In-vivo Кальциевая визуализация сенсорных нейронов тройничного ганглия крысы

Резюме

Генетически кодируемые кальциевые индикаторы (GECI) позволяют проводить надежный анализ сигналов сенсорных нейронов на популяционном уровне. Здесь мы разработали новый подход, который позволяет визуализировать in vivo активность нейронов тройничных ганглиев крыс.

Аннотация

Генетически кодируемые индикаторы кальция (GECI) позволяют использовать методы визуализации для мониторинга изменений внутриклеточного кальция в целевых клеточных популяциях. Их большое соотношение сигнал/шум делает GECI мощным инструментом для обнаружения вызванной стимулом активности в сенсорных нейронах. GECI облегчают популяционный анализ кодирования стимулов с количеством нейронов, которые могут быть изучены одновременно. Это популяционное кодирование наиболее целесообразно выполнять in vivo. Ганглии дорсальных корешков (DRG), в которых находятся сомы сенсорных нейронов, иннервирующих соматические и висцеральные структуры ниже шеи, наиболее широко используются для визуализации in vivo , поскольку доступ к этим структурам относительно прост. Совсем недавно эта методика была использована на мышах для изучения сенсорных нейронов в тройничном ганглии (ТГ), которые иннервируют ротовые и черепно-лицевые структуры. Существует множество причин для изучения ТГ в дополнение к DRG, включая длинный список болевых синдромов, специфичных для оральных и черепно-лицевых структур, которые, по-видимому, отражают изменения в активности сенсорных нейронов, такие как невралгия тройничного нерва. Мыши наиболее широко используются при изучении нейронов DRG и TG из-за доступности генетических инструментов. Тем не менее, учитывая различия в размерах, простоте обращения и потенциально важные видовые различия, есть причины изучать TG-нейроны крыс, а не мышей. Таким образом, нами был разработан подход к визуализации TG-нейронов крыс in vivo. Мы вводили новорожденным щенкам (p2) внутрибрюшинно AAV, кодирующий GCaMP6s, что приводило к >90% инфицированию нейронов TG и DRG. ТГ визуализировалась у взрослого человека после трепанации черепа и декортикации, а изменения флуоресценции GCaMP6s отслеживались в нейронах ТГ после стимуляции нижнечелюстной и верхнечелюстной областей лица. Мы подтвердили, что увеличение флуоресценции было вызвано стимулом при блокаде периферических нервов. Несмотря на то, что этот подход имеет множество потенциальных применений, мы используем его для характеристики субпопуляции (популяций) нейронов ТГ, измененных после повреждения периферических нервов.

Введение

Соматоощущение, нейронное кодирование механических, тепловых и химических раздражителей, воздействующих на кожу или другие структуры организма, включая мышцы, кости и внутренние органы, начинается с активности первичных афферентных нейронов, которые иннервируют^{эти структуры}. Электрофизиологические подходы, основанные на единичных единицах, предоставили огромное количество информации о афферентных подтипах, участвующих в этом процессе, а также о том, как их свойства стимул-реакция могут изменяться с течением времени ^1,2,3. Тем не менее, несмотря на то, ....

протокол

Все эксперименты с использованием животных в исследованиях проводились в соответствии со стандартами, установленными Национальными институтами здравоохранения и Международной ассоциацией по изучению боли, и были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию животных Университета Питтсбурга (протокол #22051100). В конце каждого эксперимента крыс усыпляли путем обескровливания с сердечной перфузией ледяного фосфатно-солевого буфера (PBS), подход, одобренный Американской ветеринарной медицинской ассоциацией и IACUC Университета Питтсбурга.

1. Индукция GCaMP

1. Закажите беременных крыс Спрэг-....

Результаты

Поскольку ранее мы успешно использовали серотип AAV9 для инфекции сенсорных нейронов крыс¹⁵, мы использовали этот серотип для экспрессии GCaMP6 в TG-нейронах крыс. Поэтому мы сначала попытались оценить эффективность инфекции сенсорных нейронов AAV9-CAG-GCaMP6s-WPRE-SV40 (AAV9-GCaMP) при введени?.......

Обсуждение

Здесь мы демонстрируем быстрый, неинвазивный способ создания крысы GECI для визуализации ТГ. Мы выбрали CAG-промотор для стимулирования и поддержания высокого уровня экспрессии генов. В то время как предыдущие исследования показывают, что другие серотипы AAV могут эффективно управлять экс.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40	Addgene	100844-AAV9	AAV9-GCaMP6s virus
ACEpromazine maleate	Covetrus	11695-0095-5	10 mg/mL
AnaSed (Xylazine) injection	AKORN Animal Health	23076-35-9	20 mg/mL
CTR5500 Electronics box	Leica	11 888 820	Power Supply
Cutwell burr drill bit	Ransom & Randolph		¼ round
DM 6000 FS	Leica	11 888 928	Base Stand
EL6000	Leica	EL6000	Light source with 120 W mercury bulb
Forceps	FST	11252-00	Dumont No. 05
Friedman rongeurs	FST	16000-14	2.5 mm cup size
Friedman-Pearson rongeurs	FST	16021-14	1 mm cup size
Heating pad (Temperature therapy pad)	STRYKER	8002-062-022
Ketamine hydrochloride	Covetrus	1695-0703-1	100 mg/mL
Plan Fluor 20x/0.40	Leica	MRH00105	20x objective, 0.4 NA10.8 mm WD
Power handle high-temp cautery pen	Bovie	HIT1	handheld Change-A-Tip cautery pen
Prime 95B	Photometrics	Prime 95B	CMOS Camera
Saline	Fisher Scientific	NC0291799	0.9% Sterile Saline
Scalpel blade	Fisher Scientific	22-079-701	size 15 disposable blade
Spatula	BRI	48-1460	brain spatula
Spring scissors	FST	91500-09	Student Vannas, 5 mm cutting edge
Spring scissors	FST	15012-12	Noyes, 14 mm cutting edge
STP6000 Smart touch panel	Leica	11 501 255	Control Panel
Syringe	Hamilton	80201	25 μL Model 1702 Luer Tip syringe
Water heater	Adroit	HTP-1500