In-Vivo הדמיית סידן של נוירונים חושיים בגנגליון טריגמינלי של חולדה

Summary

מדדי סידן מקודדים גנטית (GECI) מאפשרים ניתוח חזק ברמת האוכלוסייה של איתות נוירונים חושי. כאן, פיתחנו גישה חדשנית המאפשרת הדמיית GECI in vivo של פעילות גרעיני גרעינים של חולדות.

Abstract

מדדי סידן מקודדים גנטית (GECIs) מאפשרים טכניקות הדמיה לניטור שינויים בסידן תוך-תאי באוכלוסיות תאים ממוקדות. יחס האות לרעש הגדול שלהם הופך את GECIs לכלי רב עוצמה לזיהוי פעילות מעוררת גירוי בנוירונים חושיים. GECIs מאפשרים ניתוח ברמת האוכלוסייה של גירוי המקודד למספר הנוירונים שניתן לחקור בו זמנית. קידוד אוכלוסייה זה נעשה בצורה המתאימה ביותר in vivo. גרעיני שורש דורסלי (DRG), המאכלסים את הסומה של נוירונים חושיים המעצבבים מבנים סומטיים וקרביים מתחת לצוואר, נמצאים בשימוש נרחב ביותר עבור דימות in vivo מכיוון שמבנים אלה נגישים בקלות יחסית. לאחרונה, טכניקה זו שימשה בעכברים לחקר נוירונים חושיים בגנגליון הטריגמינלי (TG) המעצבב מבנים אוראליים וגולגולתיים. ישנן סיבות רבות לחקור TG בנוסף ל- DRG, כולל רשימה ארוכה של תסמונות כאב ספציפיות למבני הפה והגולגולת שנראה כי הן משקפות שינויים בפעילות הנוירונים התחושתיים, כגון trigeminal neuralgia. עכברים נמצאים בשימוש נרחב ביותר במחקר של נוירונים DRG ו- TG בגלל הזמינות של כלים גנטיים. עם זאת, עם הבדלים בגודל, קלות הטיפול והבדלי מינים שעשויים להיות חשובים, יש סיבות לחקור נוירונים TG של חולדות ולא עכברים. לכן, פיתחנו גישה להדמיית תאי עצב TG של חולדות in vivo. הזרקנו לגורים ילודים (p2) תוך צפקית AAV המקודד GCaMP6s, וכתוצאה מכך נגרם זיהום של >90% הן בתאי עצב TG והן בתאי עצב DRG. TG הודגמה במבוגר לאחר קרניוטומיה ודקורציה, ושינויים בפלואורסצנטיות GCaMP6s נוטרו בנוירונים TG בעקבות גירוי של אזורים מנדיבולריים ומקסילריים של הפנים. אישרנו כי עליות פלואורסצנטיות היו מעוררות גירוי עם בלוק עצבי היקפי. בעוד שלגישה זו יש שימושים פוטנציאליים רבים, אנו משתמשים בה כדי לאפיין את תת-האוכלוסיות של נוירוני TG שהשתנו בעקבות פגיעה עצבית היקפית.

Introduction

Somatosensation, הקידוד העצבי של גירויים מכניים, תרמיים וכימיים הפוגעים בעור או במבנים גופניים אחרים, כולל שרירים, עצמות וקרביים, מתחיל בפעילות בתאי עצב ראשוניים המעצבבים מבנים אלה¹. גישות אלקטרופיזיולוגיות מבוססות יחידה אחת סיפקו שפע של מידע על תת-הסוגים המשפיעים המעורבים בתהליך זה, כמו גם כיצד תכונות הגירוי-תגובות שלהם עשויות להשתנות עם הזמן ^1,2,3. עם זאת, בעוד שנותרו ראיות חזקות התומכות בתיאוריית הקו המסומן, אשר מציעה כי שיטות חושיות ספציפיות מועברות על-ידי תת-אוכלוסיות ספציפיות של נוירונים, היכולת של תת-אוכלוסיות רבות של תאי עצב להגיב לאותם סוגים של גירויים מכניים, תרמיים וכימיים מצביעה על כך שרוב הגירויים הסומטוסנסוריים מקודדים על-ידי תת-אוכלוסיות מרובות של תאי עצב^{4, 5}. לכן, הבנה טובה יותר של somatosensation תגיע רק עם היכולת לחקור את הפעילות של 10, אם לא מאות, של נוירונים בו זמנית.

ההתקדמות בגישות אופטיות עם הופעתן לאחרונה יחסית של טכניקות הדמיה קונפוקליות, ולאחר מכן, מולטיפוטונים ודיגיטליים אפשרו את היכולת לבצע ניתוחים לא פולשניים יחסית ברמת האוכלוסייה של פעילות עצבית ^6,7. אחד המכשולים האחרונים ביישום טכנולוגיה זו היה פיתוח כלים המאפשרים הערכה אופטית של פעילות עצבית. בהתחשב במהירות של פוטנציאל פעולה שיכול להתחיל ולהסתיים בפחות מאלפית השנייה, צבע רגיש למתח עם היכולת לעקוב אחר שינויים בפוטנציאל הממברנה במהירות של פוטנציאל פעולה יהיה הכלי האידיאלי למטרה זו. אולם בעוד שחלה התקדמות עצומה בתחום זה 7,8,9,10, יחס האות לרעש עבור רבים מהצבעים האלה עדיין אינו גבוה מספיק כדי לאפשר ניתוח אוכלוסייה של מאות תאי עצב ברמת התא הבודד. כגישה חלופית, החוקרים פנו לניטור שינויים בריכוז Ca²⁺ תוך תאי ([Ca²⁺]_i). המגבלות באסטרטגיה זו היו ברורות מלכתחילה וכוללות את העובדה שעלייה ב-[Ca²⁺]_i היא מדד עקיף לפעילות עצבית¹¹; שעלייה ב-[Ca²⁺]_i עשויה להתרחש ללא תלות בזרם Ca²⁺ הקשור להפעלת ערוצי Ca²⁺ מגודרים במתח (VGCCs)^12,13; שהגודל ומשך הזמן של ארעי Ca²⁺ ניתנים לשליטה על ידי תהליכים שאינם תלויים בפעילות VGCC 11,12,14; וכי מהלך הזמן של Ca²⁺ transients עולה בהרבה על זה של פוטנציאל פעולה¹⁵. עם זאת, ישנם מספר יתרונות משמעותיים הקשורים לשימוש Ca²⁺ כמדד עקיף של פעילות עצבית. לא פחות מהם הוא יחס האות לרעש הקשור לרוב מחווני Ca²⁺, המשקף הן את גודל השינוי ב- Ca²⁺ תוך תאי והן את העובדה שהאות נובע מהמרחב התלת-ממדי של הציטוזול ולא מהמרחב הדו-ממדי של קרום התא. יתר על כן, עם הפיתוח של אינדיקטורים Ca²⁺ מקודדים גנטית (GECI's), ניתן לנצל אסטרטגיות גנטיות כדי להניע את הביטוי של אינדיקטורים Ca²⁺ בתת-אוכלוסיות ספציפיות של תאים, להקל על ניתוח ברמת האוכלוסייה בהכנות שלמות (למשל, ראה¹⁶).

בהתחשב במספר הכלים הגנטיים הזמינים כיום בעכברים, אין זה מפתיע ש- GECI נמצא בשימוש נרחב ביותר במין זה. קווי עכבר עם ביטוי GECI מכונן בתת-אוכלוסיות של נוירונים חושיים פותחו ^7,16,17. עם התפתחות קווי עכבר המבטאים רקומבינאזות בסוגי תאים ספציפיים, ניתן להשתמש באסטרטגיות מתוחכמות עוד יותר כדי לשלוט בביטוי GECI¹⁵. עם זאת, בעוד שהכלים האלה חזקים יותר מאי פעם, ישנן מספר סיבות לכך שמינים אחרים, כמו חולדות, עשויים להתאים יותר לשאלות ניסוייות מסוימות. אלה כוללים את הגודל הגדול יותר, המאפשר מספר מניפולציות ניסיוניות שקשות, אם לא בלתי אפשריות, בעכבר הקטן יותר; קלות אילוף חולדות במשימות התנהגותיות מורכבות יחסית; ולפחות כמה ראיות לכך שתכונות ביופיזיות ודפוסי ביטוי של כמה תעלות יונים בנוירונים חושיים של חולדות עשויים להיות דומים יותר לאלה שנצפו בנוירונים חושיים אנושיים מאשר אותם ערוצים בעכבר ביחס לבני אדם¹⁸.

בעוד שהטרנסדוקציה של גירויים סומטוסנסוריים מתרחשת בדרך כלל במסופים ההיקפיים של האפרנטים הראשוניים, פוטנציאל הפעולה המתחיל בפריפריה חייב לעבור דרך המבנה המאכלס סומאטה אפרנטית ראשונית, המכונה גרעיני שורש גבי (DRG) או טריגמינל (TG) לפני שהוא מגיע למערכת העצבים המרכזית¹⁹. בעוד שישנן ראיות לכך שלא כל פוטנציאל פעולה המתפשט לאורך אקסון אפירנט ראשוני יפלוש לגוף התא²⁰, תוצאה של העובדה שהסומטה האפרנטית הראשונית מחוברת לאקסון האמפרנט הראשי דרך צומת T¹⁹, נראה שרוב פוטנציאלי הפעולה המופעלים בפריפריה פולשים לסומה²¹. זה מעניק שלושה יתרונות ניסיוניים בעת שימוש ב- GECIs כדי להעריך קידוד אוכלוסייה ב- afferents ראשוניים: הגודל הגדול של גוף התא ביחס לאקסונים מגדיל עוד יותר את האות לרעש בעת שימוש ב- [Ca²⁺]_i כמדד עקיף לפעילות afferent; DRG הם בדרך כלל קל לגישה; והערכת הפעילות באתר המרוחק מרחבית מהטרמינלים האפרנטיים ממזערת את ההשפעה הפוטנציאלית של הניתוח הדרוש לחשיפת הגרעינים על תכונות הגירוי-תגובה של הטרמינלים האפרנטיים. עם זאת, מאחר שTG ממוקמים מתחת למוח (או מעל לוח הצבעים), הם הרבה יותר קשים לגישה מאשר DRG. יתר על כן, בעוד שיש קווי דמיון רבים בין נוירונים DRG ונוירונים TG, יש רשימה הולכת וגדלה של הבדלים גם כן. זה כולל את הארגון הסומטוטופי בערך של תאי עצב ב- TG²², מבנים ייחודיים עצביים, דפוסי סיום מסוף מרכזי שונים 23,24,25,26, וכעת רשימה הולכת וגדלה של הבדלים הן בביטוי גנים ^27,28 והן בביטוי קולטן פונקציונלי²⁹. בנוסף, מכיוון שאנו מתעניינים בזיהוי מנגנונים היקפיים של כאב, המספר הגדול יחסית של תסמונות כאב שנראות ייחודיות למערכת הטריגמינלית (למשל, מיגרנה, נוירלגיה טריגמינלית, תסמונת הפה השורף) שנראות כמערבות פעילות חריגה בגורמים ראשוניים 30,31,32, מצביע על כך שיש לחקור את TG ישירות.

לכן, בעוד תכונות גירוי-תגובה של נוירונים TG נחקרו עם GECIs בעכבר¹⁶, מאחר שהסיבות המפורטות לעיל מצביעות על כך שהחולדה עשויה להיות מין מתאים יותר לענות על מגוון שאלות ניסוייות, מטרת המחקר הנוכחי הייתה לפתח גישה לשימוש ב-GECIs לחקר נוירוני TG בחולדה. כדי להשיג זאת, השתמשנו בגישה ויראלית כדי להניע את הביטוי של GECI GCaMP6s במערכת העצבים ההיקפית. לאחר מכן הסרנו את המוח הקדמי כדי לאפשר גישה ל-TG. לבסוף, גירויים מכניים ותרמיים הוחלו על הפנים בעוד תגובות עצביות הוערכו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. יחד, נתונים אלה תומכים בתפקיד של ניצול החולדה לחקר שינויים בTG במצבים רבים, ומרחיבים את ארגז הכלים לחוקרים המעוניינים בקידוד חושי במערכת הטריגמינלית.

Protocol

כל הניסויים הכרוכים בשימוש בבעלי חיים במחקר בוצעו בהתאם לסטנדרטים שנקבעו על ידי המכונים הלאומיים לבריאות והאגודה הבינלאומית לחקר הכאב ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת פיטסבורג (פרוטוקול #22051100). בסוף כל ניסוי, חולדות הומתו באמצעות הרדמה עם זילוח לב של מלח חוצץ פוספט קר כקרח (PBS), גישה שאושרה על ידי האגודה האמריקאית לרפואה וטרינרית ואוניברסיטת פיטסבורג IACUC.

1. אינדוקציה GCaMP

1. הזמינו חולדות Sprague Dawley בהריון בזמן כדי שניתן יהיה להזריק גורים בזמן המתאים לאחר ההמלטה.
2. רססו את הכפפות ב-70% EtOH לפני הטיפול בכל גור חולדה. זה ירתיע את הסכר מקניבליזציה של הצעירים.
3. גורים של חולדות מטושות (P1-2) עם 70% EtOH ומרדימים על קרח למשך 3 דקות.
4. יש להזריק 15 μL של AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40 (Addgene) תוך צפקית באמצעות מזרק המילטון סטרילי אטום לגז בגודל 25 μL.

2. ניתוח חשיפה לגנגליון טריגמינלי

1. יש לתת קוקטייל הרדמה (55 מ"ג/ק"ג קטמין, 5.5 מ"ג/ק"ג קסילזין, 1 מ"ג/ק"ג אצפרומזין) תוך צפקית על בסיס משקל הגוף לחולדות בנות 6-8 שבועות (כ-150-200 גרם).
   הערה: זה בדרך כלל מספיק כדי לשמור על מישור כירורגי של הרדמה כפי שמוערך על ידי היעדר רפלקס נסיגה לצביטה מזיקה של כף אחורית. עם זאת, להשלים עם isoflurane דרך חרוט האף אם החיות הופכות לאור.
2. לאחר הרדמה מלאה, לגלח את השיער ואת שפם הראש והפנים.
3. הרכיבו את החולדה על מסגרת סטריאוטקסית עם מוטות אוזניים והניחו כרית חימום (~ 37 ^oC) מתחתיה כדי לשמור על טמפרטורת הגוף.
4. עקוב אחר סימנים חיוניים (קצב לב, קצב נשימה, רוויית חמצן בדם) באמצעות מד חמצן עכברי או דומה.
   הערה: טמפרטורת הגוף מנוטרת על ידי בדיקה רקטלית ומתוחזקת על ידי הנחת חולדות על שמיכת מים במחזור מבוקרת משוב.
5. מניחים גזה טבולה במי מלח קרים כקרח על הראש כדי לכווץ את כלי הדם כדי למזער דימום. בעזרת אזמל בגודל 15, יש לבצע חתך בקו האמצע של העור והשריר מעל הגולגולת.
6. השתמש בדיסקציה קהה של העור והשריר כדי לחשוף את הגולגולת.
7. בעזרת מקדח עגול של 1/4, נקבו בזהירות את כובע הגולגולת כדי לחשוף את המוח הקדמי. לאחר מכן, השתמש rongeurs (2.5 מ"מ) כדי לחתוך בזהירות דרך הגולגולת.
8. בעזרת אזמל בגודל 15 מבצעים חתך במוח (ברגמה: 3.80-) ובפקעת הריח.
   הערה: חיתוך זהיר יותר מעבר לנקודה זו יגרום למוות של חולדות
9. השתמש במרית כדי לנתק בזהירות את הדורה מהגולגולת והרים בעדינות את המוח הכרות כדי לחשוף את TG ואת בסיס הגולגולת.
   הערה: שימוש נוסף בזילוח מי מלח קרים כקרח לאורך כל המיצוי ימזער דימום וימטב את שדה הדיסקציה הבא.
10. באמצעות עט צריבה, לעצור כל דימום כתוצאה מהשאיבה.
    הערה: חיתוך הדורה יגרום לדימום בלתי נמנע. עדיף להכין aCSF קר כקרח (119 mM NaCl, 26.2 mM NaHCO₃, 2.5 mM KCl, 1 mM NaH₂PO₄, 1.3 mM MgCl₂, 10 mM גלוקוז, 2.5 mM CaCl₂) כדי לרחוץ את חלל הגולגולת כדי לעזור לכווץ את כלי הדם תוך שמירה על בריאות עצבית.

3. הדמיה GCaMP6s

הערה: בהתחשב בגודל ובצפיפות של נוירונים אלה, מערכת ההדמיה ורכישת הנתונים המשמשת (אובייקטיבית, מיקרוסקופ, מקור אור, מצלמה) תקבע את מספר תאי ^GECI+ המוצגים באופן חזותי. מקור האור, המטרה והמצלמה יקבעו גם את הפרמטרים המשמשים לרכישת תמונה, כולל זמן חשיפה וקצב לכידת תמונה. בעוד שניתן להשתמש בטכניקות מולטיפוטון וקונפוקליות בהתאם לפרמטרים של הניסוי, מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי עשוי להספיק כדי לפתור תאים רבים. ניתן להשתמש בכל חבילת רכישת תמונות. באופן אידיאלי, יישום הגירוי נעול בזמן עם חבילת התוכנה לרכישת תמונות.

1. מקמו את חלל הגולגולת מתחת למטרה והביאו את TG למיקוד באמצעות אור נראה.
2. אורך גל העירור של GCaMP6s הוא 496 ננומטר, ואורך גל הפליטה שלו הוא 513 ננומטר; לכן, השתמש בקוביות הדיכרואיות והסינון המתאימות כדי לאתר תאי GCaMP⁺ . התאימו את המיקוד כדי לאתר ולפתור את אזור הגרעינים שבו תאי עצב מגיבים לגירויים המופעלים על שדה הקלט של העניין.
3. השתמש במטרה של 10x כדי לאפשר הדמיות של רוב תאי העצב בTG המגיבים לגירויים מכניים המופעלים על אזור 1 ס"מ² של הפנים¹⁶. השתמש במטרה יבשה פי 20 עם מרחק עבודה ארוך (10.8 מ"מ) כדי להגדיל את הרזולוציה.
4. השתמש בתוכנת רכישה (למשל, Metamorph) כדי לאסוף נתונים פלואורסצנטיים לאורך זמן ובתגובה ליישום גירוי.
   1. כדי למזער את הלבנת האור של הנוירונים, השתמש בזמן חשיפה קצר ככל האפשר כדי לזהות את קו הבסיס ואת העלייה המעוררת פלואורסצנטיות. עם מטרת אוויר של 20x, 0.40 NA, מקור אור כספית הליד של 120 ואט ומצלמת מוליכים למחצה משלימה של תחמוצת מתכת (CMOS) ששימשה במחקר הנוכחי, זמן חשיפה של 300 אלפיות השנייה, וקצב קליטת תמונה של 3 הרץ, משיגים הקלטות בסיסיות יציבות במשך >90 דקות.
      הערה: 1) פרמטרים אלה של רכישת תמונה חייבים להיקבע באופן אמפירי. 2) מכני (מברשת, ניקוב, רטט, צביטה), תרמי (חום וקור), וכימי (קפסאיצין, מנטול, מתווכי דלקת) ניתן ליישם על שדה הקלט. גישה סובייקטיבית זולה יחסית היא ליישם את הגירויים ביד. עם זאת, מומלץ להשתמש בגישות אובייקטיביות וניתנות לשחזור יותר, שבהן ניתן להשתמש במפעילים מבוקרי משוב ליישום חוזר ונשנה בכוח ידוע. בעוד שהתקני פלטייה מבוקרי משוב שימושיים לחימום וקירור מבוקרים, הם אינם אידיאליים לגירוי תרמי של פנים מעוקלות. מקורות אור אינפרא אדום מבוקרי משוב הם חלופה לחימום, וספריי קר הוא חלופה פחות מאידיאלית לקירור.

תוצאות

מאחר שבעבר הייתה לנו הצלחה עם סרוטיפ AAV9 לזיהום של נוירונים חושיים¹⁵ של חולדות, השתמשנו בסרוטיפ הזה לביטוי של GCaMP6s בתאי עצב TG של חולדות. לכן ביקשנו תחילה להעריך את יעילות הזיהום של תאי עצב חושיים של AAV9-CAG-GCaMP6s-WPRE-SV40 (AAV9-GCaMP) כאשר הנגיף הזה ניתן לגורי חולדות בילודים²⁰. ויר...

Discussion

כאן, אנו מדגימים דרך מהירה ולא פולשנית ליצירת חולדת GECI לצורך הדמיה של TG. בחרנו בפרומוטור CAG כדי להניע ולשמור על רמות גבוהות של ביטוי גנים. בעוד שמחקרים קודמים מצביעים על כך שסרוטיפים אחרים של AAV עשויים להניע ביעילות ביטוי גנים בנוירוני DRG³⁹, התוצאות שלנו עולות בקנה אחד עם מחקר שנ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40	Addgene	100844-AAV9	AAV9-GCaMP6s virus
ACEpromazine maleate	Covetrus	11695-0095-5	10 mg/mL
AnaSed (Xylazine) injection	AKORN Animal Health	23076-35-9	20 mg/mL
CTR5500 Electronics box	Leica	11 888 820	Power Supply
Cutwell burr drill bit	Ransom & Randolph		¼ round
DM 6000 FS	Leica	11 888 928	Base Stand
EL6000	Leica	EL6000	Light source with 120 W mercury bulb
Forceps	FST	11252-00	Dumont No. 05
Friedman rongeurs	FST	16000-14	2.5 mm cup size
Friedman-Pearson rongeurs	FST	16021-14	1 mm cup size
Heating pad (Temperature therapy pad)	STRYKER	8002-062-022
Ketamine hydrochloride	Covetrus	1695-0703-1	100 mg/mL
Plan Fluor 20x/0.40	Leica	MRH00105	20x objective, 0.4 NA10.8 mm WD
Power handle high-temp cautery pen	Bovie	HIT1	handheld Change-A-Tip cautery pen
Prime 95B	Photometrics	Prime 95B	CMOS Camera
Saline	Fisher Scientific	NC0291799	0.9% Sterile Saline
Scalpel blade	Fisher Scientific	22-079-701	size 15 disposable blade
Spatula	BRI	48-1460	brain spatula
Spring scissors	FST	91500-09	Student Vannas, 5 mm cutting edge
Spring scissors	FST	15012-12	Noyes, 14 mm cutting edge
STP6000 Smart touch panel	Leica	11 501 255	Control Panel
Syringe	Hamilton	80201	25 μL Model 1702 Luer Tip syringe
Water heater	Adroit	HTP-1500