In-Vivo Imagerie calcique des neurones sensoriels dans le ganglion trijumeau du rat

Résumé

Les indicateurs calciques codés génétiquement (GECI) permettent une analyse robuste de la signalisation des neurones sensoriels à l’échelle de la population. Ici, nous avons développé une nouvelle approche qui permet de visualiser in vivo l’activité des neurones des ganglions trijumeaux chez le rat.

Résumé

Les indicateurs calciques génétiquement codés (GECI) permettent aux techniques d’imagerie de surveiller les changements dans le calcium intracellulaire dans des populations cellulaires ciblées. Leur rapport signal/bruit élevé fait des GECI un outil puissant pour détecter l’activité évoquée par un stimulus dans les neurones sensoriels. Les GECI facilitent l’analyse au niveau de la population de l’encodage des stimuli avec le nombre de neurones pouvant être étudiés simultanément. Cet encodage de population est le plus approprié in vivo. Les ganglions de la racine dorsale (DRG), qui abritent le soma des neurones sensoriels innervant les structures somatiques et viscérales sous le cou, sont les plus largement utilisés pour l’imagerie in vivo car ces structures sont relativement faciles d’accès. Plus récemment, cette technique a été utilisée chez la souris pour étudier les neurones sensoriels du ganglion trijumeau (TG) qui innervent les structures buccales et craniofaciales. Il existe de nombreuses raisons d’étudier la TG en plus de la DRG, y compris la longue liste de syndromes douloureux spécifiques aux structures buccales et craniofaciales qui semblent refléter des changements dans l’activité des neurones sensoriels, tels que la névralgie du trijumeau. Les souris sont les plus utilisées dans l’étude des neurones DRG et TG en raison de la disponibilité d’outils génétiques. Cependant, avec des différences de taille, de facilité de manipulation et des différences d’espèces potentiellement importantes, il y a des raisons d’étudier les neurones TG du rat plutôt que de la souris. Ainsi, nous avons développé une approche pour l’imagerie des neurones TG de rat in vivo. Nous avons injecté des chiots nouveau-nés (p2) par voie intrapéritonéale avec un AAV codant pour GCaMP6s, ce qui a entraîné une infection de >90% des neurones TG et DRG. La TG a été visualisée chez l’adulte après craniotomie et décortication, et les changements dans la fluorescence de GCaMP6s ont été surveillés dans les neurones TG après stimulation des régions mandibulaires et maxillaires du visage. Nous avons confirmé que les augmentations de fluorescence étaient provoquées par un stimulus avec un bloc nerveux périphérique. Bien que cette approche ait de nombreuses utilisations potentielles, nous l’utilisons pour caractériser la ou les sous-populations de neurones TG modifiées à la suite d’une lésion des nerfs périphériques.

Introduction

La somatosensation, c’est-à-dire l’encodage neuronal des stimuli mécaniques, thermiques et chimiques qui affectent la peau ou d’autres structures corporelles, y compris les muscles, les os et les viscères, commence par l’activité des neurones afférents primaires qui innervent^{ces structures.} Les approches électrophysiologiques basées sur une seule unité ont fourni une mine d’informations sur les sous-types afférents impliqués dans ce processus ainsi que sur la façon dont leurs propriétés stimulus-réponses peuvent changer au fil du temps ^1,2,3. Cependant....

Protocole

Toutes les expériences impliquant l’utilisation d’animaux dans la recherche ont été réalisées conformément aux normes mises de l’avant par les National Institutes of Health et l’Association internationale pour l’étude de la douleur et ont été approuvées par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université de Pittsburgh (protocole #22051100). À la fin de chaque expérience, les rats ont été euthanasiés par exanguination avec perfusion cardiaque de solution saline tamponnée au phosphate (PBS), une approche approuvée par l’American Veterinary Medical Association et l’IACUC de l’Université de Pittsburgh.

....

Discussion

Ici, nous démontrons un moyen rapide et non invasif de générer un rat GECI pour l’imagerie du TG. Nous avons choisi un promoteur CAG pour piloter et maintenir des niveaux élevés d’expression génique. Alors que des études antérieures suggèrent que d’autres sérotypes d’AAV peuvent influencer efficacement l’expression des gènes dans les neurones DRG³⁹, nos résultats sont cohérents avec une étude récente impliquant l’injection intrapéritonéale d’AAV chez les nouveau-nés.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40	Addgene	100844-AAV9	AAV9-GCaMP6s virus
ACEpromazine maleate	Covetrus	11695-0095-5	10 mg/mL
AnaSed (Xylazine) injection	AKORN Animal Health	23076-35-9	20 mg/mL
CTR5500 Electronics box	Leica	11 888 820	Power Supply
Cutwell burr drill bit	Ransom & Randolph		¼ round
DM 6000 FS	Leica	11 888 928	Base Stand
EL6000	Leica	EL6000	Light source with 120 W mercury bulb
Forceps	FST	11252-00	Dumont No. 05
Friedman rongeurs	FST	16000-14	2.5 mm cup size
Friedman-Pearson rongeurs	FST	16021-14	1 mm cup size
Heating pad (Temperature therapy pad)	STRYKER	8002-062-022
Ketamine hydrochloride	Covetrus	1695-0703-1	100 mg/mL
Plan Fluor 20x/0.40	Leica	MRH00105	20x objective, 0.4 NA10.8 mm WD
Power handle high-temp cautery pen	Bovie	HIT1	handheld Change-A-Tip cautery pen
Prime 95B	Photometrics	Prime 95B	CMOS Camera
Saline	Fisher Scientific	NC0291799	0.9% Sterile Saline
Scalpel blade	Fisher Scientific	22-079-701	size 15 disposable blade
Spatula	BRI	48-1460	brain spatula
Spring scissors	FST	91500-09	Student Vannas, 5 mm cutting edge
Spring scissors	FST	15012-12	Noyes, 14 mm cutting edge
STP6000 Smart touch panel	Leica	11 501 255	Control Panel
Syringe	Hamilton	80201	25 μL Model 1702 Luer Tip syringe
Water heater	Adroit	HTP-1500