In Vivo Imaging del calcio dei neuroni sensoriali nel ganglio trigeminale del ratto

Riepilogo

Gli indicatori di calcio geneticamente codificati (GECI) consentono una solida analisi a livello di popolazione della segnalazione sensoriale dei neuroni. Qui, abbiamo sviluppato un nuovo approccio che consente la visualizzazione GECI in vivo dell'attività dei neuroni dei gangli trigeminali del ratto.

Abstract

Gli indicatori di calcio geneticamente codificati (GECI) consentono alle tecniche di imaging di monitorare i cambiamenti nel calcio intracellulare nelle popolazioni cellulari bersaglio. Il loro elevato rapporto segnale/rumore rende i GECI un potente strumento per rilevare l'attività evocata dallo stimolo nei neuroni sensoriali. I GECI facilitano l'analisi a livello di popolazione della codifica dello stimolo con il numero di neuroni che possono essere studiati contemporaneamente. Questa codifica di popolazione viene eseguita in modo più appropriato in vivo. I gangli delle radici dorsali (DRG), che ospitano il soma dei neuroni sensoriali che innervano le strutture somatiche e viscerali sotto il collo, sono utilizzati più ampiamente per l'imaging in vivo perché queste strutture sono accessibili in modo relativamente semplice. Più recentemente, questa tecnica è stata utilizzata nei topi per studiare i neuroni sensoriali nel ganglio trigemino (TG) che innervano le strutture orali e craniofacciali. Ci sono molte ragioni per studiare la TG oltre alla DRG, inclusa la lunga lista di sindromi dolorose specifiche per le strutture orali e craniofacciali che sembrano riflettere cambiamenti nell'attività dei neuroni sensoriali, come la nevralgia del trigemino. I topi sono utilizzati più ampiamente nello studio dei neuroni DRG e TG a causa della disponibilità di strumenti genetici. Tuttavia, con le differenze nelle dimensioni, nella facilità di manipolazione e nelle differenze di specie potenzialmente importanti, ci sono ragioni per studiare i neuroni TG dei ratti piuttosto che quelli dei topi. Pertanto, abbiamo sviluppato un approccio per l'imaging dei neuroni TG di ratto in vivo. Abbiamo iniettato cuccioli neonatali (p2) per via intraperitoneale con un AAV codificante GCaMP6s, con conseguente infezione del >90% di entrambi i neuroni TG e DRG. La TG è stata visualizzata nell'adulto dopo craniotomia e decorticazione e i cambiamenti nella fluorescenza di GCaMP6s sono stati monitorati nei neuroni TG dopo la stimolazione delle regioni mandibolari e mascellari del viso. Abbiamo confermato che gli aumenti di fluorescenza sono stati stimolati con il blocco del nervo periferico. Sebbene questo approccio abbia molti usi potenziali, lo stiamo usando per caratterizzare le sottopopolazioni di neuroni TG modificati a seguito di lesioni dei nervi periferici.

Introduzione

La somatosensazione, la codifica neurale di stimoli meccanici, termici e chimici che colpiscono la pelle o altre strutture corporee, inclusi muscoli, ossa e visceri, inizia con l'attività nei neuroni afferenti primari che innervano queste strutture¹. Gli approcci elettrofisiologici basati su singole unità hanno fornito una grande quantità di informazioni sui sottotipi afferenti coinvolti in questo processo e su come le loro proprietà stimolo-risposta possono cambiare nel tempo ^1,2,3. Tuttavia, mentre rimangono forti prove a sostegno della teoria della linea marcata, che suggerisce che specifiche modalità sensoriali sono veicolate da specifiche sottopopolazioni di neuroni, la capacità di molte sottopopolazioni di neuroni di rispondere agli stessi tipi di stimoli meccanici, termici e chimici suggerisce che la maggior parte degli stimoli somatosensoriali sono codificati da più sottopopolazioni di neuroni^{4, 5}. Introduzione Pertanto, una migliore comprensione della somatosensazione arriverà solo con la capacità di studiare l'attività di 10, se non centinaia, di neuroni contemporaneamente.

I progressi negli approcci ottici con l'avvento relativamente recente delle tecniche di imaging confocale e, successivamente, multifotone e digitale hanno facilitato la capacità di eseguire analisi relativamente non invasive a livello di popolazione dell'attività neuronale ^6,7. Uno degli ultimi ostacoli nell'applicazione di questa tecnologia è stato lo sviluppo di strumenti per consentire la valutazione ottica dell'attività neurale. Data la velocità di un potenziale d'azione che può iniziare e finire in meno di un millisecondo, un colorante sensibile al voltaggio con la capacità di seguire le variazioni del potenziale di membrana alla velocità di un potenziale d'azione sarebbe lo strumento ideale per questo scopo. Ma mentre ci sono stati enormi progressi in quest'area 7,8,9,10, il rapporto segnale-rumore per molti di questi coloranti non è ancora abbastanza alto da consentire un'analisi della popolazione di centinaia di neuroni a livello di singola cellula. Come approccio alternativo, i ricercatori si sono rivolti al monitoraggio dei cambiamenti nella concentrazione intracellulare di Ca²⁺ ([Ca²⁺]_i). I limiti di questa strategia sono stati chiari fin dall'inizio e includono il fatto che un aumento di [Ca²⁺]_i è una misura indiretta dell'attività neurale¹¹; che un aumento di [Ca²⁺]_i può verificarsi indipendentemente dall'afflusso di Ca²⁺ associato all'attivazione dei canali Ca²⁺ voltaggio-dipendenti (VGCC)^12,13; che l'entità e la durata di un transitorio di Ca²⁺ possono essere controllate da processi indipendenti dall'attività del VGCC 11,12,14; e che il decorso temporale dei transitori di Ca²⁺ supera di gran lunga quello di un potenziale d'azione¹⁵. Tuttavia, ci sono una serie di vantaggi significativi associati all'uso di Ca²⁺ come misura indiretta dell'attività neurale. Non ultimo di questi è il rapporto segnale-rumore associato alla maggior parte degli indicatori di Ca²⁺, che riflette sia l'entità del cambiamento nel Ca²⁺ intracellulare che il fatto che il segnale proviene dallo spazio tridimensionale del citosol piuttosto che dallo spazio bidimensionale della membrana cellulare. Inoltre, con lo sviluppo di indicatori di Ca²⁺ geneticamente codificati (GECI), è possibile sfruttare strategie genetiche per guidare l'espressione degli indicatori di Ca²⁺ in specifiche sottopopolazioni di cellule, facilitando le analisi a livello di popolazione in preparati intatti (ad esempio, vedi¹⁶).

Dato il numero di strumenti genetici ora disponibili nei topi, non dovrebbe sorprendere che i GECI siano stati utilizzati più ampiamente in questa specie. Sono state sviluppate linee murine con espressione GECI costitutiva in sottopopolazioni di neuroni sensoriali ^7,16,17. Con lo sviluppo di linee murine che esprimono ricombinasi in specifici tipi di cellule, è possibile utilizzare strategie ancora più sofisticate per controllare l'espressione di GECI¹⁵. Tuttavia, mentre questi strumenti sono sempre più potenti, ci sono una serie di ragioni per cui altre specie, come i ratti, potrebbero essere più appropriate per alcune domande sperimentali. Questi includono le dimensioni maggiori, che facilitano una serie di manipolazioni sperimentali che sono difficili, se non impossibili, nel topo più piccolo; la facilità di addestrare i ratti in compiti comportamentali relativamente complessi; e almeno alcune prove che le proprietà biofisiche e i modelli di espressione di diversi canali ionici nei neuroni sensoriali di ratto possono essere più simili a quelli osservati nei neuroni sensoriali umani di quanto non lo siano gli stessi canali nel topo rispetto a quelli umani¹⁸.

Mentre la trasduzione degli stimoli somatosensoriali avviene generalmente nei terminali periferici delle afferenze primarie, il potenziale d'azione avviato in periferia deve passare attraverso la struttura che ospita i somati afferenti primari, denominati gangli della radice dorsale (DRG) o trigemino (TG) prima di raggiungere il sistema nervoso centrale¹⁹. Mentre ci sono prove che non tutti i potenziali d'azione che si propagano lungo un assone afferente primario invaderanno il corpo cellulare²⁰, una conseguenza del fatto che i somati afferenti primari sono collegati all'assone afferente principale tramite una giunzione a T¹⁹, la maggior parte dei potenziali d'azione iniziati nella periferia sembrano invadere il soma²¹. Ciò conferisce tre vantaggi sperimentali quando si utilizzano GECI per valutare la codifica di popolazione nelle afferenze primarie: le grandi dimensioni del corpo cellulare rispetto agli assoni aumentano ulteriormente il rapporto segnale/rumore quando si utilizza [Ca²⁺]_i come misura indiretta dell'attività afferente; i DRG sono generalmente di facile accesso; E la valutazione dell'attività in un sito spazialmente lontano dai terminali afferenti riduce al minimo il potenziale impatto dell'intervento chirurgico necessario per esporre i gangli sulle proprietà stimolo-risposta dei terminali afferenti. Tuttavia, poiché i TG si trovano sotto il cervello (o sopra la tavolozza), sono molto più difficili da accedere rispetto ai DRG. Inoltre, mentre ci sono molte somiglianze tra i neuroni DRG e TG, c'è anche un elenco crescente di differenze. Ciò include l'organizzazione approssimativamente somatotopica dei neuroni nel TG²², strutture uniche innervate, diversi modelli di terminazione terminale centrale 23,24,25,26 e ora un elenco crescente di differenze sia nell'espressione genica^27,28 che nell'espressione funzionale del recettore²⁹. Inoltre, poiché siamo interessati all'identificazione dei meccanismi periferici del dolore, il numero relativamente elevato di sindromi dolorose che sembrano essere uniche per il sistema trigemino (ad esempio, emicrania, nevralgia del trigemino, sindrome della bocca urente) che sembrano coinvolgere un'attività aberrante nelle afferenze primarie 30,31,32, suggerisce che la TG deve essere studiata direttamente.

Così, mentre le proprietà stimolo-risposta dei neuroni TG sono state studiate con GECI nel topo¹⁶, perché le ragioni sopra elencate suggeriscono che il ratto potrebbe essere una specie più appropriata per affrontare una varietà di domande sperimentali, lo scopo del presente studio è stato quello di sviluppare un approccio per utilizzare i GECI per studiare i neuroni TG nel ratto. Per raggiungere questo obiettivo, abbiamo utilizzato un approccio virale per guidare l'espressione dei GECI GCaMP6 nel sistema nervoso periferico. Abbiamo quindi rimosso il prosencefalo per consentire l'accesso al TG. Infine, sono stati applicati stimoli meccanici e termici al viso mentre le risposte neuronali sono state valutate al microscopio a fluorescenza. Insieme, questi dati supportano un ruolo per l'utilizzo del ratto per studiare i cambiamenti nel TG in molti stati, ampliando il kit di strumenti per i ricercatori interessati alla codifica sensoriale nel sistema trigemino.

Protocollo

Tutti gli esperimenti che prevedono l'uso di animali nella ricerca sono stati eseguiti in conformità con gli standard stabiliti dal National Institutes of Health e dall'International Association for the Study of Pain e sono stati approvati dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Università di Pittsburgh (protocollo #22051100). Alla fine di ogni esperimento, i ratti sono stati sottoposti a eutanasia tramite eutanasia con perfusione cardiaca di soluzione salina tamponata con fosfato ghiacciato (PBS), un approccio approvato dall'American Veterinary Medical Association e dall'Università di Pittsburgh IACUC.

1. Induzione GCaMP

1. Ordina ratti Sprague Dawley in gravidanza in modo che i cuccioli possano essere iniettati al momento opportuno dopo la nascita.
2. Spruzzare i guanti con EtOH al 70% prima di maneggiare ogni cucciolo di ratto. Questo dissuaderà la diga dal cannibalizzare i giovani.
3. Tamponare i cuccioli di ratto (P1-2) con il 70% di EtOH e anestetizzare su ghiaccio per 3 min.
4. Iniettare 15 μL di AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40 (Addgene) per via intraperitoneale utilizzando una siringa Hamilton sterile da 25 μL a tenuta di gas.

2. Chirurgia dell'esposizione del ganglio trigemino

1. Somministrare cocktail anestetico (55 mg/kg di ketamina, 5,5 mg/kg di xilazina, 1 mg/kg di acepromazina) per via intraperitoneale in base al peso corporeo a ratti di 6-8 settimane (circa 150-200 g).
   NOTA: Questo è generalmente sufficiente per mantenere un piano chirurgico di anestesia come valutato dall'assenza di un riflesso di astinenza al pizzico nocivo di una zampa posteriore. Tuttavia, integrare con isoflurano attraverso un cono nasale se gli animali diventano leggeri.
2. Una volta completamente anestetizzato, radere i capelli e i baffi della testa e del viso.
3. Montare il ratto su un telaio stereotassico con barre auricolari e posizionare un termoforo (~37 ^oC) sotto per mantenere la temperatura corporea.
4. Monitorare i segni vitali (frequenza cardiaca, frequenza respiratoria, saturazione di ossigeno nel sangue) con un ossimetro per topi o equivalente.
   NOTA: La temperatura corporea viene monitorata da una sonda rettale e mantenuta posizionando i ratti su una coperta d'acqua circolante controllata da feedback.
5. Metti una garza imbevuta di soluzione salina ghiacciata sulla testa per restringere i vasi sanguigni e ridurre al minimo il sanguinamento. Usando un bisturi misura 15, fai un'incisione sulla linea mediana della pelle e del muscolo sopra il cranio.
6. Usa la dissezione smussata della pelle e del muscolo per esporre il cranio.
7. Usando una punta da trapano rotonda da 1/4, perforare con cura la calotta cranica per esporre il prosencefalo. Quindi, usa i rongeur (coppa da 2,5 mm) per tagliare con cura il cranio.
8. Usando un bisturi misura 15, praticare un'incisione nel cervello (Bregma: -3,80) e nel bulbo olfattivo.
   NOTA: Tagliare più caudalmente oltre questo punto provocherà la morte del ratto
9. Usa una spatola per scollegare con cura la dura dal cranio e solleva delicatamente il cervello reciso per rivelare il TG e la base del cranio.
   NOTA: L'uso aggiuntivo della perfusione salina ghiacciata durante l'estrazione ridurrà al minimo lo spurgo e ottimizzerà il seguente campo di dissezione.
10. Utilizzando una penna per cauterizzazione, arginare eventuali emorragie derivanti dall'estrazione.
    NOTA: Il taglio della dura provocherà un inevitabile sanguinamento. È meglio preparare aCSF ghiacciato (119 mM NaCl, 26,2 mM NaHCO₃, 2,5 mM KCl, 1 mM NaH₂PO₄, 1,3 mM MgCl₂, 10 mM di glucosio, 2,5 mM CaCl₂) per bagnare la cavità cranica per aiutare a restringere i vasi sanguigni mantenendo la salute neuronale.

3. Imaging GCaMP6s

NOTA: Date le dimensioni e la densità di questi neuroni, il sistema di imaging e acquisizione dati utilizzato (obiettivo, microscopio, sorgente luminosa, fotocamera) determinerà il numero di cellule GECI⁺ visualizzate. La sorgente luminosa, l'obiettivo e la fotocamera determineranno anche i parametri utilizzati per l'acquisizione dell'immagine, tra cui il tempo di esposizione e la velocità di acquisizione dell'immagine. Mentre le tecniche multifotone e confocali possono essere utilizzate a seconda dei parametri dell'esperimento, la microscopia a epifluorescenza può essere sufficiente per risolvere molte cellule. È possibile utilizzare qualsiasi pacchetto di acquisizione delle immagini. Idealmente, l'applicazione dello stimolo è bloccata nel tempo con il pacchetto software di acquisizione delle immagini.

1. Posiziona la cavità cranica sotto l'obiettivo e metti a fuoco il TG usando la luce visibile.
2. La lunghezza d'onda di eccitazione di GCaMP6s è di 496 nm e la sua lunghezza d'onda di emissione è di 513 nm; pertanto, utilizzare i cubi dicroici e di filtro appropriati per individuare le celle GCaMP⁺ . Regolare la messa a fuoco per individuare e risolvere l'area dei gangli in cui i neuroni rispondono agli stimoli applicati al campo recettivo di interesse.
3. Utilizzare un obiettivo 10x per consentire la visualizzazione della maggior parte dei neuroni nel TG che rispondono a stimoli meccanici applicati a una regione di 1 cm² del viso¹⁶. Utilizzare un obiettivo asciutto 20x con una lunga distanza di lavoro (10.8 mm) per aumentare la risoluzione.
4. Utilizzare un software di acquisizione (ad esempio, Metamorph) per raccogliere i dati di fluorescenza nel tempo e in risposta all'applicazione dello stimolo.
   1. Per ridurre al minimo il foto-sbiancamento dei neuroni, utilizzare il tempo di esposizione più breve possibile per rilevare gli aumenti di fluorescenza al basale e evocati. Con l'obiettivo in aria 20x, 0,40 NA, una sorgente luminosa ad alogenuri di mercurio da 120 W e una fotocamera CMOS (Complementary Metal-Oxide-Semiconductor) utilizzata nel presente studio, un tempo di esposizione di 300 ms e una velocità di acquisizione delle immagini di 3 Hz, si ottengono registrazioni di base stabili per >90 min.
      NOTA: 1) Questi parametri di acquisizione delle immagini devono essere determinati empiricamente. 2) Al campo recettivo possono essere applicati metodi meccanici (pennello, punteggiatura, vibrazione, pizzico), termici (caldo e freddo) e chimici (capsaicina, mentolo, mediatori infiammatori). Un approccio soggettivo relativamente poco costoso consiste nell'applicare gli stimoli a mano. Tuttavia, si raccomandano approcci più oggettivi e riproducibili, in cui gli attuatori controllati dal feedback possono essere utilizzati per applicazioni ripetute a una forza nota. Sebbene i dispositivi Peltier controllati dal feedback siano utili per il riscaldamento e il raffreddamento controllati, non sono ideali per la stimolazione termica di un viso curvo. Le sorgenti luminose a infrarossi controllate dal feedback sono un'alternativa per il riscaldamento e lo spray freddo è un'alternativa tutt'altro che ideale per il raffreddamento.

Risultati

Poiché in precedenza abbiamo avuto successo con il sierotipo AAV9 per l'infezione dei neuroni sensoriali di ratto¹⁵, abbiamo usato questo sierotipo per l'espressione di GCaMP6 nei neuroni TG di ratto. Abbiamo quindi cercato di valutare l'efficienza dell'infezione da neuroni sensoriali di AAV9-CAG-GCaMP6s-WPRE-SV40 (AAV9-GCaMP) quando questo virus è stato somministrato a cuccioli di ratto^{neonatale 20}. Questo virus utilizza il promotore CAG, che guida e mantiene alti livell...

Discussione

Qui, dimostriamo un modo rapido e non invasivo di generare un ratto GECI per l'imaging del TG. Abbiamo scelto un promotore CAG per guidare e mantenere alti livelli di espressione genica. Mentre studi precedenti suggeriscono che altri sierotipi AAV possono guidare in modo efficiente l'espressione genica nei neuroni DRG³⁹, i nostri risultati sono coerenti con un recente studio che coinvolge l'iniezione intraperitoneale di AAV nei neonati³², indicando che il sierotipo AAV9 è ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40	Addgene	100844-AAV9	AAV9-GCaMP6s virus
ACEpromazine maleate	Covetrus	11695-0095-5	10 mg/mL
AnaSed (Xylazine) injection	AKORN Animal Health	23076-35-9	20 mg/mL
CTR5500 Electronics box	Leica	11 888 820	Power Supply
Cutwell burr drill bit	Ransom & Randolph		¼ round
DM 6000 FS	Leica	11 888 928	Base Stand
EL6000	Leica	EL6000	Light source with 120 W mercury bulb
Forceps	FST	11252-00	Dumont No. 05
Friedman rongeurs	FST	16000-14	2.5 mm cup size
Friedman-Pearson rongeurs	FST	16021-14	1 mm cup size
Heating pad (Temperature therapy pad)	STRYKER	8002-062-022
Ketamine hydrochloride	Covetrus	1695-0703-1	100 mg/mL
Plan Fluor 20x/0.40	Leica	MRH00105	20x objective, 0.4 NA10.8 mm WD
Power handle high-temp cautery pen	Bovie	HIT1	handheld Change-A-Tip cautery pen
Prime 95B	Photometrics	Prime 95B	CMOS Camera
Saline	Fisher Scientific	NC0291799	0.9% Sterile Saline
Scalpel blade	Fisher Scientific	22-079-701	size 15 disposable blade
Spatula	BRI	48-1460	brain spatula
Spring scissors	FST	91500-09	Student Vannas, 5 mm cutting edge
Spring scissors	FST	15012-12	Noyes, 14 mm cutting edge
STP6000 Smart touch panel	Leica	11 501 255	Control Panel
Syringe	Hamilton	80201	25 μL Model 1702 Luer Tip syringe
Water heater	Adroit	HTP-1500