	A5209401
GFAP antibody (mouse)	Santa Cruz	sc-33673	1:500
GFAP antibody (rabbit)	Dako	Z0334	1:500
Goat anti-mouse 594 IgG	Invitrogen	a11032	1:500
Goat anti-mouse 594 IgM	Invitrogen	a21044	1:300
Goat anti-Rabbit 488 IgG	Invitrogen	a11008	1:500
Iba1 antibody (rabbit)	Wako	019-1974	1:500
MACS Separator	Miltenyi	130-042-303
Masterflex C/L Pump System	Thermo Fisher	77122-22
MEM	Corning	15-015-CV
Methanol	Sigma-Adlrich	439193
Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000-10
MS Columns	Miltenyi	130-042-401
O4 Antibody	R&D	MAB1326
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070063
Plugged 9" glass pasteur pipette	VWR	14672-412
RNeasy Plus Micro Kit	Qiagen	74034
Royal-tek Surgical scalpel blade no. 10	Fisher scientific	22-079-683
Small Vein Infusion Set, 23 G x 19 mm	Kawasumi	D3K2-23G