Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Los indicadores de calcio codificados genéticamente (GECI, por sus siglas en inglés) permiten un análisis robusto a nivel poblacional de la señalización de las neuronas sensoriales. Aquí, hemos desarrollado un enfoque novedoso que permite la visualización in vivo de GECI de la actividad de las neuronas de los ganglios trigéminos de rata.
Los indicadores de calcio codificados genéticamente (GECI, por sus siglas en inglés) permiten que las técnicas de imagen monitoricen los cambios en el calcio intracelular en las poblaciones celulares objetivo. Su gran relación señal-ruido hace que los GECI sean una poderosa herramienta para detectar la actividad evocada por estímulos en las neuronas sensoriales. Los GECI facilitan el análisis a nivel poblacional de la codificación de estímulos con el número de neuronas que se pueden estudiar simultáneamente. Esta codificación poblacional se realiza de forma más apropiada in vivo. Los ganglios de la raíz dorsal (DRG), que albergan el soma de las neuronas sensoriales que inervan las estructuras somáticas y viscerales debajo del cuello, se utilizan más ampliamente para la obtención de imágenes in vivo porque se accede a estas estructuras con relativa facilidad. Más recientemente, esta técnica se utilizó en ratones para estudiar las neuronas sensoriales del ganglio trigémino (TG) que inervan las estructuras orales y craneofaciales. Hay muchas razones para estudiar la TG además de la GRD, incluida la larga lista de síndromes de dolor específicos de las estructuras orales y craneofaciales que parecen reflejar cambios en la actividad de las neuronas sensoriales, como la neuralgia del trigémino. Los ratones se utilizan más ampliamente en el estudio de las neuronas DRG y TG debido a la disponibilidad de herramientas genéticas. Sin embargo, con las diferencias en el tamaño, la facilidad de manejo y las diferencias de especies potencialmente importantes, hay razones para estudiar neuronas TG de rata en lugar de ratón. Por lo tanto, desarrollamos un enfoque para obtener imágenes de neuronas TG de rata in vivo. Inyectamos crías neonatales (p2) por vía intraperitoneal con un AAV que codifica GCaMP6s, lo que resultó en una infección del >90% de las neuronas TG y DRG. La TG se visualizó en el adulto después de la craneotomía y la decorticación, y los cambios en la fluorescencia de GCaMP6s se monitorizaron en las neuronas TG después de la estimulación de las regiones mandibular y maxilar de la cara. Confirmamos que los aumentos de fluorescencia fueron evocados por estímulos con el bloqueo de nervios periféricos. Si bien este enfoque tiene muchos usos potenciales, lo estamos utilizando para caracterizar la(s) subpoblación(es) de neuronas TG cambiadas después de una lesión de los nervios periféricos.
La somatosensación, la codificación neuronal de estímulos mecánicos, térmicos y químicos que inciden en la piel u otras estructuras corporales, incluidos los músculos, los huesos y las vísceras, comienza con la actividad de las neuronas aferentes primarias que inervanestas estructuras. Los enfoques electrofisiológicos basados en una sola unidad han proporcionado una gran cantidad de información sobre los subtipos aferentes involucrados en este proceso, así como sobre cómo sus propiedades de estímulo-respuesta pueden cambiar con el tiempo 1,2,3. Sin emb....
Todos los experimentos que involucraron el uso de animales en investigación se realizaron de acuerdo con los estándares establecidos por los Institutos Nacionales de Salud y la Asociación Internacional para el Estudio del Dolor y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Pittsburgh (protocolo # 22051100). Al final de cada experimento, las ratas fueron sacrificadas a través de la exanguinación con perfusión cardíaca de solución salina tamponada con fosfato helado (PBS), un enfoque aprobado por la Asociación Americana de Medicina Veterinaria y la Universidad de Pittsburgh IACUC.
1. In....
Debido a que anteriormente hemos tenido éxito con el serotipo AAV9 para la infección de neuronas sensoriales de rata15, utilizamos este serotipo para la expresión de GCaMP6s en neuronas TG de rata. Por lo tanto, primero buscamos evaluar la eficiencia de la infección neuronal sensorial de AAV9-CAG-GCaMP6s-WPRE-SV40 (AAV9-GCaMP) cuando este virus se administró a crías de ratas neonatas20. Este virus utiliza el promotor CAG, que impulsa y mantiene altos niveles de expres.......
Aquí, demostramos una forma rápida y no invasiva de generar una rata GECI para obtener imágenes del TG. Elegimos un promotor CAG para impulsar y mantener altos niveles de expresión génica. Si bien estudios previos sugieren que otros serotipos de AAV pueden impulsar eficientemente la expresión génica en las neuronas DRG39, nuestros resultados son consistentes con un estudio reciente que involucra la inyección intraperitoneal de AAV en neonatos32, lo que indica que el.......
El Dr. Gold recibió una beca de Grünenthal durante el desarrollo de esta preparación. No hubo superposición entre el enfoque del estudio de Grünenthal y la preparación descrita en este manuscrito. Ninguno de los otros autores tiene ningún otro conflicto de intereses potencial que revelar.
Nos gustaría agradecer a los doctores Kathy Albers y Brian Davis por el uso de su microscopio Leica y su programa Metamorph, a Charles Warwick por ayudar a construir nuestro dispositivo térmico Peltier y al Dr. Raymond Sekula por ayudar a solucionar problemas de preparación quirúrgica. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud: F31NS125993 (JYG), T32NS073548 (JYG) y R01NS122784 (MSG y RS).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40 | Addgene | 100844-AAV9 | AAV9-GCaMP6s virus |
ACEpromazine maleate | Covetrus | 11695-0095-5 | 10 mg/mL |
AnaSed (Xylazine) injection | AKORN Animal Health | 23076-35-9 | 20 mg/mL |
CTR5500 Electronics box | Leica | 11 888 820 | Power Supply |
Cutwell burr drill bit | Ransom & Randolph | ¼ round | |
DM 6000 FS | Leica | 11 888 928 | Base Stand |
EL6000 | Leica | EL6000 | Light source with 120 W mercury bulb |
Forceps | FST | 11252-00 | Dumont No. 05 |
Friedman rongeurs | FST | 16000-14 | 2.5 mm cup size |
Friedman-Pearson rongeurs | FST | 16021-14 | 1 mm cup size |
Heating pad (Temperature therapy pad) | STRYKER | 8002-062-022 | |
Ketamine hydrochloride | Covetrus | 1695-0703-1 | 100 mg/mL |
Plan Fluor 20x/0.40 | Leica | MRH00105 | 20x objective, 0.4 NA10.8 mm WD |
Power handle high-temp cautery pen | Bovie | HIT1 | handheld Change-A-Tip cautery pen |
Prime 95B | Photometrics | Prime 95B | CMOS Camera |
Saline | Fisher Scientific | NC0291799 | 0.9% Sterile Saline |
Scalpel blade | Fisher Scientific | 22-079-701 | size 15 disposable blade |
Spatula | BRI | 48-1460 | brain spatula |
Spring scissors | FST | 91500-09 | Student Vannas, 5 mm cutting edge |
Spring scissors | FST | 15012-12 | Noyes, 14 mm cutting edge |
STP6000 Smart touch panel | Leica | 11 501 255 | Control Panel |
Syringe | Hamilton | 80201 | 25 μL Model 1702 Luer Tip syringe |
Water heater | Adroit | HTP-1500 |
Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este JoVE artículos
Solicitar permisoExplorar más artículos
This article has been published
Video Coming Soon
ACERCA DE JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados