In-Vivo Imagerie calcique des neurones sensoriels dans le ganglion trijumeau du rat

Résumé

Les indicateurs calciques codés génétiquement (GECI) permettent une analyse robuste de la signalisation des neurones sensoriels à l’échelle de la population. Ici, nous avons développé une nouvelle approche qui permet de visualiser in vivo l’activité des neurones des ganglions trijumeaux chez le rat.

Résumé

Les indicateurs calciques génétiquement codés (GECI) permettent aux techniques d’imagerie de surveiller les changements dans le calcium intracellulaire dans des populations cellulaires ciblées. Leur rapport signal/bruit élevé fait des GECI un outil puissant pour détecter l’activité évoquée par un stimulus dans les neurones sensoriels. Les GECI facilitent l’analyse au niveau de la population de l’encodage des stimuli avec le nombre de neurones pouvant être étudiés simultanément. Cet encodage de population est le plus approprié in vivo. Les ganglions de la racine dorsale (DRG), qui abritent le soma des neurones sensoriels innervant les structures somatiques et viscérales sous le cou, sont les plus largement utilisés pour l’imagerie in vivo car ces structures sont relativement faciles d’accès. Plus récemment, cette technique a été utilisée chez la souris pour étudier les neurones sensoriels du ganglion trijumeau (TG) qui innervent les structures buccales et craniofaciales. Il existe de nombreuses raisons d’étudier la TG en plus de la DRG, y compris la longue liste de syndromes douloureux spécifiques aux structures buccales et craniofaciales qui semblent refléter des changements dans l’activité des neurones sensoriels, tels que la névralgie du trijumeau. Les souris sont les plus utilisées dans l’étude des neurones DRG et TG en raison de la disponibilité d’outils génétiques. Cependant, avec des différences de taille, de facilité de manipulation et des différences d’espèces potentiellement importantes, il y a des raisons d’étudier les neurones TG du rat plutôt que de la souris. Ainsi, nous avons développé une approche pour l’imagerie des neurones TG de rat in vivo. Nous avons injecté des chiots nouveau-nés (p2) par voie intrapéritonéale avec un AAV codant pour GCaMP6s, ce qui a entraîné une infection de >90% des neurones TG et DRG. La TG a été visualisée chez l’adulte après craniotomie et décortication, et les changements dans la fluorescence de GCaMP6s ont été surveillés dans les neurones TG après stimulation des régions mandibulaires et maxillaires du visage. Nous avons confirmé que les augmentations de fluorescence étaient provoquées par un stimulus avec un bloc nerveux périphérique. Bien que cette approche ait de nombreuses utilisations potentielles, nous l’utilisons pour caractériser la ou les sous-populations de neurones TG modifiées à la suite d’une lésion des nerfs périphériques.

Introduction

La somatosensation, c’est-à-dire l’encodage neuronal des stimuli mécaniques, thermiques et chimiques qui affectent la peau ou d’autres structures corporelles, y compris les muscles, les os et les viscères, commence par l’activité des neurones afférents primaires qui innervent^{ces structures.} Les approches électrophysiologiques basées sur une seule unité ont fourni une mine d’informations sur les sous-types afférents impliqués dans ce processus ainsi que sur la façon dont leurs propriétés stimulus-réponses peuvent changer au fil du temps ^1,2,3. Cependant, bien qu’il reste des preuves solides à l’appui de la théorie des lignes marquées, qui suggère que des modalités sensorielles spécifiques sont véhiculées par une ou plusieurs sous-populations spécifiques de neurones, la capacité de nombreuses sous-populations de neurones à répondre aux mêmes types de stimuli mécaniques, thermiques et chimiques suggère que la majorité des stimuli somatosensoriels sont codés par plusieurs sous-populations de neurones^{4, 5}. Le Ainsi, une meilleure compréhension de la somatosensation ne viendra qu’avec la capacité d’étudier l’activité de 10, voire de centaines, de neurones simultanément.

Les progrès des approches optiques avec l’avènement relativement récent des techniques d’imagerie confocale et, par la suite, multiphotonique et numérique ont facilité la capacité d’effectuer des analyses relativement non invasives de l’activité neuronale à l’échelle de la population ^6,7. L’un des derniers obstacles à l’application de cette technologie a été le développement d’outils permettant l’évaluation optique de l’activité neuronale. Compte tenu de la vitesse d’un potentiel d’action qui peut commencer et se terminer en moins d’une milliseconde, un colorant sensible à la tension ayant la capacité de suivre les changements de potentiel membranaire à la vitesse d’un potentiel d’action serait l’outil idéal à cet effet. Mais bien qu’il y ait eu d’énormes progrès dans ce domaine 7,8,9,10, le rapport signal/bruit pour beaucoup de ces colorants n’est pas encore assez élevé pour permettre une analyse de population de centaines de neurones au niveau d’une seule cellule. Comme approche alternative, les chercheurs se sont tournés vers la surveillance des changements dans la concentration intracellulaire de Ca²⁺ ([Ca²⁺]_i). Les limites de cette stratégie sont claires dès le départ et comprennent le fait qu’une augmentation de [Ca²⁺]_i est une mesure indirecte de l’activité neuronale¹¹ ; qu’une augmentation de [Ca²⁺]_i peut se produire indépendamment de l’afflux de Ca²⁺ associé à l’activation des canaux Ca²⁺ voltage-dépendants (VGCC)^12,13 ; que l’amplitude et la durée d’un transitoire de Ca²⁺ peuvent être contrôlées par des processus indépendants de l’activité du VGCC 11,12,14 ; et que l’évolution temporelle des transitoires Ca²⁺ dépasse de loin celle d’un potentiel d’action¹⁵. Néanmoins, il existe un certain nombre d’avantages significatifs associés à l’utilisation du Ca²⁺ comme mesure indirecte de l’activité neuronale. Le rapport signal/bruit associé à la plupart des indicateurs de Ca²⁺ n’est pas le moindre, reflétant à la fois l’ampleur du changement de Ca²⁺ intracellulaire et le fait que le signal provient de l’espace tridimensionnel du cytosol plutôt que de l’espace bidimensionnel de la membrane cellulaire. De plus, avec le développement d’indicateurs de Ca²⁺ codés génétiquement (GECI), il est possible de tirer parti de stratégies génétiques pour stimuler l’expression des indicateurs de Ca²⁺ dans des sous-populations spécifiques de cellules, facilitant ainsi les analyses au niveau de la population dans des préparations intactes (voir par exemple, voir¹⁶).

Compte tenu du nombre d’outils génétiques maintenant disponibles chez la souris, il n’est pas surprenant que les GECI aient été les plus largement utilisés chez cette espèce. Des lignées de souris avec une expression constitutive de GECI dans des sous-populations de neurones sensoriels ont été développées ^7,16,17. Avec le développement de lignées de souris exprimant des recombinases dans des types cellulaires spécifiques, il est possible d’utiliser des stratégies encore plus sophistiquées pour contrôler l’expression de GECI¹⁵. Cependant, bien que ces outils soient de plus en plus puissants, il existe un certain nombre de raisons pour lesquelles d’autres espèces, telles que les rats, pourraient être plus appropriées pour certaines questions expérimentales. Il s’agit notamment de la plus grande taille, facilitant un certain nombre de manipulations expérimentales qui sont difficiles, voire impossibles, chez la souris plus petite ; la facilité d’entraîner les rats à des tâches comportementales relativement complexes ; et au moins quelques preuves que les propriétés biophysiques et les modèles d’expression de plusieurs canaux ioniques dans les neurones sensoriels du rat peuvent être plus similaires à ceux observés dans les neurones sensoriels humains que ne le sont les mêmes canaux chez la souris par rapport à l’homme¹⁸.

Alors que la transduction des stimuli somatosensoriels se produit généralement dans les terminaisons périphériques des afférences primaires, le potentiel d’action initié à la périphérie doit passer à travers la structure qui abrite les somates afférents primaires, appelés ganglions de la racine dorsale (DRG) ou du trijumeau (TG) avant d’atteindre le système nerveux central¹⁹. Bien qu’il existe des preuves que tous les potentiels d’action se propageant le long d’un axone afférent primaire n’envahiront pas le corps cellulaire²⁰, conséquence du fait que les somata afférents primaires sont connectés à l’axone afférent principal via une jonction en T¹⁹, la majorité des potentiels d’action initiés à la périphérie semblent envahir le soma²¹. Cela confère trois avantages expérimentaux lors de l’utilisation de GECI pour évaluer le codage de population dans les afférences primaires : la grande taille du corps cellulaire par rapport aux axones augmente encore le rapport signal/bruit lors de l’utilisation de [Ca²⁺]_i comme mesure indirecte de l’activité afférente ; les DRG sont généralement faciles d’accès ; et l’évaluation de l’activité sur un site éloigné dans l’espace des terminaisons afférentes minimise l’impact potentiel de la chirurgie nécessaire pour exposer les ganglions sur les propriétés stimulus-réponse des terminaisons afférentes. Cependant, comme les TG sont situés sous le cerveau (ou au-dessus de la palette), ils sont beaucoup plus difficiles d’accès que les DRG. De plus, bien qu’il existe de nombreuses similitudes entre les neurones DRG et TG, il existe également une liste croissante de différences. Cela inclut l’organisation grossièrement somatotopique des neurones dans le TG²², des structures uniques innervées, différents modèles de terminaison terminale centrale 23,24,25,26, et maintenant une liste croissante de différences dans l’expression des gènes^27,28 et l’expression des récepteurs fonctionnels²⁹. De plus, parce que nous nous intéressons à l’identification des mécanismes périphériques de la douleur, le nombre relativement élevé de syndromes douloureux qui semblent être uniques au système trijumeau (par exemple, migraine, névralgie du trijumeau, syndrome de la bouche brûlante) qui semblent impliquer une activité aberrante dans les afférences primaires 30,31,32, suggère que le TG doit être étudié directement.

Ainsi, bien que les propriétés stimulus-réponse des neurones TG aient été étudiées avec des GECI chez la souris¹⁶, parce que les raisons énumérées ci-dessus suggèrent que le rat pourrait être une espèce plus appropriée pour répondre à une variété de questions expérimentales, le but de la présente étude était de développer une approche pour utiliser les GECI pour étudier les neurones TG chez le rat. Pour y parvenir, nous avons utilisé une approche virale pour piloter l’expression des GECI GCaMP6 dans le système nerveux périphérique. Nous avons ensuite retiré le cerveau antérieur pour permettre l’accès au TG. Enfin, des stimuli mécaniques et thermiques ont été appliqués au visage tandis que les réponses neuronales ont été évaluées par microscopie à fluorescence. Ensemble, ces données soutiennent un rôle dans l’utilisation du rat pour étudier les changements dans le TG dans de nombreux États, élargissant ainsi la boîte à outils pour les chercheurs intéressés par le codage sensoriel dans le système trijumeau.

Protocole

Toutes les expériences impliquant l’utilisation d’animaux dans la recherche ont été réalisées conformément aux normes mises de l’avant par les National Institutes of Health et l’Association internationale pour l’étude de la douleur et ont été approuvées par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université de Pittsburgh (protocole #22051100). À la fin de chaque expérience, les rats ont été euthanasiés par exanguination avec perfusion cardiaque de solution saline tamponnée au phosphate (PBS), une approche approuvée par l’American Veterinary Medical Association et l’IACUC de l’Université de Pittsburgh.

1. Initiation au GCaMP

1. Commandez des rats Sprague Dawley gestants afin que les chiots puissent être injectés au moment approprié après la naissance.
2. Vaporisez les gants avec 70 % d’EtOH avant de manipuler chaque rateau. Cela dissuadera la mère de cannibaliser les jeunes.
3. Écouvillonner les ratons (P1-2) avec 70% d’EtOH et anesthésier sur de la glace pendant 3 min.
4. Injecter 15 μL d’AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40 (Addgene) par voie intrapéritonéale à l’aide d’une seringue Hamilton stérile et étanche au gaz de 25 μL.

2. Chirurgie d’exposition du ganglion du trijumeau

1. Administrer un cocktail anesthésique (55 mg/kg de kétamine, 5,5 mg/kg de xylazine, 1 mg/kg d’acépromazine) par voie intrapéritonéale en fonction du poids corporel à des rats âgés de 6 à 8 semaines (environ 150 à 200 g).
   REMARQUE : Ceci est généralement suffisant pour maintenir un plan chirurgical d’anesthésie, tel qu’évalué par l’absence d’un réflexe de retrait au pincement nocif d’une patte arrière. Cependant, complétez avec de l’isoflurane via un cône nasal si les animaux deviennent légers.
2. Une fois complètement anesthésié, rasez les cheveux et les moustaches de la tête et du visage.
3. Montez le rat sur un cadre stéréotaxique avec des barres auriculaires et placez un coussin chauffant (~37 ^oC) en dessous pour maintenir la température corporelle.
4. Surveillez les signes vitaux (fréquence cardiaque, fréquence respiratoire, saturation en oxygène du sang) à l’aide d’un oxymètre de souris ou d’un appareil comparable.
   REMARQUE : La température corporelle est surveillée par une sonde rectale et maintenue en plaçant les rats sur une couverture d’eau à circulation contrôlée par rétroaction.
5. Placez de la gaze trempée dans une solution saline glacée sur la tête pour resserrer les vaisseaux sanguins afin de minimiser les saignements. À l’aide d’un scalpel de taille 15, faites une incision médiane de la peau et du muscle sur le crâne.
6. Utilisez une dissection contondante de la peau et des muscles pour exposer le crâne.
7. À l’aide d’un foret rond 1/4, perforez soigneusement la calotte crânienne pour exposer le cerveau antérieur. Ensuite, utilisez des rongeurs (bonnet de 2,5 mm) pour couper soigneusement le crâne.
8. À l’aide d’un scalpel de taille 15, faites une incision dans le cerveau (Bregma : -3,80) et le bulbe olfactif.
   REMARQUE : Couper plus caudalement au-delà de ce point entraînera la mort du rat
9. À l’aide d’une spatule, déconnectez soigneusement la dure-mère du crâne et soulevez doucement le cerveau sectionné pour révéler le TG et la base du crâne.
   REMARQUE : L’utilisation supplémentaire d’une perfusion saline glacée tout au long de l’extraction minimisera les saignements et optimisera le champ de dissection suivant.
10. À l’aide d’un stylo de cautérisation, endiguer tout saignement résultant de l’extraction.
    REMARQUE : Couper la dure-mère entraînera un saignement inévitable. Il est préférable de préparer de l’aCSF glacé (119 mM NaCl, 26,2 mM NaHCO₃, 2,5 mM KCl, 1 mM NaH₂PO₄, 1,3 mM MgCl₂, 10 mM glucose, 2,5 mM CaCl₂) pour baigner la cavité crânienne afin d’aider à resserrer les vaisseaux sanguins tout en maintenant la santé neuronale.

3. Imagerie GCaMP6s

NOTE : Compte tenu de la taille et de la densité de ces neurones, le système d’imagerie et d’acquisition de données utilisé (objectif, microscope, source lumineuse, caméra) déterminera le nombre de cellules GECI⁺ visualisées. La source lumineuse, l’objectif et l’appareil photo détermineront également les paramètres utilisés pour l’acquisition de l’image, notamment le temps d’exposition et le taux de capture de l’image. Bien que les techniques multiphotoniques et confocales puissent être utilisées en fonction des paramètres de l’expérience, la microscopie à épifluorescence peut suffire à résoudre de nombreuses cellules. N’importe quel logiciel d’acquisition d’images peut être utilisé. Idéalement, l’application du stimulus est verrouillée dans le temps avec le logiciel d’acquisition d’images.

1. Placez la cavité crânienne sous l’objectif et faites la mise au point sur le TG à l’aide de la lumière visible.
2. La longueur d’onde d’excitation des GCaMP6 est de 496 nm et sa longueur d’onde d’émission est de 513 nm ; par conséquent, utilisez les cubes dichroïques et filtrants appropriés pour localiser les cellules GCaMP⁺ . Ajustez la mise au point pour localiser et résoudre la zone des ganglions dans laquelle les neurones répondent aux stimuli appliqués au champ récepteur d’intérêt.
3. Utilisez un objectif 10x pour permettre la visualisation de la plupart des neurones du TG répondant à des stimuli mécaniques appliqués à une région de 1 cm² du visage¹⁶. Utilisez un objectif sec 20x avec une longue distance de travail (10,8 mm) pour augmenter la résolution.
4. Utiliser un logiciel d’acquisition (p. ex., Metamorph) pour recueillir des données de fluorescence au fil du temps et en réponse à l’application d’un stimulus.
   1. Pour minimiser le photoblanchiment des neurones, utilisez un temps d’exposition aussi court que possible pour détecter les augmentations initiales et évoquées de la fluorescence. Avec l’objectif à air 20x, 0,40 NA, une source lumineuse aux halogénures de mercure de 120 W et une caméra CMOS (Complementary Metal-Oxide-Semiconductor) utilisée dans la présente étude, un temps d’exposition de 300 ms et un taux d’acquisition d’images de 3 Hz, obtenez des enregistrements de base stables pendant >90 min.
      NOTE : 1) Ces paramètres d’acquisition d’images doivent être déterminés empiriquement. 2) Des applications mécaniques (brosse, ponctuation, vibration, pincement), thermiques (chaleur et froid) et chimiques (capsaïcine, menthol, médiateurs inflammatoires) peuvent être appliquées sur le champ récepteur. Une approche subjective relativement peu coûteuse consiste à appliquer les stimuli à la main. Des approches plus objectives et reproductibles sont toutefois recommandées, lorsque des actionneurs contrôlés par rétroaction peuvent être utilisés pour une application répétée à une force connue. Bien que les dispositifs Peltier contrôlés par rétroaction soient utiles pour le chauffage et le refroidissement contrôlés, ils ne sont pas idéaux pour la stimulation thermique d’un visage incurvé. Les sources de lumière infrarouge contrôlées par rétroaction sont une alternative pour le chauffage, et la pulvérisation froide est une alternative moins qu’idéale pour le refroidissement.

Résultats

Comme nous avons déjà eu du succès avec le sérotype AAV9 pour l’infection des neurones sensoriels du rat¹⁵, nous avons utilisé ce sérotype pour l’expression des GCaMP6 dans les neurones TG du rat. Nous avons donc d’abord cherché à évaluer l’efficacité de l’infection des neurones sensoriels par AAV9-CAG-GCaMP6s-WPRE-SV40 (AAV9-GCaMP) lorsque ce virus a été administré à des ratons nouveau-nés²⁰. Ce virus utilise le promoteur CAG, qui entraîne et main...

Discussion

Ici, nous démontrons un moyen rapide et non invasif de générer un rat GECI pour l’imagerie du TG. Nous avons choisi un promoteur CAG pour piloter et maintenir des niveaux élevés d’expression génique. Alors que des études antérieures suggèrent que d’autres sérotypes d’AAV peuvent influencer efficacement l’expression des gènes dans les neurones DRG³⁹, nos résultats sont cohérents avec une étude récente impliquant l’injection intrapéritonéale d’AAV chez les nouveau-nés...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40	Addgene	100844-AAV9	AAV9-GCaMP6s virus
ACEpromazine maleate	Covetrus	11695-0095-5	10 mg/mL
AnaSed (Xylazine) injection	AKORN Animal Health	23076-35-9	20 mg/mL
CTR5500 Electronics box	Leica	11 888 820	Power Supply
Cutwell burr drill bit	Ransom & Randolph		¼ round
DM 6000 FS	Leica	11 888 928	Base Stand
EL6000	Leica	EL6000	Light source with 120 W mercury bulb
Forceps	FST	11252-00	Dumont No. 05
Friedman rongeurs	FST	16000-14	2.5 mm cup size
Friedman-Pearson rongeurs	FST	16021-14	1 mm cup size
Heating pad (Temperature therapy pad)	STRYKER	8002-062-022
Ketamine hydrochloride	Covetrus	1695-0703-1	100 mg/mL
Plan Fluor 20x/0.40	Leica	MRH00105	20x objective, 0.4 NA10.8 mm WD
Power handle high-temp cautery pen	Bovie	HIT1	handheld Change-A-Tip cautery pen
Prime 95B	Photometrics	Prime 95B	CMOS Camera
Saline	Fisher Scientific	NC0291799	0.9% Sterile Saline
Scalpel blade	Fisher Scientific	22-079-701	size 15 disposable blade
Spatula	BRI	48-1460	brain spatula
Spring scissors	FST	91500-09	Student Vannas, 5 mm cutting edge
Spring scissors	FST	15012-12	Noyes, 14 mm cutting edge
STP6000 Smart touch panel	Leica	11 501 255	Control Panel
Syringe	Hamilton	80201	25 μL Model 1702 Luer Tip syringe
Water heater	Adroit	HTP-1500