En vivo Imágenes de calcio de las neuronas sensoriales en el ganglio trigémino de la rata

Resumen

Los indicadores de calcio codificados genéticamente (GECI, por sus siglas en inglés) permiten un análisis robusto a nivel poblacional de la señalización de las neuronas sensoriales. Aquí, hemos desarrollado un enfoque novedoso que permite la visualización in vivo de GECI de la actividad de las neuronas de los ganglios trigéminos de rata.

Resumen

Los indicadores de calcio codificados genéticamente (GECI, por sus siglas en inglés) permiten que las técnicas de imagen monitoricen los cambios en el calcio intracelular en las poblaciones celulares objetivo. Su gran relación señal-ruido hace que los GECI sean una poderosa herramienta para detectar la actividad evocada por estímulos en las neuronas sensoriales. Los GECI facilitan el análisis a nivel poblacional de la codificación de estímulos con el número de neuronas que se pueden estudiar simultáneamente. Esta codificación poblacional se realiza de forma más apropiada in vivo. Los ganglios de la raíz dorsal (DRG), que albergan el soma de las neuronas sensoriales que inervan las estructuras somáticas y viscerales debajo del cuello, se utilizan más ampliamente para la obtención de imágenes in vivo porque se accede a estas estructuras con relativa facilidad. Más recientemente, esta técnica se utilizó en ratones para estudiar las neuronas sensoriales del ganglio trigémino (TG) que inervan las estructuras orales y craneofaciales. Hay muchas razones para estudiar la TG además de la GRD, incluida la larga lista de síndromes de dolor específicos de las estructuras orales y craneofaciales que parecen reflejar cambios en la actividad de las neuronas sensoriales, como la neuralgia del trigémino. Los ratones se utilizan más ampliamente en el estudio de las neuronas DRG y TG debido a la disponibilidad de herramientas genéticas. Sin embargo, con las diferencias en el tamaño, la facilidad de manejo y las diferencias de especies potencialmente importantes, hay razones para estudiar neuronas TG de rata en lugar de ratón. Por lo tanto, desarrollamos un enfoque para obtener imágenes de neuronas TG de rata in vivo. Inyectamos crías neonatales (p2) por vía intraperitoneal con un AAV que codifica GCaMP6s, lo que resultó en una infección del >90% de las neuronas TG y DRG. La TG se visualizó en el adulto después de la craneotomía y la decorticación, y los cambios en la fluorescencia de GCaMP6s se monitorizaron en las neuronas TG después de la estimulación de las regiones mandibular y maxilar de la cara. Confirmamos que los aumentos de fluorescencia fueron evocados por estímulos con el bloqueo de nervios periféricos. Si bien este enfoque tiene muchos usos potenciales, lo estamos utilizando para caracterizar la(s) subpoblación(es) de neuronas TG cambiadas después de una lesión de los nervios periféricos.

Introducción

La somatosensación, la codificación neuronal de estímulos mecánicos, térmicos y químicos que inciden en la piel u otras estructuras corporales, incluidos los músculos, los huesos y las vísceras, comienza con la actividad de las neuronas aferentes primarias que inervan^{estas estructuras}. Los enfoques electrofisiológicos basados en una sola unidad han proporcionado una gran cantidad de información sobre los subtipos aferentes involucrados en este proceso, así como sobre cómo sus propiedades de estímulo-respuesta pueden cambiar con el tiempo ^1,2,3. Sin embargo, aunque sigue habiendo pruebas sólidas que apoyan la teoría de las líneas marcadas, que sugiere que las modalidades sensoriales específicas son transmitidas por subpoblaciones específicas de neuronas, la capacidad de muchas subpoblaciones de neuronas para responder a los mismos tipos de estímulos mecánicos, térmicos y químicos sugiere que la mayoría de los estímulos somatosensoriales están codificados por múltiples subpoblaciones de^{neuronas. 5}. Por lo tanto, una mejor comprensión de la somatosensación solo vendrá con la capacidad de estudiar la actividad de 10, si no cientos, de neuronas simultáneamente.

Los avances en los enfoques ópticos con el advenimiento relativamente reciente de las técnicas de imagen confocal y, posteriormente, multifotónica y digital, han facilitado la capacidad de realizar análisis de^{la actividad} neuronal a nivel poblacional relativamente no invasivos ^6,7. Uno de los últimos obstáculos en la aplicación de esta tecnología ha sido el desarrollo de herramientas que permitan la evaluación óptica de la actividad neuronal. Dada la velocidad de un potencial de acción que puede comenzar y terminar en menos de un milisegundo, un colorante sensible al voltaje con la capacidad de seguir los cambios en el potencial de membrana a la velocidad de un potencial de acción sería la herramienta ideal para este propósito. Pero si bien ha habido un tremendo progreso en esta área 7,8,9,10, la relación señal-ruido para muchos de estos colorantes aún no es lo suficientemente alta como para permitir un análisis poblacional de cientos de neuronas a nivel de una sola célula. Como enfoque alternativo, los investigadores han recurrido a la monitorización de los cambios en la concentración intracelular de Ca²⁺ ([Ca²⁺]_i). Las limitaciones de esta estrategia han sido claras desde el principio e incluyen el hecho de que un aumento de [Ca²⁺]_i es una medida indirecta de la actividad neuronal¹¹; que puede ocurrir un aumento de [Ca²⁺]_i independientemente de la afluencia de Ca²⁺ asociada con la activación de canales de Ca²⁺ dependientes de voltaje (VGCC)^12,13; que la magnitud y duración de un transitorio de Ca²⁺ puede ser controlada por procesos independientes de la actividad VGCC 11,12,14; y que el curso temporal de los transitorios de Ca²⁺ supera con creces el de un potencial de acción¹⁵. Sin embargo, hay una serie de ventajas significativas asociadas con el uso de Ca²⁺ como medida indirecta de la actividad neuronal. No menos importante es la relación señal-ruido asociada con la mayoría de los indicadores de Ca²⁺, que refleja tanto la magnitud del cambio en el Ca²⁺ intracelular como el hecho de que la señal surge del espacio tridimensional del citosol en lugar del espacio bidimensional de la membrana celular. Además, con el desarrollo de indicadores de Ca²⁺ codificados genéticamente (GECI), es posible aprovechar las estrategias genéticas para impulsar la expresión de los indicadores de Ca²⁺ en subpoblaciones específicas de células, lo que facilita los análisis a nivel poblacional en preparaciones intactas (por ejemplo, ver¹⁶).

Dada la cantidad de herramientas genéticas disponibles en ratones, no debería sorprender que las GECI se hayan utilizado más ampliamente en esta especie. Se han desarrollado líneas de ratón con expresión constitutiva de GECI en subpoblaciones de neuronas sensoriales ^7,16,17. Con el desarrollo de líneas de ratón que expresan recombinasas en tipos celulares específicos, es posible utilizar estrategias aún más sofisticadas para controlar la expresión de GECI¹⁵. Sin embargo, aunque estas herramientas son cada vez más poderosas, hay una serie de razones por las que otras especies, como las ratas, podrían ser más apropiadas para algunas preguntas experimentales. Estos incluyen el tamaño más grande, lo que facilita una serie de manipulaciones experimentales que son difíciles, si no imposibles, en el ratón más pequeño; la facilidad para entrenar a las ratas en tareas conductuales relativamente complejas; y al menos alguna evidencia de que las propiedades biofísicas y los patrones de expresión de varios canales iónicos en las neuronas sensoriales de rata pueden ser más similares a los observados en las neuronas sensoriales humanas que los mismos canales en ratones en relación con los humanos¹⁸.

Mientras que la transducción de estímulos somatosensoriales ocurre generalmente en las terminales periféricas de las aferencias primarias, el potencial de acción iniciado en la periferia debe pasar a través de la estructura que alberga los somas aferentes primarios, denominados ganglios de la raíz dorsal (DRG) o del trigémino (TG) antes de llegar al sistema nervioso central¹⁹. Si bien existe evidencia de que no todos los potenciales de acción que se propagan a lo largo de un axón aferente primario invadirán el cuerpo celular²⁰, como consecuencia del hecho de que los somas aferentes primarios están conectados al axón aferente principal a través de una unión en T¹⁹, la mayoría de los potenciales de acción iniciados en la periferia parecen invadir el soma²¹. Esto confiere tres ventajas experimentales cuando se utilizan GECIs para evaluar la codificación de la población en aferencias primarias: el gran tamaño del cuerpo celular en relación con los axones aumenta aún más la señal a ruido cuando se utiliza [Ca²⁺]_i como medida indirecta de la actividad aferente; los DRG son generalmente de fácil acceso; y la evaluación de la actividad en un sitio que está espacialmente alejado de las terminales aferentes minimiza el impacto potencial de la cirugía necesaria para exponer los ganglios en las propiedades de estímulo-respuesta de las terminales aferentes. Sin embargo, debido a que los TG se encuentran debajo del cerebro (o por encima de la paleta), son mucho más difíciles de acceder que los DRG. Además, si bien hay muchas similitudes entre las neuronas DRG y TG, también hay una lista creciente de diferencias. Esto incluye la organización más o menos somatotópica de las neuronas en el TG²², estructuras únicas inervadas, diferentes patrones de terminación terminal central 23,24,25,26, y ahora una lista creciente de diferencias tanto en la expresión génica^27,28 como en la expresión del receptor funcional²⁹. Además, debido a que estamos interesados en la identificación de los mecanismos periféricos del dolor, el número relativamente grande de síndromes de dolor que parecen ser exclusivos del sistema trigémino (p. ej., migraña, neuralgia del trigémino, síndrome de boca ardiente) que parecen involucrar actividad aberrante en las aferencias primarias 30,31,32, sugiere que el TG necesita ser estudiado directamente.

Por lo tanto, si bien las propiedades de estímulo-respuesta de las neuronas TG se han estudiado con GECI en el ratón¹⁶, debido a que las razones enumeradas anteriormente sugieren que la rata puede ser una especie más apropiada para abordar una variedad de preguntas experimentales, el propósito del presente estudio fue desarrollar un enfoque para usar GECI para estudiar las neuronas TG en la rata. Para lograr esto, utilizamos un enfoque viral para impulsar la expresión de los GECI GCaMP6s en el sistema nervioso periférico. A continuación, extirpamos el prosencéfalo para permitir el acceso al TG. Finalmente, se aplicaron estímulos mecánicos y térmicos en la cara mientras se evaluaban las respuestas neuronales bajo microscopía fluorescente. En conjunto, estos datos respaldan el papel de la utilización de la rata para investigar los cambios en el TG en muchos estados, ampliando el conjunto de herramientas para los investigadores interesados en la codificación sensorial en el sistema trigémino.

Protocolo

Todos los experimentos que involucraron el uso de animales en investigación se realizaron de acuerdo con los estándares establecidos por los Institutos Nacionales de Salud y la Asociación Internacional para el Estudio del Dolor y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Pittsburgh (protocolo # 22051100). Al final de cada experimento, las ratas fueron sacrificadas a través de la exanguinación con perfusión cardíaca de solución salina tamponada con fosfato helado (PBS), un enfoque aprobado por la Asociación Americana de Medicina Veterinaria y la Universidad de Pittsburgh IACUC.

1. Inducción de GCaMP

1. Ordene ratas Sprague Dawley preñadas para que las crías puedan ser inyectadas en el momento adecuado después del nacimiento.
2. Rocíe los guantes con un 70% de EtOH antes de manipular cada cachorro de rata. Esto disuadirá a la madre de canibalizar a las crías.
3. Frotar a las crías de rata (P1-2) con EtOH al 70% y anestesiar con hielo durante 3 min.
4. Inyecte 15 μL de AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40 (Addgene) por vía intraperitoneal con una jeringa Hamilton estéril y hermética a los gases de 25 μL.

2. Cirugía de exposición al ganglio trigémino

1. Administrar cóctel anestésico (55 mg/kg de ketamina, 5,5 mg/kg de xilacina, 1 mg/kg de acepromazina) por vía intraperitoneal en función del peso corporal a ratas de 6-8 semanas de edad (aproximadamente 150-200 g).
   NOTA: Por lo general, esto es suficiente para mantener un plano quirúrgico de anestesia, según lo evaluado por la ausencia de un reflejo de abstinencia al pellizco nocivo de una pata trasera. Sin embargo, suplementar con isoflurano a través de un cono de nariz si los animales se vuelven ligeros.
2. Una vez completamente anestesiado, afeita el cabello y los bigotes de la cabeza y la cara.
3. Monta a la rata en un marco estereotáxico con barras para las orejas y coloca una almohadilla térmica (~37 ^oC) debajo para mantener la temperatura corporal.
4. Controle los signos vitales (frecuencia cardíaca, frecuencia respiratoria, saturación de oxígeno en sangre) con un oxímetro de ratón o similar.
   NOTA: La temperatura corporal se controla mediante una sonda rectal y se mantiene colocando a las ratas en una manta de agua circulante controlada por retroalimentación.
5. Coloque una gasa mojada en solución salina helada en la cabeza para contraer los vasos sanguíneos y minimizar el sangrado. Con un bisturí de tamaño 15, haga una incisión en la línea media de la piel y el músculo sobre el cráneo.
6. Use una disección roma de la piel y el músculo para exponer el cráneo.
7. Con una broca redonda de 1/4, perfore con cuidado la tapa del cráneo para exponer el prosencéfalo. Luego, use rongeurs (taza de 2,5 mm) para cortar con cuidado el cráneo.
8. Con un bisturí de tamaño 15, haga una incisión en el cerebro (Bregma: -3,80) y en el bulbo olfatorio.
   NOTA: Cortar más caudalmente más allá de este punto provocará la muerte de la rata
9. Use una espátula para desconectar cuidadosamente la duramadre del cráneo y levante suavemente el cerebro cortado para revelar el TG y la base del cráneo.
   NOTA: El uso adicional de perfusión salina helada durante la extracción minimizará el sangrado y optimizará el siguiente campo de disección.
10. Con una pluma de cauterización, detenga cualquier sangrado resultante de la extracción.
    NOTA: Cortar la duramadre provocará un sangrado inevitable. Lo mejor es preparar aCSF helado (119 mM de NaCl, 26,2 mM de NaHCO₃, 2,5 mM de KCl, 1 mM de NaH₂PO₄, 1,3 mM de MgCl₂, 10 mM de glucosa, 2,5 mM de CaCl₂) para bañar la cavidad del cráneo y ayudar a contraer los vasos sanguíneos mientras se mantiene la salud neuronal.

3. Imágenes GCaMP6s

NOTA: Dado el tamaño y la densidad de estas neuronas, el sistema de imagen y adquisición de datos utilizado (objetivo, microscopio, fuente de luz, cámara) determinará el número de células GECI⁺ visualizadas. La fuente de luz, el objetivo y la cámara también determinarán los parámetros utilizados para la adquisición de imágenes, incluido el tiempo de exposición y la velocidad de captura de imágenes. Si bien se pueden utilizar técnicas multifotónicas y confocales dependiendo de los parámetros del experimento, la microscopía de epifluorescencia puede ser suficiente para resolver muchas células. Se puede utilizar cualquier paquete de adquisición de imágenes. Idealmente, la aplicación de estímulo está bloqueada en el tiempo con el paquete de software de adquisición de imágenes.

1. Coloque la cavidad del cráneo debajo del objetivo y enfoque el TG con luz visible.
2. La longitud de onda de excitación de GCaMP6s es de 496 nm y su longitud de onda de emisión es de 513 nm; por lo tanto, utilice los cubos dicroicos y de filtro adecuados para localizar las células GCaMP⁺ . Ajustar el enfoque para localizar y resolver el área de los ganglios en la que las neuronas responden a los estímulos aplicados al campo receptivo de interés.
3. Utilice un objetivo de 10x para permitir la visualización de la mayoría de las neuronas en el TG que responden a estímulos mecánicos aplicados a una región de 1^cm2 de la cara¹⁶. Utilice un objetivo seco de 20x con una distancia de trabajo larga (10,8 mm) para aumentar la resolución.
4. Utilice un software de adquisición (por ejemplo, Metamorph) para recopilar datos de fluorescencia a lo largo del tiempo y en respuesta a la aplicación de estímulos.
   1. Para minimizar el fotoblanqueo de las neuronas, utilice el menor tiempo de exposición posible para detectar los aumentos de fluorescencia de referencia y evocados. Con el objetivo aéreo de 20x y 0,40 NA, una fuente de luz de halogenuros de mercurio de 120 W y una cámara complementaria de semiconductores de óxido metálico (CMOS) utilizados en el presente estudio, un tiempo de exposición de 300 ms y una tasa de adquisición de imágenes de 3 Hz, se obtienen grabaciones de referencia estables durante >90 min.
      NOTA: 1) Estos parámetros de adquisición de imágenes deben determinarse empíricamente. 2) Al campo receptivo se le pueden aplicar mecánicas (cepillo, punteado, vibración, pellizco), térmicas (calor y frío) y químicas (capsaicina, mentol, mediadores inflamatorios). Un enfoque subjetivo relativamente barato es aplicar los estímulos a mano. Sin embargo, se recomiendan enfoques más objetivos y reproducibles, en los que se pueden utilizar actuadores controlados por retroalimentación para aplicaciones repetidas a una fuerza conocida. Si bien los dispositivos Peltier controlados por retroalimentación son útiles para el calentamiento y enfriamiento controlados, no son ideales para la estimulación térmica de una cara curva. Las fuentes de luz infrarroja controladas por retroalimentación son una alternativa para la calefacción, y la pulverización fría es una alternativa menos que ideal para la refrigeración.

Resultados

Debido a que anteriormente hemos tenido éxito con el serotipo AAV9 para la infección de neuronas sensoriales de rata¹⁵, utilizamos este serotipo para la expresión de GCaMP6s en neuronas TG de rata. Por lo tanto, primero buscamos evaluar la eficiencia de la infección neuronal sensorial de AAV9-CAG-GCaMP6s-WPRE-SV40 (AAV9-GCaMP) cuando este virus se administró a crías de ratas neonatas²⁰. Este virus utiliza el promotor CAG, que impulsa y mantiene altos niveles de expres...

Discusión

Aquí, demostramos una forma rápida y no invasiva de generar una rata GECI para obtener imágenes del TG. Elegimos un promotor CAG para impulsar y mantener altos niveles de expresión génica. Si bien estudios previos sugieren que otros serotipos de AAV pueden impulsar eficientemente la expresión génica en las neuronas DRG³⁹, nuestros resultados son consistentes con un estudio reciente que involucra la inyección intraperitoneal de AAV en neonatos³², lo que indica que el...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40	Addgene	100844-AAV9	AAV9-GCaMP6s virus
ACEpromazine maleate	Covetrus	11695-0095-5	10 mg/mL
AnaSed (Xylazine) injection	AKORN Animal Health	23076-35-9	20 mg/mL
CTR5500 Electronics box	Leica	11 888 820	Power Supply
Cutwell burr drill bit	Ransom & Randolph		¼ round
DM 6000 FS	Leica	11 888 928	Base Stand
EL6000	Leica	EL6000	Light source with 120 W mercury bulb
Forceps	FST	11252-00	Dumont No. 05
Friedman rongeurs	FST	16000-14	2.5 mm cup size
Friedman-Pearson rongeurs	FST	16021-14	1 mm cup size
Heating pad (Temperature therapy pad)	STRYKER	8002-062-022
Ketamine hydrochloride	Covetrus	1695-0703-1	100 mg/mL
Plan Fluor 20x/0.40	Leica	MRH00105	20x objective, 0.4 NA10.8 mm WD
Power handle high-temp cautery pen	Bovie	HIT1	handheld Change-A-Tip cautery pen
Prime 95B	Photometrics	Prime 95B	CMOS Camera
Saline	Fisher Scientific	NC0291799	0.9% Sterile Saline
Scalpel blade	Fisher Scientific	22-079-701	size 15 disposable blade
Spatula	BRI	48-1460	brain spatula
Spring scissors	FST	91500-09	Student Vannas, 5 mm cutting edge
Spring scissors	FST	15012-12	Noyes, 14 mm cutting edge
STP6000 Smart touch panel	Leica	11 501 255	Control Panel
Syringe	Hamilton	80201	25 μL Model 1702 Luer Tip syringe
Water heater	Adroit	HTP-1500