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En este artículo

  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Los indicadores de calcio codificados genéticamente (GECI, por sus siglas en inglés) permiten un análisis robusto a nivel poblacional de la señalización de las neuronas sensoriales. Aquí, hemos desarrollado un enfoque novedoso que permite la visualización in vivo de GECI de la actividad de las neuronas de los ganglios trigéminos de rata.

Resumen

Los indicadores de calcio codificados genéticamente (GECI, por sus siglas en inglés) permiten que las técnicas de imagen monitoricen los cambios en el calcio intracelular en las poblaciones celulares objetivo. Su gran relación señal-ruido hace que los GECI sean una poderosa herramienta para detectar la actividad evocada por estímulos en las neuronas sensoriales. Los GECI facilitan el análisis a nivel poblacional de la codificación de estímulos con el número de neuronas que se pueden estudiar simultáneamente. Esta codificación poblacional se realiza de forma más apropiada in vivo. Los ganglios de la raíz dorsal (DRG), que albergan el soma de las neuronas sensoriales que inervan las estructuras somáticas y viscerales debajo del cuello, se utilizan más ampliamente para la obtención de imágenes in vivo porque se accede a estas estructuras con relativa facilidad. Más recientemente, esta técnica se utilizó en ratones para estudiar las neuronas sensoriales del ganglio trigémino (TG) que inervan las estructuras orales y craneofaciales. Hay muchas razones para estudiar la TG además de la GRD, incluida la larga lista de síndromes de dolor específicos de las estructuras orales y craneofaciales que parecen reflejar cambios en la actividad de las neuronas sensoriales, como la neuralgia del trigémino. Los ratones se utilizan más ampliamente en el estudio de las neuronas DRG y TG debido a la disponibilidad de herramientas genéticas. Sin embargo, con las diferencias en el tamaño, la facilidad de manejo y las diferencias de especies potencialmente importantes, hay razones para estudiar neuronas TG de rata en lugar de ratón. Por lo tanto, desarrollamos un enfoque para obtener imágenes de neuronas TG de rata in vivo. Inyectamos crías neonatales (p2) por vía intraperitoneal con un AAV que codifica GCaMP6s, lo que resultó en una infección del >90% de las neuronas TG y DRG. La TG se visualizó en el adulto después de la craneotomía y la decorticación, y los cambios en la fluorescencia de GCaMP6s se monitorizaron en las neuronas TG después de la estimulación de las regiones mandibular y maxilar de la cara. Confirmamos que los aumentos de fluorescencia fueron evocados por estímulos con el bloqueo de nervios periféricos. Si bien este enfoque tiene muchos usos potenciales, lo estamos utilizando para caracterizar la(s) subpoblación(es) de neuronas TG cambiadas después de una lesión de los nervios periféricos.

Introducción

La somatosensación, la codificación neuronal de estímulos mecánicos, térmicos y químicos que inciden en la piel u otras estructuras corporales, incluidos los músculos, los huesos y las vísceras, comienza con la actividad de las neuronas aferentes primarias que inervanestas estructuras. Los enfoques electrofisiológicos basados en una sola unidad han proporcionado una gran cantidad de información sobre los subtipos aferentes involucrados en este proceso, así como sobre cómo sus propiedades de estímulo-respuesta pueden cambiar con el tiempo 1,2,3. Sin emb....

Protocolo

Todos los experimentos que involucraron el uso de animales en investigación se realizaron de acuerdo con los estándares establecidos por los Institutos Nacionales de Salud y la Asociación Internacional para el Estudio del Dolor y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Pittsburgh (protocolo # 22051100). Al final de cada experimento, las ratas fueron sacrificadas a través de la exanguinación con perfusión cardíaca de solución salina tamponada con fosfato helado (PBS), un enfoque aprobado por la Asociación Americana de Medicina Veterinaria y la Universidad de Pittsburgh IACUC.

1. In....

Resultados

Debido a que anteriormente hemos tenido éxito con el serotipo AAV9 para la infección de neuronas sensoriales de rata15, utilizamos este serotipo para la expresión de GCaMP6s en neuronas TG de rata. Por lo tanto, primero buscamos evaluar la eficiencia de la infección neuronal sensorial de AAV9-CAG-GCaMP6s-WPRE-SV40 (AAV9-GCaMP) cuando este virus se administró a crías de ratas neonatas20. Este virus utiliza el promotor CAG, que impulsa y mantiene altos niveles de expres.......

Discusión

Aquí, demostramos una forma rápida y no invasiva de generar una rata GECI para obtener imágenes del TG. Elegimos un promotor CAG para impulsar y mantener altos niveles de expresión génica. Si bien estudios previos sugieren que otros serotipos de AAV pueden impulsar eficientemente la expresión génica en las neuronas DRG39, nuestros resultados son consistentes con un estudio reciente que involucra la inyección intraperitoneal de AAV en neonatos32, lo que indica que el.......

Divulgaciones

El Dr. Gold recibió una beca de Grünenthal durante el desarrollo de esta preparación. No hubo superposición entre el enfoque del estudio de Grünenthal y la preparación descrita en este manuscrito. Ninguno de los otros autores tiene ningún otro conflicto de intereses potencial que revelar.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer a los doctores Kathy Albers y Brian Davis por el uso de su microscopio Leica y su programa Metamorph, a Charles Warwick por ayudar a construir nuestro dispositivo térmico Peltier y al Dr. Raymond Sekula por ayudar a solucionar problemas de preparación quirúrgica. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud: F31NS125993 (JYG), T32NS073548 (JYG) y R01NS122784 (MSG y RS).

....

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40 Addgene100844-AAV9AAV9-GCaMP6s virus
ACEpromazine maleateCovetrus11695-0095-510 mg/mL
AnaSed (Xylazine) injectionAKORN Animal Health23076-35-920 mg/mL
CTR5500 Electronics boxLeica11 888 820Power Supply
Cutwell burr drill bitRansom & Randolph¼ round
DM 6000 FSLeica11 888 928Base Stand
EL6000LeicaEL6000Light source with 120 W mercury bulb
ForcepsFST11252-00Dumont No. 05
Friedman rongeursFST16000-142.5 mm cup size
Friedman-Pearson rongeursFST16021-141 mm cup size
Heating pad (Temperature therapy pad)STRYKER8002-062-022
Ketamine hydrochlorideCovetrus1695-0703-1100 mg/mL
Plan Fluor 20x/0.40LeicaMRH0010520x objective, 0.4 NA10.8 mm WD
Power handle high-temp cautery penBovieHIT1handheld Change-A-Tip cautery pen
Prime 95BPhotometricsPrime 95BCMOS Camera
SalineFisher ScientificNC02917990.9% Sterile Saline
Scalpel bladeFisher Scientific22-079-701size 15 disposable blade
SpatulaBRI48-1460brain spatula
Spring scissorsFST91500-09Student Vannas, 5 mm cutting edge
Spring scissorsFST15012-12Noyes, 14 mm cutting edge
STP6000 Smart touch panelLeica11 501 255Control Panel
SyringeHamilton8020125 μL Model 1702 Luer Tip syringe
Water heaterAdroitHTP-1500

Referencias

  1. Gold, M. S., Gebhart, G. F. Nociceptor sensitization in pain pathogenesis. Nat Med. 16 (11), 1248-1257 (2010).
  2. Gold, M. S., Caterina, M. J. . The Senses: A Comprehensive Reference. , (2008).
  3. Lawson, S. N., Fang, X., Djouhri, L.

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