생체 내 쥐 삼차신경절(Rat Trigeminal Ganglion)의 감각 뉴런의 칼슘 이미징

요약

유전적으로 인코딩된 칼슘 지표(GECI)는 감각 뉴런 신호에 대한 강력한 집단 수준 분석을 가능하게 합니다. 여기에서 우리는 쥐의 삼차신경절 뉴런 활동의 생체 내 GECI 시각화를 가능하게 하는 새로운 접근 방식을 개발했습니다.

초록

유전자 인코딩 칼슘 지표(GECI)를 사용하면 이미징 기술을 통해 표적 세포 집단에서 세포 내 칼슘의 변화를 모니터링할 수 있습니다. 신호 대 잡음비가 크기 때문에 GECI는 감각 뉴런에서 자극 유발 활동을 감지하는 강력한 도구입니다. GECI는 동시에 연구할 수 있는 뉴런의 수로 자극 인코딩의 집단 수준 분석을 용이하게 합니다. 이 모집단 인코딩은 생체 내에서 가장 적절하게 수행됩니다. 목 아래의 체세포 및 내장 구조를 신경 자극하는 감각 뉴런의 소마를 수용하는 등근 신경절(DRG)은 이러한 구조에 비교적 쉽게 접근할 수 있기 때문에 생체 내 이미징에 가장 광범위하게 사용됩니다. 최근에는 생쥐를 대상으로 구강 및 두개안면 구조를 자극하는 삼차신경절(TG)의 감각 뉴런을 연구하는 데 사용되었습니다. 삼차신경통과 같은 감각 뉴런 활동의 변화를 반영하는 것으로 보이는 구강 및 두개안면 구조에 특이적인 통증 증후군의 긴 목록을 포함하여 DRG 외에도 TG를 연구해야 하는 많은 이유가 있습니다. 생쥐는 유전 도구의 가용성 때문에 DRG 및 TG 뉴런 연구에서 가장 광범위하게 사용됩니다. 그러나 크기의 차이, 취급의 용이성, 잠재적으로 중요한 종의 차이로 인해 쥐 TG 뉴런이 아닌 쥐를 연구해야 하는 이유가 있습니다. 따라서 우리는 생체 내에서 쥐 TG 뉴런을 이미징하는 접근 방식을 개발했습니다. 신생아 새끼(p2)에 GCaMP6를 인코딩하는 AAV를 복강내로 주입한 결과, TG 및 DRG 뉴런이 >90% 감염되었습니다. TG는 개두술 및 탈피술 후 성인에서 시각화되었으며, 얼굴의 하악 및 상악 부위를 자극한 후 TG 뉴런에서 GCaMP6s 형광의 변화를 모니터링했습니다. 형광의 증가는 말초 신경 차단에 의한 자극에 의한 것임을 확인했습니다. 이 접근법은 많은 잠재적 용도를 가지고 있지만, 우리는 말초 신경 손상 후 변화된 TG 뉴런의 하위 집단을 특성화하는 데 사용하고 있습니다.

서문

피부나 근육, 뼈, 내장을 포함한 다른 신체 구조에 영향을 미치는 기계적, 열적, 화학적 자극의 신경 인코딩인 체성 감각은 이러한 구조를 신경 자극하는 일차 구심성 뉴런의 활동으로 시작됩니다¹. 단일 단위 기반 전기 생리학적 접근법은 이 과정에 관련된 구심성 아형에 대한 풍부한 정보와 자극-반응 특성이 시간이 지남에 따라 어떻게 변할 수 있는지에 대한 풍부한 정보를 제공했습니다 ^1,2,3. 그러나, 특정 감각 양식이 뉴런의 특정 하위 집단(들)에 의해 전달된다는 것을 시사하는 표지된 선 이론을 지지하는 강력한 증거가 남아 있지만, 동일한 유형의 기계적, 열적, 화학적 자극에 반응하는 많은 뉴런 하위 집단의 능력은 체성 감각 자극의 대부분이 뉴런의 여러 하위 집단에 의해 암호화된다는 것을 시사한다^{4, 5}. 따라서 체성 감각에 대한 더 나은 이해는 수백 개는 아니더라도 10개의 뉴런의 활동을 동시에 연구할 수 있는 능력과 함께 이루어질 것입니다.

비교적 최근의 공초점 및 다광자 및 디지털 이미징 기술의 출현과 함께 광학 접근법의 발전은 신경 활동에 대한 상대적으로 비침습적인 인구 수준 분석을 수행할 수 있는 능력을 촉진했습니다 ^6,7. 이 기술 적용의 마지막 장애물 중 하나는 신경 활동의 광학적 평가를 가능하게 하는 도구의 개발이었습니다. 밀리초 이내에 시작하고 끝날 수 있는 활동 전위의 속도를 감안할 때, 활동 전위의 속도로 막 전위의 변화를 추적할 수 있는 전압에 민감한 염료가 이러한 목적에 이상적인 도구가 될 것입니다. 그러나 이 영역^7,8,9,10에서 엄청난 진전이 있었지만 이러한 염료 중 많은 부분에 대한 신호 대 잡음비는 여전히 단일 세포 수준에서 수백 개의 뉴런 집단 분석을 가능하게 할 만큼 충분히 높지 않습니다. 대안으로 연구자들은 세포 내 Ca²⁺ 농도([Ca²⁺]_i)의 변화를 모니터링하는 것으로 전환했습니다. 이 전략의 한계는 처음부터 분명했으며, [Ca²⁺]_i의 증가가 신경 활동의 간접적인 척도라는 사실을 포함한다¹¹; [Ca²⁺]_i의 증가는 전압 개폐 Ca²⁺ 채널(VGCC)의 활성화와 관련된 Ca²⁺ 유입과 독립적으로 발생할 수 있습니다.^12,13; Ca²⁺ 과도 현상의 크기 및 지속 시간은 VGCC 활성(11,12,14)과 무관한 프로세스에 의해 제어될 수 있습니다. 그리고 Ca²⁺ 과도 현상의 시간 경과는 활동 전위¹⁵의 시간 경과를 훨씬 초과합니다. 그럼에도 불구하고 신경 활동의 간접 측정으로 Ca²⁺를 사용하는 것과 관련된 여러 가지 중요한 이점이 있습니다. 이들 중 가장 중요한 것은 대부분의 Ca²⁺ 지표와 관련된 신호 대 잡음비로, 세포 내 Ca²⁺의 변화 크기와 신호가 세포막의 2차원 공간이 아닌 세포질의 3차원 공간에서 발생한다는 사실을 모두 반영합니다. 또한, 유전적으로 인코딩된 Ca²⁺ 지표(GECI)의 개발로 세포의 특정 하위 집단에서 Ca²⁺ 지표의 발현을 유도하는 유전 전략을 활용할 수 있으며, 온전한 제제에서 집단 수준 분석을 용이하게 할 수 있습니다(예:¹⁶ 참조).

현재 생쥐에서 사용할 수 있는 유전 도구의 수를 감안할 때 GECI가 이 종에서 가장 광범위하게 사용되었다는 것은 놀라운 일이 아닙니다. 감각 뉴런의 하위 집단에서 구성적 GECI 발현을 갖는 마우스 라인이 개발되었습니다 ^7,16,17. 특정 세포 유형에서 재조합 효소를 발현하는 마우스 라인의 개발로 GECI 발현을 제어하기 위해 훨씬 더 정교한 전략을 사용할 수 있습니다¹⁵. 그러나 이러한 도구가 그 어느 때보다 강력하지만 쥐와 같은 다른 종이 일부 실험 질문에 더 적합할 수 있는 여러 가지 이유가 있습니다. 여기에는 더 큰 크기가 포함되어있어 더 작은 마우스에서 불가능하지는 않더라도 어려운 여러 가지 실험적 조작을 용이하게합니다. 비교적 복잡한 행동 작업에서 쥐를 훈련시키는 용이성; 그리고 쥐의 감각 뉴런에서 여러 이온 채널의 생물물리학적 특성과 발현 패턴이 인간에 비해 마우스에서 동일한 채널보다 인간 감각 뉴런에서 관찰되는 것과 더 유사할 수 있다는 적어도 일부 증거가^{있다 18}.

체성 감각 자극의 전달은 일반적으로 일차 구심성의 말초 말단에서 발생하지만, 말초에서 시작된 활동 전위는 중추 신경계에 도달하기 전에 등쪽 뿌리(DRG) 또는 삼차신경절(TG)이라고 하는 일차 구심성 소마타를 수용하는 구조를 통과해야 한다¹⁹. 일차 구심성 축삭돌기를 따라 전파되는 모든 활동 전위가 세포체(²⁰)를 침범하는 것은 아니라는 증거가 있는 반면, 일차 구심성 소마타가 T-접합(¹⁹)을 통해 주 구심성 축삭돌기에 연결된다는 사실의 결과로서, 주변부에서 개시된 대부분의 활동 전위는 소마(²¹)를 침범하는 것으로 나타난다. 이것은 GECI를 사용하여 일차 구심성에서 집단 코딩을 평가할 때 세 가지 실험적 이점을 제공합니다 : 축삭에 비해 세포체의 크기가 크면 [Ca^{2 +}] _i를 구심성 활성의 간접 측정으로 사용할 때 신호 대 잡음이 더욱 증가합니다. DRG는 일반적으로 쉽게 액세스할 수 있습니다. 그리고 구심성 말단에서 공간적으로 멀리 떨어진 부위에서의 활동을 평가하면 신경절을 노출시키는 데 필요한 수술이 구심성 말단의 자극-반응 특성에 미치는 잠재적 영향을 최소화할 수 있습니다. 그러나 TG는 뇌 아래(또는 팔레트 위)에 위치하기 때문에 DRG보다 접근하기가 훨씬 더 어렵습니다. 또한 DRG와 TG 뉴런 사이에는 많은 유사점이 있지만 차이점도 점점 더 많아지고 있습니다. 여기에는 TG²²의 뉴런의 대략적인 체성 조직, 신경 분포된 독특한 구조, 상이한 중심 말단 종결 패턴(23,24,25,26), 그리고 이제 유전자 발현(^27,28)과 기능적 수용체 발현(²⁹)의 차이점이 증가하고 있다. 또한, 통증의 말초 기전을 규명하는 데 관심이 있기 때문에, 삼차계에 고유한 것으로 보이는 통증 증후군(예: 편두통, 삼차신경통, 구강 작열감 증후군)이 1차 구심성^30,31,32에서 비정상적인 활동을 수반하는 것으로 보이는 비교적 많은 수의 통증 증후군은 중성지방을 직접 연구할 필요가 있음을 시사한다.

따라서, 쥐¹⁶에서 TG 뉴런의 자극-반응 특성이 GECI로 연구되었지만, 위에 열거된 이유들은 쥐가 다양한 실험적 질문들을 다루기에 더 적합한 종일 수 있음을 시사하기 때문에, 본 연구의 목적은 쥐에서 TG 뉴런을 연구하기 위해 GECI를 사용하는 접근법을 개발하는 것이었다. 이를 달성하기 위해 바이러스 접근법을 활용하여 말초 신경계에서 GECI GCaMP6의 발현을 유도했습니다. 그런 다음 TG에 접근할 수 있도록 전뇌를 제거했습니다. 마지막으로, 기계적 및 열적 자극을 얼굴에 가하는 동안 형광 현미경으로 신경 반응을 평가했습니다. 이러한 데이터는 여러 상태에서 TG의 변화를 조사하기 위해 쥐를 활용하는 역할을 지원하며, 삼차계의 감각 코딩에 관심이 있는 연구자를 위한 툴킷을 확장합니다.

프로토콜

연구에 동물을 사용하는 것과 관련된 모든 실험은 미국 국립보건원(National Institutes of Health)과 국제 통증 연구 협회(International Association for the Study of Pain)가 제시한 기준에 따라 수행되었으며 피츠버그 대학교 기관 동물 관리 및 사용 위원회(프로토콜 #22051100)의 승인을 받았습니다. 각 실험이 끝날 때마다, 쥐는 미국 수의학 협회(American Veterinary Medical Association)와 피츠버그 대학 IACUC가 승인한 접근법인 얼음처럼 차가운 인산염 완충 식염수(PBS)의 심장 관류를 통한 출혈을 통해 안락사되었습니다.

1. GCaMP 유도

1. 임신 기간 동안 새끼가 출생 후 적절한 시간에 주사를 맞을 수 있도록 Sprague Dawley 쥐를 주문하십시오.
2. 각 새끼 쥐를 다루기 전에 장갑에 70% EtOH를 뿌립니다. 이것은 댐이 새끼를 잡아먹는 것을 막을 것입니다.
3. 새끼 쥐(P1-2)에 70% EtOH를 면봉으로 닦고 얼음 위에서 3분 동안 마취합니다.
4. 25μL 멸균 기밀 Hamilton 주사기를 사용하여 15μL의 AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40(Addgene)을 복강내로 주입합니다.

2. 삼차신경절 노출 수술

1. 6-8주 된 쥐(약 150-200g)에게 체중에 따라 마취 칵테일(케타민 55mg/kg, 자일라진 5.5mg/kg, 아세프로마진 1mg/kg)을 복강내로 투여합니다.
   참고: 이것은 일반적으로 뒷발의 유독한 꼬집음에 대한 금단 반사의 부재로 평가되는 수술 마취면을 유지하기에 충분합니다. 그러나 동물이 가벼워지면 코뿔을 통해 이소플루란을 보충하십시오.
2. 완전히 마취되면 머리와 얼굴의 머리카락과 수염을 면도합니다.
3. 이어 바가 있는 입체 프레임에 쥐를 장착하고 체온을 유지하기 위해 아래에 가열 패드(~37 ^oC)를 놓습니다.
4. 생체 신호(심박수, 호흡수, 혈중 산소 포화도)를 마우스 산소 농도계 또는 이와 유사한 것으로 모니터링합니다.
   알림: 체온은 직장 프로브로 모니터링되며 피드백 제어 순환 물 담요에 쥐를 올려 놓아 유지됩니다.
5. 얼음처럼 차가운 식염수에 적신 거즈를 머리에 대고 혈관을 수축시켜 출혈을 최소화합니다. 크기 15 메스를 사용하여 두개골 위의 피부와 근육을 정중선으로 절개합니다.
6. 두개골을 노출시키기 위해 피부와 근육을 둔하게 해부합니다.
7. 1/4 원형 드릴 비트를 사용하여 두개골 캡을 조심스럽게 천공하여 전뇌를 노출시킵니다. 그런 다음 롱거(2.5mm 컵)를 사용하여 두개골을 조심스럽게 자릅니다.
8. 크기 15 메스를 사용하여 뇌(브레그마: -3.80)와 후각구를 절개합니다.
   알림: 이 지점을 지나 꼬리 방향으로 더 많이 자르면 쥐가 죽습니다
9. 주걱을 사용하여 두개골에서 경막을 조심스럽게 분리하고 절단된 뇌를 부드럽게 들어 올려 TG와 두개골 기저부를 드러냅니다.
   알림: 추출 전반에 걸쳐 얼음처럼 차가운 식염수 관류를 추가로 사용하면 출혈을 최소화하고 다음 해부 필드를 최적화할 수 있습니다.
10. 소작 펜을 사용하여 발치로 인한 출혈을 막습니다.
    알림: 경막을 자르면 피할 수 없는 출혈이 발생합니다. 얼음처럼 차가운 aCSF(119mM NaCl, 26.2mM NaHCO3, 2.5mM KCl, 1mM_NaH2PO4, 1.3mM _MgCl2, 10mM 포도당, 2.5mM_CaCl2)를 준비하여 두개강을 목욕시켜 신경 건강을 유지하면서 혈관을 수축시키는 것이 가장 좋습니다.

3. GCaMP6s 이미징

참고: 이러한 뉴런의 크기와 밀도를 감안할 때 사용된 이미징 및 데이터 수집 시스템(대물렌즈, 현미경, 광원, 카메라)에 따라 시각화된 GECI⁺ 세포의 수가 결정됩니다. 광원, 대물렌즈 및 카메라는 노출 시간 및 이미지 캡처 속도를 포함하여 이미지 획득에 사용되는 매개변수도 결정합니다. 실험의 매개변수에 따라 다광자 및 공초점 기술을 사용할 수 있지만 에피형광 현미경은 많은 세포를 분해하는 데 충분할 수 있습니다. 모든 이미지 수집 패키지를 사용할 수 있습니다. 이상적으로, 자극 어플리케이션은 이미지 획득 소프트웨어 패키지로 시간 고정됩니다.

1. 대물렌즈 아래에 두개골을 놓고 가시광선을 사용하여 TG에 초점을 맞춥니다.
2. GCaMP6s의 여기 파장은 496nm이고 방출 파장은 513nm입니다. 따라서 적절한 이색성 및 필터 큐브를 사용하여 GCaMP⁺ 세포를 찾습니다. 초점을 조정하여 뉴런이 관심 수용 영역에 적용된 자극에 반응하는 신경절 영역을 찾고 해결합니다.
3. 10x 대물렌즈를 사용하여 얼굴¹⁶의 1cm² 영역에 가해진 기계적 자극에 반응하는 TG의 대부분의 뉴런을 시각화할 수 있습니다. 작동 거리(10.8mm)가 긴 20x 건식 대물렌즈를 사용하여 해상도를 높이십시오.
4. 수집 소프트웨어(예: Metamorph)를 사용하여 시간 경과에 따른 형광 데이터를 수집하고 자극 적용에 대응합니다.
   1. 뉴런의 광표백을 최소화하려면 가능한 한 짧은 노출 시간을 사용하여 형광의 기준선 및 유발 증가를 감지합니다. 본 연구에 사용된 20x, 0.40NA 에어 대물렌즈, 120W 할로겐화 수은 광원 및 CMOS(Complementary Metal-Oxide-Semiconductor) 카메라를 사용하여 300ms의 노출 시간과 3Hz의 이미지 획득 속도로 >90분 동안 안정적인 베이스라인 레코딩을 얻을 수 있습니다.
      참고: 1) 이러한 이미지 획득 매개변수는 경험적으로 결정되어야 합니다. 2) 수용장에 기계적(브러시, 천점, 진동, 핀치), 열적(열, 냉기), 화학물질(캡사이신, 멘톨, 염증 매개체)을 적용할 수 있다. 비교적 저렴한 주관적 접근 방식은 손으로 자극을 적용하는 것입니다. 그러나 보다 객관적이고 재현 가능한 접근 방식이 권장되며, 피드백 제어 액추에이터는 알려진 힘에서 반복적으로 적용할 수 있습니다. 피드백 제어 펠티에 장치는 가열 및 냉각 제어에 유용하지만 곡선면의 열 자극에는 적합하지 않습니다. 피드백 제어 적외선 광원은 가열을 위한 대안이며 콜드 스프레이는 냉각을 위한 이상적인 대안이 아닙니다.

결과

이전에 쥐 감각 뉴런¹⁵의 감염에 대한 AAV9 혈청형에 대한 성공을 거두었기 때문에, 우리는 쥐 TG 뉴런에서 GCaMP6의 발현에 이 혈청형을 사용했다. 따라서 우리는 먼저 AAV9-CAG-GCaMP6s-WPRE-SV40 (AAV9-GCaMP)을 신생아 쥐 새끼에게 투여했을 때 감각 뉴런 감염 효율을 평가하고자 했다²⁰. 이 바이러스는 높은 수준의 유전자 발현을 유도하고 유지하는 CAG promoter를 이용합니다. ?...

토론

여기에서는 TG를 이미징하기 위해 GECI 쥐를 생성하는 빠르고 비침습적인 방법을 보여줍니다. 우리는 높은 수준의 유전자 발현을 유도하고 유지하기 위해 CAG 프로모터를 선택했습니다. 이전 연구들은 다른 AAV 혈청형이 DRG 뉴런에서 유전자 발현을 효율적으로 유도할 수 있음을 시사하지만³⁹, 우리의 결과는 AAV9 혈청형이 쥐의 신생아 감각 뉴런의 감염에 매우 효율적임을 나타내는 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40	Addgene	100844-AAV9	AAV9-GCaMP6s virus
ACEpromazine maleate	Covetrus	11695-0095-5	10 mg/mL
AnaSed (Xylazine) injection	AKORN Animal Health	23076-35-9	20 mg/mL
CTR5500 Electronics box	Leica	11 888 820	Power Supply
Cutwell burr drill bit	Ransom & Randolph		¼ round
DM 6000 FS	Leica	11 888 928	Base Stand
EL6000	Leica	EL6000	Light source with 120 W mercury bulb
Forceps	FST	11252-00	Dumont No. 05
Friedman rongeurs	FST	16000-14	2.5 mm cup size
Friedman-Pearson rongeurs	FST	16021-14	1 mm cup size
Heating pad (Temperature therapy pad)	STRYKER	8002-062-022
Ketamine hydrochloride	Covetrus	1695-0703-1	100 mg/mL
Plan Fluor 20x/0.40	Leica	MRH00105	20x objective, 0.4 NA10.8 mm WD
Power handle high-temp cautery pen	Bovie	HIT1	handheld Change-A-Tip cautery pen
Prime 95B	Photometrics	Prime 95B	CMOS Camera
Saline	Fisher Scientific	NC0291799	0.9% Sterile Saline
Scalpel blade	Fisher Scientific	22-079-701	size 15 disposable blade
Spatula	BRI	48-1460	brain spatula
Spring scissors	FST	91500-09	Student Vannas, 5 mm cutting edge
Spring scissors	FST	15012-12	Noyes, 14 mm cutting edge
STP6000 Smart touch panel	Leica	11 501 255	Control Panel
Syringe	Hamilton	80201	25 μL Model 1702 Luer Tip syringe
Water heater	Adroit	HTP-1500