In Vivo Imaging del calcio dei neuroni sensoriali nel ganglio trigeminale del ratto

Riepilogo

Gli indicatori di calcio geneticamente codificati (GECI) consentono una solida analisi a livello di popolazione della segnalazione sensoriale dei neuroni. Qui, abbiamo sviluppato un nuovo approccio che consente la visualizzazione GECI in vivo dell'attività dei neuroni dei gangli trigeminali del ratto.

Abstract

Gli indicatori di calcio geneticamente codificati (GECI) consentono alle tecniche di imaging di monitorare i cambiamenti nel calcio intracellulare nelle popolazioni cellulari bersaglio. Il loro elevato rapporto segnale/rumore rende i GECI un potente strumento per rilevare l'attività evocata dallo stimolo nei neuroni sensoriali. I GECI facilitano l'analisi a livello di popolazione della codifica dello stimolo con il numero di neuroni che possono essere studiati contemporaneamente. Questa codifica di popolazione viene eseguita in modo più appropriato in vivo. I gangli delle radici dorsali (DRG), che ospitano il soma dei neuroni sensoriali che innervano le strutture somatiche e viscerali sotto il collo, sono utilizzati più ampiamente per l'imaging in vivo perché queste strutture sono accessibili in modo relativamente semplice. Più recentemente, questa tecnica è stata utilizzata nei topi per studiare i neuroni sensoriali nel ganglio trigemino (TG) che innervano le strutture orali e craniofacciali. Ci sono molte ragioni per studiare la TG oltre alla DRG, inclusa la lunga lista di sindromi dolorose specifiche per le strutture orali e craniofacciali che sembrano riflettere cambiamenti nell'attività dei neuroni sensoriali, come la nevralgia del trigemino. I topi sono utilizzati più ampiamente nello studio dei neuroni DRG e TG a causa della disponibilità di strumenti genetici. Tuttavia, con le differenze nelle dimensioni, nella facilità di manipolazione e nelle differenze di specie potenzialmente importanti, ci sono ragioni per studiare i neuroni TG dei ratti piuttosto che quelli dei topi. Pertanto, abbiamo sviluppato un approccio per l'imaging dei neuroni TG di ratto in vivo. Abbiamo iniettato cuccioli neonatali (p2) per via intraperitoneale con un AAV codificante GCaMP6s, con conseguente infezione del >90% di entrambi i neuroni TG e DRG. La TG è stata visualizzata nell'adulto dopo craniotomia e decorticazione e i cambiamenti nella fluorescenza di GCaMP6s sono stati monitorati nei neuroni TG dopo la stimolazione delle regioni mandibolari e mascellari del viso. Abbiamo confermato che gli aumenti di fluorescenza sono stati stimolati con il blocco del nervo periferico. Sebbene questo approccio abbia molti usi potenziali, lo stiamo usando per caratterizzare le sottopopolazioni di neuroni TG modificati a seguito di lesioni dei nervi periferici.

Introduzione

La somatosensazione, la codifica neurale di stimoli meccanici, termici e chimici che colpiscono la pelle o altre strutture corporee, inclusi muscoli, ossa e visceri, inizia con l'attività nei neuroni afferenti primari che innervano queste strutture¹. Gli approcci elettrofisiologici basati su singole unità hanno fornito una grande quantità di informazioni sui sottotipi afferenti coinvolti in questo processo e su come le loro proprietà stimolo-risposta possono cambiare nel tempo ^1,2,3. Tuttavia, mentre rimangono forti prove a sostegno della teoria della ....

Protocollo

Tutti gli esperimenti che prevedono l'uso di animali nella ricerca sono stati eseguiti in conformità con gli standard stabiliti dal National Institutes of Health e dall'International Association for the Study of Pain e sono stati approvati dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Università di Pittsburgh (protocollo #22051100). Alla fine di ogni esperimento, i ratti sono stati sottoposti a eutanasia tramite eutanasia con perfusione cardiaca di soluzione salina tamponata con fosfato ghiacciato (PBS), un approccio approvato dall'American Veterinary Medical Association e dall'Università di Pittsburgh IACUC.

1. In....

Discussione

Qui, dimostriamo un modo rapido e non invasivo di generare un ratto GECI per l'imaging del TG. Abbiamo scelto un promotore CAG per guidare e mantenere alti livelli di espressione genica. Mentre studi precedenti suggeriscono che altri sierotipi AAV possono guidare in modo efficiente l'espressione genica nei neuroni DRG³⁹, i nostri risultati sono coerenti con un recente studio che coinvolge l'iniezione intraperitoneale di AAV nei neonati³², indicando che il sierotipo AAV9 è .......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40	Addgene	100844-AAV9	AAV9-GCaMP6s virus
ACEpromazine maleate	Covetrus	11695-0095-5	10 mg/mL
AnaSed (Xylazine) injection	AKORN Animal Health	23076-35-9	20 mg/mL
CTR5500 Electronics box	Leica	11 888 820	Power Supply
Cutwell burr drill bit	Ransom & Randolph		¼ round
DM 6000 FS	Leica	11 888 928	Base Stand
EL6000	Leica	EL6000	Light source with 120 W mercury bulb
Forceps	FST	11252-00	Dumont No. 05
Friedman rongeurs	FST	16000-14	2.5 mm cup size
Friedman-Pearson rongeurs	FST	16021-14	1 mm cup size
Heating pad (Temperature therapy pad)	STRYKER	8002-062-022
Ketamine hydrochloride	Covetrus	1695-0703-1	100 mg/mL
Plan Fluor 20x/0.40	Leica	MRH00105	20x objective, 0.4 NA10.8 mm WD
Power handle high-temp cautery pen	Bovie	HIT1	handheld Change-A-Tip cautery pen
Prime 95B	Photometrics	Prime 95B	CMOS Camera
Saline	Fisher Scientific	NC0291799	0.9% Sterile Saline
Scalpel blade	Fisher Scientific	22-079-701	size 15 disposable blade
Spatula	BRI	48-1460	brain spatula
Spring scissors	FST	91500-09	Student Vannas, 5 mm cutting edge
Spring scissors	FST	15012-12	Noyes, 14 mm cutting edge
STP6000 Smart touch panel	Leica	11 501 255	Control Panel
Syringe	Hamilton	80201	25 μL Model 1702 Luer Tip syringe
Water heater	Adroit	HTP-1500