Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تتيح مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا (GECI) إجراء تحليل قوي على مستوى السكان لإشارات الخلايا العصبية الحسية. هنا ، قمنا بتطوير نهج جديد يسمح بتصور GECI في الجسم الحي لنشاط الخلايا العصبية للعقد مثلثة التوائم في الفئران.

Abstract

تمكن مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا (GECIs) تقنيات التصوير من مراقبة التغيرات في الكالسيوم داخل الخلايا في مجموعات الخلايا المستهدفة. نسبة الإشارة إلى الضوضاء الكبيرة تجعل GECIs أداة قوية للكشف عن النشاط المستحث في الخلايا العصبية الحسية. تسهل GECIs التحليل على مستوى السكان لتشفير التحفيز مع عدد الخلايا العصبية التي يمكن دراستها في وقت واحد. يتم ترميز السكان هذا بشكل مناسب في الجسم الحي. تستخدم العقد الجذرية الظهرية (DRG) ، التي تضم سوما الخلايا العصبية الحسية التي تعصب الهياكل الجسدية والحشوية أسفل الرقبة ، على نطاق واسع للتصوير في الجسم الحي لأن هذه الهياكل يمكن الوصول إليها بسهولة نسبية. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام هذه التقنية في الفئران لدراسة الخلايا العصبية الحسية في العقدة الثلاثية التوائم (TG) التي تعصب الهياكل الفموية والقحفية الوجهية. هناك العديد من الأسباب لدراسة TG بالإضافة إلى DRG ، بما في ذلك القائمة الطويلة من متلازمات الألم الخاصة بالهياكل الفموية والقحفية الوجهية التي يبدو أنها تعكس التغيرات في نشاط الخلايا العصبية الحسية ، مثل ألم العصب الثلاثي التوائم. تستخدم الفئران على نطاق واسع في دراسة الخلايا العصبية DRG و TG بسبب توفر الأدوات الوراثية. ومع ذلك ، مع وجود اختلافات في الحجم ، وسهولة التعامل ، والاختلافات المحتملة في الأنواع المهمة ، هناك أسباب لدراسة الخلايا العصبية TG للفئران بدلا من الفأر. وهكذا ، قمنا بتطوير نهج لتصوير الخلايا العصبية TG الفئران في الجسم الحي. قمنا بحقن الجراء حديثي الولادة (p2) داخل الصفاق بترميز AAV GCaMP6s ، مما أدى إلى إصابة >90٪ من كل من الخلايا العصبية TG و DRG. تم تصوير TG في البالغين بعد حج القحف والتقشير ، وتم رصد التغيرات في مضان GCaMP6s في الخلايا العصبية TG بعد تحفيز مناطق الفك السفلي والفك العلوي من الوجه. أكدنا أن الزيادات في التألق كانت محفزة مع إحصار الأعصاب المحيطية. في حين أن هذا النهج له العديد من الاستخدامات المحتملة ، فإننا نستخدمه لتوصيف السكان (السكان) الفرعية للخلايا العصبية TG التي تغيرت بعد إصابة الأعصاب الطرفية.

Introduction

يبدأ الإحساس الجسدي ، وهو الترميز العصبي للمحفزات الميكانيكية والحرارية والكيميائية التي تصطدم بالجلد أو الهياكل الجسدية الأخرى ، بما في ذلك العضلات والعظام والأحشاء ، بالنشاط في الخلايا العصبية الواردة الأولية التي تعصب هذه الهياكل1. قدمت الأساليب الفيزيولوجية الكهربية القائمة على وحدة واحدة ثروة من المعلومات حول الأنواع الفرعية الواردة المشاركة في هذه العملية وكذلك كيف يمكن أن تتغير خصائص استجابات التحفيز بمرور الوقت1،2،3. ومع ذلك ، في حين لا تزال هناك أدلة قوية تدعم نظرية الخط المسمى ، والتي تشير إلى أن طرائق حسية محددة يتم نقلها بواسطة مجموعة (مجموعات) فرعية محددة من الخلايا العصبية ، فإن قدرة العديد من المجموعات السكانية الفرعية للخلايا العصبية على الاستجابة لنفس الأنواع من المحفزات الميكانيكية والحرارية والكيميائية تشير إلى أن غالبية المحفزات الحسية الجسدية يتم ترميزها بواسطة مجموعات فرعية متعددة من الخلايا العصبية4 ، 5. وبالتالي ، فإن الفهم الأفضل للإحساس الجسدي لن يأتي إلا مع القدرة على دراسة نشاط 10 ، إن لم يكن المئات ، من الخلايا العصبية في وقت واحد.

سهلت التطورات في الأساليب البصرية مع ظهور تقنيات التصوير البؤري والمتعدد الفوتونات والرقمي ، وبالتالي تقنيات التصوير الرقمي ، القدرة على إجراء تحليلات غير جراحية نسبيا على مستوى السكان للنشاط العصبي 6,7. كانت إحدى العقبات الأخيرة في تطبيق هذه التكنولوجيا هي تطوير أدوات لتمكين التقييم البصري للنشاط العصبي. بالنظر إلى سرعة جهد الفعل الذي يمكن أن يبدأ وينتهي في أقل من ميلي ثانية ، فإن الصبغة الحساسة للجهد مع القدرة على متابعة التغيرات في جهد الغشاء بسرعة جهد الفعل ستكون الأداة المثالية لهذا الغرض. ولكن في حين كان هناك تقدم هائل في هذا المجال7،8،9،10 ، فإن نسبة الإشارة إلى الضوضاء للعديد من هذه الأصباغ لا تزال غير عالية بما يكفي لتمكين تحليل السكان لمئات الخلايا العصبية على مستوى الخلية الواحدة. كنهج بديل ، تحول الباحثون إلى مراقبة التغيرات في تركيز Ca2+ داخل الخلايا ([Ca2+] i). كانت القيود المفروضة على هذه الاستراتيجية واضحة منذ البداية وتشمل حقيقة أن الزيادة في [Ca2+] i هي مقياس غير مباشر للنشاط العصبي11 ؛ أن زيادة في [Ca2+]i قد تحدث بشكل مستقل عن تدفق Ca2+ المرتبط بتنشيط قنوات Ca2+ ذات الجهد الكهربائي (VGCCs)12,13؛ أن حجم ومدة عابر Ca2+ يمكن التحكم فيهما من خلال عمليات مستقلة عن نشاط VGCC11،12،14؛ وأن المسار الزمني لعابري Ca2+ يتجاوز بكثير مسار جهدالفعل 15. ومع ذلك ، هناك عدد من المزايا المهمة المرتبطة باستخدام Ca2+ كمقياس غير مباشر للنشاط العصبي. ليس أقلها نسبة الإشارة إلى الضوضاء المرتبطة بمعظم مؤشرات Ca2+ ، مما يعكس حجم التغيير في Ca2+ داخل الخلايا وحقيقة أن الإشارة تنشأ من الفضاء ثلاثي الأبعاد للسيتوسول بدلا من الفضاء ثنائي الأبعاد لغشاء الخلية. علاوة على ذلك ، مع تطوير مؤشرات Ca2+ المشفرة وراثيا (GECI's) ، من الممكن الاستفادة من الاستراتيجيات الجينية لدفع التعبير عن مؤشرات Ca2+ في مجموعات فرعية محددة من الخلايا ، وتسهيل التحليلات على مستوى السكان في الاستعدادات السليمة (على سبيل المثال ، انظر16).

بالنظر إلى عدد الأدوات الوراثية المتاحة الآن في الفئران ، فلا ينبغي أن يكون مفاجئا أن GECI قد تم استخدامه على نطاق واسع في هذا النوع. تم تطوير خطوط الماوس مع تعبير GECI التأسيسي في مجموعات فرعية من الخلايا العصبية الحسية7،16،17. مع تطور خطوط الماوس التي تعبر عن عمليات إعادة التركيب في أنواع معينة من الخلايا ، من الممكن استخدام استراتيجيات أكثر تعقيدا للتحكم في تعبير GECI15. ومع ذلك ، في حين أن هذه الأدوات أقوى من أي وقت مضى ، إلا أن هناك عددا من الأسباب التي تجعل الأنواع الأخرى ، مثل الفئران ، أكثر ملاءمة لبعض الأسئلة التجريبية. وتشمل هذه الحجم الأكبر ، مما يسهل عددا من عمليات التلاعب التجريبية التي يصعب ، إن لم يكن مستحيلا ، في الماوس الأصغر ؛ سهولة تدريب الفئران في المهام السلوكية المعقدة نسبيا ؛ وعلى الأقل بعض الأدلة على أن الخصائص الفيزيائية الحيوية وأنماط التعبير للعديد من القنوات الأيونية في الخلايا العصبية الحسية للفئران قد تكون أكثر تشابها مع تلك التي لوحظت في الخلايا العصبية الحسية البشرية من نفس القنوات في الفئران بالنسبة إلىالإنسان 18.

في حين أن نقل المنبهات الحسية الجسدية يحدث بشكل عام في المحطات الطرفية للوارد الأولي ، يجب أن يمر جهد الفعل الذي يبدأ في المحيط عبر الهيكل الذي يضم سوماتا واردة أولية ، يشار إليها باسم الجذر الظهري (DRG) أو العقد ثلاثية التوائم (TG) قبل الوصول إلى الجهاز العصبي المركزي19. في حين أن هناك أدلة على أنه ليس كل جهد فعل ينتشر على طول محور وارد أولي سيغزو جسم الخلية20 ، نتيجة لحقيقة أن سوماتا الواردة الأولية متصلة بالمحور العصبي الوارد الرئيسي عبر تقاطع T19 ، يبدو أن غالبية جهود الفعل التي بدأت في المحيط تغزو سوما21. وهذا يمنح ثلاث مزايا تجريبية عند استخدام GECIs لتقييم الترميز السكاني في الواردات الأولية: الحجم الكبير لجسم الخلية بالنسبة إلى المحاور يزيد من الإشارة إلى الضوضاء عند استخدام [Ca2+] i كمقياس غير مباشر للنشاط الوارد. من السهل الوصول إلى DRG بشكل عام ؛ وتقييم النشاط في موقع بعيد مكانيا عن المحطات الواردة يقلل من التأثير المحتمل للجراحة اللازمة لكشف العقد على خصائص استجابة التحفيز للمحطات الواردة. ومع ذلك ، نظرا لأن TG تقع أسفل الدماغ (أو فوق اللوحة) ، فإن الوصول إليها أصعب بكثير من DRG. علاوة على ذلك ، في حين أن هناك العديد من أوجه التشابه بين الخلايا العصبية DRG و TG ، إلا أن هناك قائمة متزايدة من الاختلافات أيضا. وهذا يشمل التنظيم الجسدي تقريبا للخلايا العصبية في TG22 ، والهياكل الفريدة المعصبة ، وأنماط الإنهاء الطرفية المركزية المختلفة23،24،25،26 ، والآن قائمة متزايدة من الاختلافات في كل من التعبير الجيني27،28 وتعبير المستقبلات الوظيفية29. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأننا مهتمون بتحديد الآليات المحيطية للألم ، فإن العدد الكبير نسبيا من متلازمات الألم التي تبدو فريدة من نوعها في النظام الثلاثي التوائم (على سبيل المثال ، الصداع النصفي ، ألم العصب الثلاثي التوائم ، متلازمة الفم الحارق) التي يبدو أنها تنطوي على نشاط شاذ في الحالات الأولية30،31،32 ، يشير إلى أن TG يحتاج إلى دراسة مباشرة.

وهكذا ، في حين تمت دراسة خصائص استجابة التحفيز للخلايا العصبية TG مع GECIs في الفأر16 ، لأن الأسباب المذكورة أعلاه تشير إلى أن الفئران قد تكون نوعا أكثر ملاءمة لمعالجة مجموعة متنوعة من الأسئلة التجريبية ، كان الغرض من الدراسة الحالية هو تطوير نهج لاستخدام GECIs لدراسة الخلايا العصبية TG في الفئران. لتحقيق ذلك ، استخدمنا نهجا فيروسيا لدفع التعبير عن GECI GCaMP6s في الجهاز العصبي المحيطي. ثم أزلنا الدماغ الأمامي للسماح بالوصول إلى TG. أخيرا ، تم تطبيق المحفزات الميكانيكية والحرارية على الوجه بينما تم تقييم الاستجابات العصبية تحت المجهر الفلوري. تدعم هذه البيانات معا دورا لاستخدام الفئران للتحقيق في التغييرات في TG في العديد من الولايات ، وتوسيع مجموعة الأدوات للمحققين المهتمين بالترميز الحسي في نظام مثلث التوائم.

Protocol

تم إجراء جميع التجارب التي تنطوي على استخدام في البحث وفقا للمعايير التي وضعتها المعاهد الوطنية للصحة والرابطة الدولية لدراسة الألم وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسية بجامعة بيتسبرغ (البروتوكول #22051100). في نهاية كل تجربة ، تم القتل الرحيم للفئران عن طريق التضخيم مع التروية القلبية للمحلول الملحي المخزن بالفوسفات المثلج (PBS) ، وهو نهج وافقت عليه الجمعية الطبية البيطرية الأمريكية وجامعة بيتسبرغ IACUC.

1. تحريض GCaMP

  1. اطلب فئران Sprague Dawley الحامل بالوقت حتى يمكن حقن الجراء في الوقت المناسب بعد الولادة.
  2. رش القفازات بنسبة 70٪ EtOH قبل التعامل مع كل جرو فئران. هذا سوف يردع السد عن أكل لحوم الشباب.
  3. مسحة الجراء الفئران (P1-2) مع 70 ٪ EtOH وتخدير على الجليد لمدة 3 دقائق.
  4. حقن 15 ميكرولتر من AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40 (Addgene) داخل الصفاق باستخدام حقنة هاملتون معقمة 25 ميكرولتر ومحكمة الغلق.

2. جراحة التعرض للعقدة الثلاثية التوائم

  1. يتم تطبيق كوكتيل مخدر (55 ملغ/كغ من الكيتامين، 5.5 ملغ/كغ من الزيلازين، 1 ملغ/كغ من الأسيبرومازين) داخل الصفاق على أساس وزن الجسم لدى الفئران البالغة من العمر 6-8 أسابيع (حوالي 150-200 غ).
    ملاحظة: هذا يكفي بشكل عام للحفاظ على مستوى التخدير الجراحي كما تم تقييمه من خلال عدم وجود منعكس انسحابي لقرصة ضارة من مخلب خلفي. ومع ذلك ، تكملة مع isoflurane عن طريق مخروط الأنف إذا أصبحت خفيفة.
  2. بمجرد التخدير الكامل ، احلق شعر وشعيرات الرأس والوجه.
  3. قم بتركيب الجرذ على إطار مجسم مع قضبان الأذن وضع وسادة تدفئة (~ 37 درجة مئوية) تحتها للحفاظ على درجة حرارة الجسم.
  4. راقب العلامات الحيوية (معدل ضربات القلب ، معدل التنفس ، تشبع الأكسجين في الدم) باستخدام مقياس تأكسج الماوس أو ما يعادله.
    ملاحظة: تتم مراقبة درجة حرارة الجسم بواسطة مسبار المستقيم ويتم الحفاظ عليها عن طريق وضع الفئران على بطانية مياه متداولة يتم التحكم فيها بالتغذية المرتدة.
  5. ضع شاشا مغموسا في محلول ملحي بارد على الرأس لتضييق الأوعية الدموية لتقليل النزيف. باستخدام مشرط بحجم 15 ، قم بعمل شق في خط الوسط للجلد والعضلات فوق الجمجمة.
  6. استخدم تشريحا حادا للجلد والعضلات لفضح الجمجمة.
  7. باستخدام مثقاب دائري 1/4 ، قم بثقب غطاء الجمجمة بعناية لكشف الدماغ الأمامي. بعد ذلك ، استخدم rongeurs (كوب 2.5 مم) لقطع الجمجمة بعناية.
  8. باستخدام مشرط بحجم 15 ، قم بعمل شق في الدماغ (Bregma: -3.80) والبصلة الشمية.
    ملاحظة: سيؤدي قطع هذه النقطة بشكل أكثر ذيلية إلى موت الفئران
  9. استخدم ملعقة لفصل الجافية بعناية عن الجمجمة ورفع الدماغ المقطوع برفق للكشف عن TG وقاعدة الجمجمة.
    ملاحظة: الاستخدام الإضافي للتروية الملحية الباردة في جميع أنحاء الاستخراج سيقلل من النزيف ويحسن مجال التشريح التالي.
  10. باستخدام قلم الكي ، أوقف أي نزيف ناتج عن الاستخراج.
    ملاحظة: سيؤدي قطع الجافية إلى نزيف لا مفر منه. من الأفضل تحضير aCSF المثلج (119 mM NaCl ، 26.2 mM NaHCO3 ، 2.5 mM KCl ، 1 mM NaH2PO4 ، 1.3 mM MgCl2 ، 10 mM Glucose ، 2.5 mM CaCl2) لاستحمام تجويف الجمجمة للمساعدة في تضييق الأوعية الدموية مع الحفاظ على صحة الخلايا العصبية.

3. تصوير GCaMP6s

ملاحظة: نظرا لحجم وكثافة هذه الخلايا العصبية ، فإن نظام التصوير والحصول على البيانات المستخدم (الهدف ، المجهر ، مصدر الضوء ، الكاميرا) سيحدد عدد خلايا GECI + المرئية. سيحدد مصدر الضوء والهدف والكاميرا أيضا المعلمات المستخدمة للحصول على الصور ، بما في ذلك وقت التعرض ومعدل التقاط الصورة. بينما يمكن استخدام التقنيات متعددة الفوتونات والبؤر اعتمادا على معلمات التجربة ، قد يكون الفحص المجهري الفلوري كافيا لحل العديد من الخلايا. يمكن استخدام أي حزمة الحصول على الصور. من الناحية المثالية ، يكون تطبيق التحفيز مقفلا زمنيا مع حزمة برامج الحصول على الصور.

  1. ضع تجويف الجمجمة أسفل الهدف واجعل TG في التركيز باستخدام الضوء المرئي.
  2. الطول الموجي للإثارة ل GCaMP6s هو 496 نانومتر ، وطول موجة الانبعاث 513 نانومتر ؛ وبالتالي ، استخدم مكعبات ثنائية اللون ومرشحة مناسبة لتحديد موقع خلايا GCaMP+ . اضبط التركيز لتحديد منطقة العقد وحلها حيث تستجيب الخلايا العصبية للمنبهات المطبقة على مجال الاهتمام الاستقبالي.
  3. استخدم هدف 10x لتمكين تصورات معظم الخلايا العصبية في TG تستجيب للمنبهات الميكانيكية المطبقة على منطقة 1 سم2 من الوجه16. استخدم هدفا جافا بمعدل 20 ضعفا مع مسافة عمل طويلة (10.8 مم) لزيادة الدقة.
  4. استخدم برنامج الاستحواذ (على سبيل المثال ، Metamorph) لجمع بيانات التألق بمرور الوقت واستجابة لتطبيق التحفيز.
    1. لتقليل التبييض الضوئي للخلايا العصبية ، استخدم وقت التعرض القصير قدر الإمكان للكشف عن خط الأساس والزيادات المستثارة في التألق. وباستخدام الهدف الجوي 20x، 0.40 NA، ومصدر ضوء هاليد الزئبق بقدرة 120 واط، وكاميرا تكميلية لأشباه الموصلات بأكسيد المعادن (CMOS) المستخدمة في هذه الدراسة، ووقت تعرض يبلغ 300 مللي ثانية، ومعدل التقاط صور يبلغ 3 هرتز، احصل على تسجيلات أساسية مستقرة لمدة >90 دقيقة.
      ملاحظة: 1) يجب تحديد معلمات الحصول على الصور هذه تجريبيا. 2) يمكن تطبيق الميكانيكية (فرشاة ، مثقوبة ، اهتزاز ، قرصة) ، حرارية (حرارة وبرودة) ، وكيميائية (كبخاخات ، منثول ، وسطاء التهابات) على المجال المستقبل. النهج الذاتي غير المكلف نسبيا هو تطبيق المحفزات باليد. ومع ذلك ، يوصى بنهج أكثر موضوعية وقابلة للتكرار ، حيث يمكن استخدام المشغلات التي يتم التحكم فيها بالتغذية المرتدة للتطبيق المتكرر بقوة معروفة. في حين أن أجهزة بلتيير التي يتم التحكم فيها بالتغذية المرتدة مفيدة للتحكم في التدفئة والتبريد ، إلا أنها ليست مثالية للتحفيز الحراري للوجه المنحني. تعد مصادر ضوء الأشعة تحت الحمراء التي يتم التحكم فيها بالتغذية المرتدة بديلا للتدفئة ، والرذاذ البارد هو بديل أقل من مثالي للتبريد.

النتائج

نظرا لأننا حققنا نجاحا سابقا مع النمط المصلي AAV9 لعدوى الخلايا العصبية الحسية للفئران15 ، فقد استخدمنا هذا النمط المصلي للتعبير عن GCaMP6s في الخلايا العصبية TG للفئران. لذلك سعينا أولا إلى تقييم كفاءة عدوى الخلايا العصبية الحسية ل AAV9-CAG-GCaMP6s-WPRE-SV40 (AAV9-GCaMP) عندما تم إعطاء هذا الفيروس ل...

Discussion

هنا ، نوضح طريقة سريعة وغير جراحية لتوليد فأر GECI لتصوير TG. اخترنا محفز CAG لدفع والحفاظ على مستويات عالية من التعبير الجيني. بينما تشير الدراسات السابقة إلى أن الأنماط المصلية الأخرى AAV قد تدفع بكفاءة التعبير الجيني في الخلايا العصبية DRG39 ، فإن نتائجنا تتفق مع دراسة حديثة تتضمن ?...

Disclosures

كان الدكتور جولد يتلقى دعما للمنح من Grunenthal أثناء تطوير هذا الإعداد. لم يكن هناك تداخل في تركيز دراسة جروننتال والإعداد الموصوف في هذه المخطوطة. ليس لدى أي من المؤلفين الآخرين أي تضارب محتمل آخر في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

نود أن نشكر الدكتورة كاثي ألبرز وبريان ديفيس على استخدام برنامج Leica Microscope and Metamorph ، وتشارلز وارويك للمساعدة في بناء جهاز بلتيير الحراري الخاص بنا ، والدكتور ريموند سيكولا للمساعدة في استكشاف أخطاء التحضير الجراحي وإصلاحها. تم دعم هذا العمل بمنح من المعاهد الوطنية للصحة: F31NS125993 (JYG) و T32NS073548 (JYG) و R01NS122784 (MSG و RS).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40 Addgene100844-AAV9AAV9-GCaMP6s virus
ACEpromazine maleateCovetrus11695-0095-510 mg/mL
AnaSed (Xylazine) injectionAKORN Animal Health23076-35-920 mg/mL
CTR5500 Electronics boxLeica11 888 820Power Supply
Cutwell burr drill bitRansom & Randolph¼ round
DM 6000 FSLeica11 888 928Base Stand
EL6000LeicaEL6000Light source with 120 W mercury bulb
ForcepsFST11252-00Dumont No. 05
Friedman rongeursFST16000-142.5 mm cup size
Friedman-Pearson rongeursFST16021-141 mm cup size
Heating pad (Temperature therapy pad)STRYKER8002-062-022
Ketamine hydrochlorideCovetrus1695-0703-1100 mg/mL
Plan Fluor 20x/0.40LeicaMRH0010520x objective, 0.4 NA10.8 mm WD
Power handle high-temp cautery penBovieHIT1handheld Change-A-Tip cautery pen
Prime 95BPhotometricsPrime 95BCMOS Camera
SalineFisher ScientificNC02917990.9% Sterile Saline
Scalpel bladeFisher Scientific22-079-701size 15 disposable blade
SpatulaBRI48-1460brain spatula
Spring scissorsFST91500-09Student Vannas, 5 mm cutting edge
Spring scissorsFST15012-12Noyes, 14 mm cutting edge
STP6000 Smart touch panelLeica11 501 255Control Panel
SyringeHamilton8020125 μL Model 1702 Luer Tip syringe
Water heaterAdroitHTP-1500

References

  1. Gold, M. S., Gebhart, G. F. Nociceptor sensitization in pain pathogenesis. Nat Med. 16 (11), 1248-1257 (2010).
  2. Gold, M. S., Caterina, M. J. . The Senses: A Comprehensive Reference. , (2008).
  3. Lawson, S. N., Fang, X., Djouhri, L. Nociceptor subtypes and their incidence in rat lumbar dorsal root ganglia (DRGs): focussing on C-polymodal nociceptors, Aβ-nociceptors, moderate pressure receptors and their receptive field depths. Curr Opin Physiol. 11, 125-146 (2019).
  4. Handler, A., Ginty, D. D. The mechanosensory neurons of touch and their mechanisms of activation. Nat Rev Neurosci. 22 (9), 521-537 (2021).
  5. Jankowski, M. P., et al. Cutaneous neurturin overexpression alters mechanical, thermal, and cold responsiveness in physiologically identified primary afferents. J Neurophysiol. 117 (3), 1258-1265 (2017).
  6. Shannonhouse, J., Gomez, R., Son, H., Zhang, Y., Kim, Y. S. In vivo calcium imaging of neuronal ensembles in networks of primary sensory neurons in intact dorsal root ganglia. J Vis Exp. 192, 64826 (2023).
  7. Anderson, M., Zheng, Q., Dong, X. Investigation of pain mechanisms by calcium imaging approaches. Neurosci Bull. 34 (1), 194-199 (2018).
  8. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
  9. Iseppon, F., Linley, J. E., Wood, J. N. Calcium imaging for analgesic drug discovery. Neurobiol Pain. 11, 100083 (2022).
  10. Tada, M., Takeuchi, A., Hashizume, M., Kitamura, K., Kano, M. A highly sensitive fluorescent indicator dye for calcium imaging of neural activity in vitro and in vivo. Eur J Neurosci. 39 (11), 1720-1728 (2014).
  11. Lu, S. G., Zhang, X., Gold, M. S. Intracellular calcium regulation among subpopulations of rat dorsal root ganglion neurons. J Physiol. 577 (Pt 1), 169-190 (2006).
  12. Warwick, C., et al. Cell type-specific calcium imaging of central sensitization in mouse dorsal horn. Nat Commun. 13 (1), 5199 (2022).
  13. Scheff, N. N., Yilmaz, E., Gold, M. S. The properties, distribution and function of Na(+)-Ca(2+) exchanger isoforms in rat cutaneous sensory neurons. J Physiol. 592 (Pt 22), 4969-4993 (2014).
  14. Scheff, N. N., Gold, M. S. Trafficking of na+/ca2+ exchanger to the site of persistent inflammation in nociceptive afferents. J Neurosci. 35 (22), 8423-8432 (2015).
  15. Hartung, J. E., Gold, M. S. GCaMP as an indirect measure of electrical activity in rat trigeminal ganglion neurons. Cell Calcium. 89, 102225 (2020).
  16. Ghitani, N., et al. Specialized mechanosensory nociceptors mediating rapid responses to hair pull. Neuron. 95 (4), 944-954 (2017).
  17. Cichon, J., et al. Imaging neuronal activity in the central and peripheral nervous systems using new Thy1.2-GCaMP6 transgenic mouse lines. J Neurosci Methods. 334, 108535 (2020).
  18. Zhang, X., et al. Nicotine evoked currents in human primary sensory neurons. J Pain. 20 (7), 810-818 (2019).
  19. Devor, M. Unexplained peculiarities of the dorsal root ganglion. Pain. Suppl 6, S27-S35 (1999).
  20. Amir, R., Devor, M. Electrical excitability of the soma of sensory neurons is required for spike invasion of the soma, but not for through-conduction. Biophys J. 84 (4), 2181-2191 (2003).
  21. Wang, F., et al. Sensory afferents use different coding strategies for heat and cold. Cell Rep. 23 (7), 2001-2013 (2018).
  22. Gregg, J. M., Dixon, A. D. Somatotopic organization of the trigeminal ganglion in the rat. Arch Oral Biol. 18 (4), 487-498 (1973).
  23. Dessem, D., Moritani, M., Ambalavanar, R. Nociceptive craniofacial muscle primary afferent neurons synapse in both the rostral and caudal brain stem. J Neurophysiol. 98 (1), 214-223 (2007).
  24. Dessem, D., Luo, P. Jaw-muscle spindle afferent feedback to the cervical spinal cord in the rat. Exp Brain Res. 128 (4), 451-459 (1999).
  25. Sessle, B. J., Dubner, R., Greenwood, L. F., Lucier, G. E. Descending influences of periaqueductal gray matter and somatosensory cerebral cortex on neurones in trigeminal brain stem nuclei. Can J Physiol Pharmacol. 54 (1), 66-69 (1976).
  26. Shammah-Lagnado, S. J., Negrão, N., Silva, B. A., Ricardo, J. A. Afferent connections of the nuclei reticularis pontis oralis and caudalis: a horseradish peroxidase study in the rat. Neuroscience. 20 (3), 961-989 (1987).
  27. Korczeniewska, O. A., et al. Differential gene expression changes in the dorsal root versus trigeminal ganglia following peripheral nerve injury in rats. Eur J Pain. 24 (5), 967-982 (2020).
  28. Megat, S., et al. Differences between dorsal root and trigeminal ganglion nociceptors in mice revealed by translational profiling. J Neurosci. 39 (35), 6829-6847 (2019).
  29. Pineda-Farias, J. B., Loeza-Alcocer, E., Nagarajan, V., Gold, M. S., Sekula, R. F. Mechanisms underlying the selective therapeutic efficacy of carbamazepine for attenuation of trigeminal nerve injury pain. J Neurosci. 41 (43), 8991-9007 (2021).
  30. Burchiel, K. J., Baumann, T. K. Pathophysiology of trigeminal neuralgia: new evidence from a trigeminal ganglion intraoperative microneurographic recording. Case report. J Neurosurg. 101 (5), 872-873 (2004).
  31. Jääskeläinen, S. K. Is burning mouth syndrome a neuropathic pain condition. Pain. 159 (3), 610-613 (2018).
  32. Ashina, M., et al. Migraine and the trigeminovascular system-40 years and counting. Lancet Neurol. 18 (8), 795-804 (2019).
  33. Yang, O. J., et al. Evaluating the transduction efficiency of systemically delivered AAV vectors in the rat nervous system. Front Neurosci. 17, 1001007 (2023).
  34. Gemes, G., et al. Calcium signaling in intact dorsalroot ganglia: New observations and the effect of injury. Anesthesiology. 113 (1), 134-146 (2010).
  35. Xu, Q., Dong, X. Calcium imaging approaches in investigation of pain mechanism in the spinal cord. Exp Neurol. 317, 129-132 (2019).
  36. Wu, W., et al. Long-term in vivo imaging of mouse spinal cord through an optically cleared intervertebral window. Nat Commun. 13 (1), 1959 (2022).
  37. Cantu, D. A., et al. EZcalcium: Open-source toolbox for analysis of calcium imaging data. Front Neural Circuits. 14, 25 (2020).
  38. Romano, S. A., et al. An integrated calcium imaging processing toolbox for the analysis of neuronal population dynamics. PLoS Comput Biol. 13 (6), e1005526 (2017).
  39. Mason, M. R., et al. Comparison of AAV serotypes for gene delivery to dorsal root ganglion neurons. Mol Ther. 18 (4), 715-724 (2010).
  40. Sharma, N., et al. The emergence of transcriptional identity in somatosensory neurons. Nature. 577 (7790), 392-398 (2020).
  41. Matsuka, Y., Neubert, J. K., Maidment, N. T., Spigelman, I. Concurrent release of ATP and substance P within guinea pig trigeminal ganglia in vivo. Brain Res. 915 (2), 248-255 (2001).
  42. Hu, M. Visualization of trigeminal ganglion neuronal activities in mice. Curr Protoc Cell .Biol. 83 (1), e84 (2019).
  43. von Buchholtz, L. J., et al. Decoding cellular mechanisms for mechanosensory discrimination. Neuron. 109 (2), 285-298 (2021).
  44. Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. elife. 8, e38173 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

204

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved