体内 大鼠三叉神经节感觉神经元的钙成像

摘要

基因编码钙指示剂 （GECI） 能够对感觉神经元信号传导进行稳健的群体水平分析。在这里，我们开发了一种新方法，可以对大鼠三叉神经节神经元活动进行 体内 GECI可视化。

摘要

基因编码钙指示剂 （GECI） 使成像技术能够监测靶细胞群中细胞内钙的变化。其大信噪比使GECI成为检测感觉神经元中刺激诱发活动的有力工具。GECI有助于对刺激编码的群体水平分析，以及可以同时研究的神经元数量。这种群体编码在 体内进行最合适。背根神经节 （DRG） 容纳了支配颈部以下躯体和内脏结构的感觉神经元体体，最广泛地用于 体内 成像，因为这些结构相对容易进入。最近，该技术被用于小鼠研究三叉神经节（TG）中支配口腔和颅面结构的感觉神经元。除了 DRG 之外，研究 TG 的原因还有很多，包括一长串特定于口腔和颅面结构的疼痛综合征，这些综合征似乎反映了感觉神经元活动的变化，例如三叉神经痛。由于遗传工具的可用性，小鼠在 DRG 和 TG 神经元的研究中使用最广泛。然而，由于大小的差异、易于处理的程度以及潜在的重要物种差异，有理由研究大鼠而不是小鼠 TG 神经元。因此，我们开发了一种 在体内对大鼠TG神经元进行成像的方法。我们腹膜内注射了编码 GCaMP6 的 AAV 给新生儿幼崽 （p2），导致 >90% 的 TG 和 DRG 神经元感染。开颅手术和去皮后在成人中观察到 TG，并在刺激面部下颌和上颌区域后监测 TG 神经元中 GCaMP6 荧光的变化。我们证实，荧光的增加是由周围神经阻滞诱发的刺激引起的。虽然这种方法有许多潜在的用途，但我们正在用它来表征周围神经损伤后改变的TG神经元的亚群。

引言

躯体感觉是影响皮肤或其他身体结构（包括肌肉、骨骼和内脏）的机械、热和化学刺激的神经编码，始于支配这些结构的初级传入神经元^{的活动 1}。基于单单元的电生理学方法提供了有关该过程所涉及的传入亚型以及它们的刺激反应特性如何随时间变化的大量信息^1,2,3。然而，虽然仍然有强有力的证据支持标记线理论，该理论表明特定的感觉模式是由特定的神经元亚群传达的，但许多神经元亚群对相同类型的机械、热和化学刺激做出反应的能力表明，大多数体感刺激是由多个神经元亚群编码^{的 4，5}.因此，要更好地理解躯体感觉，就必须同时研究10个（如果不是数百个）神经元的活动。

随着最近共聚焦以及随后的多光子和数字成像技术的出现，光学方法的进步促进了对神经元活动进行相对非侵入性群体水平分析的能力^6,7。该技术应用的最后一个障碍是开发能够对神经活动进行光学评估的工具。鉴于动作电位的速度可以在不到一毫秒的时间内开始和结束，能够以动作电位的速度跟踪膜电位变化的电压敏感染料将是实现此目的的理想工具。但是，尽管在^7,8,9,10这一领域取得了巨大进展，但其中许多染料的信噪比仍然不够高，无法在单细胞水平上对数百个神经元进行群体分析。作为替代方法，研究人员已转向监测细胞内 Ca²⁺ 浓度 （[Ca²⁺]_i） 的变化。这种策略的局限性从一开始就很明显，包括 [Ca²⁺]_i 的增加是神经活动的间接测量¹¹;[Ca²⁺]_i 的增加可能与与电压门控 Ca²⁺ 通道 （VGCC） 激活相关的 Ca²⁺ 流入无关^12,13;Ca²⁺瞬变的幅度和持续时间可以由独立于VGCC活动的过程控制11,12,14;并且 Ca²⁺ 瞬变的时间过程远远超过动作电位¹⁵ 的时间过程。然而，使用 Ca²⁺ 作为神经活动的间接测量具有许多显着优势。其中最重要的是与大多数 Ca²⁺ 指标相关的信噪比，它反映了细胞内 Ca²⁺ 变化的幅度以及信号来自胞质溶胶的三维空间而不是细胞膜的二维空间这一事实。此外，随着遗传编码的 Ca²⁺ 指示剂 （GECI） 的发展，可以利用遗传策略来驱动 Ca²⁺ 指示剂在特定细胞亚群中的表达，从而促进完整制剂中的群体水平分析（例如，参见¹⁶）。

鉴于现在在小鼠中可用的遗传工具的数量，GECI在该物种中被最广泛地使用也就不足为奇了。在感觉神经元亚群中具有组成型 GECI 表达的小鼠系已被开发出来 ^7,16,17。随着在特定细胞类型中表达重组酶的小鼠品系的发展，可以使用更复杂的策略来控制GECI表达¹⁵。然而，虽然这些工具越来越强大，但有很多原因可以解释为什么其他物种，如老鼠，可能更适合一些实验问题。这些包括更大的尺寸，促进了许多实验操作，这些操作在较小的小鼠中是困难的，如果不是不可能的话;训练大鼠完成相对复杂的行为任务的便利性;至少有一些证据表明，大鼠感觉神经元中几种离子通道的生物物理特性和表达模式可能与在人类感觉神经元中观察到的更相似，而不是在小鼠中相对于人类¹⁸的相同通道。

虽然躯体感觉刺激的转导通常发生在初级传入神经的外周末梢，但在外周启动的动作电位必须通过容纳初级传入体细胞的结构，称为背根 （DRG） 或三叉神经 （TG） 神经节，然后才能到达中枢神经系统¹⁹。虽然有证据表明，并非每个沿初级传入轴突传播的动作电位都会侵入细胞体²⁰，这是由于初级传入体体通过T型连接¹⁹连接到主传入轴突，因此在外周启动的大多数动作电位似乎侵入了体细胞²¹.当使用 GECI 评估初级传入细胞中的群体编码时，这赋予了三个实验优势：当使用 [Ca²⁺]_i 作为传入活动的间接测量时，相对于轴突的细胞体尺寸较大，进一步增加了信噪比;DRG 通常易于访问;在空间上远离传入末梢的部位评估活动，可以最大限度地减少暴露神经节所需的手术对传入末梢刺激-反应特性的潜在影响。然而，由于 TG 位于大脑下方（或调色板上方），因此它们比 DRG 更难获得。此外，虽然 DRG 和 TG 神经元之间有许多相似之处，但差异也越来越多。这包括 TG²² 中神经元的大致体位组织、支配的独特结构、不同的中央末端终止模式^{23、24、25、26}，以及现在基因表达^27,28 和功能受体表达²⁹ 的越来越多的差异列表.此外，由于我们对疼痛的外周机制的鉴定感兴趣，因此似乎有大量三叉神经系统特有的疼痛综合征（例如，偏头痛、三叉神经痛、灼口综合征）似乎涉及初级传入神经的异常活动^30,31,32，这表明需要直接研究 TG。

因此，虽然已经用小鼠 GECI 研究了 TG 神经元的刺激-反应特性¹⁶，但由于上面列出的原因表明大鼠可能是更适合解决各种实验问题的物种，本研究的目的是开发一种使用 GECI 研究大鼠 TG 神经元的方法。为了实现这一目标，我们利用病毒方法来驱动 GECI GCaMP6 在周围神经系统中的表达。然后，我们移除了前脑以允许访问TG。最后，将机械和热刺激施加到面部，同时在荧光显微镜下评估神经元反应。总之，这些数据支持利用大鼠在许多状态下研究 TG 的变化，为对三叉神经系统中的感觉编码感兴趣的研究人员扩展了工具包。

研究方案

所有涉及在研究中使用动物的实验均按照美国国立卫生研究院和国际疼痛研究协会提出的标准进行，并得到匹兹堡大学机构动物护理和使用委员会（协议#22051100）的批准。在每个实验结束时，通过用冰冷的磷酸盐缓冲盐水（PBS）进行心脏灌注对大鼠进行安乐死，这种方法得到了美国兽医协会和匹兹堡大学IACUC的批准。

1. GCaMP 感应

1. 订购怀孕的 Sprague Dawley 大鼠，以便幼崽可以在出生后的适当时间注射。
2. 在处理每只大鼠幼崽之前，用 70% 的 EtOH 喷洒手套。这将阻止大坝蚕食年轻人。
3. 用70%EtOH擦拭大鼠幼崽（P1-2），并在冰上麻醉3分钟。
4. 使用 25 μL 无菌气密 Hamilton 注射器腹膜内注射 15 μL AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40（Addgene）。

2. 三叉神经节暴露手术

1. 根据体重对6-8周龄大鼠（约150-200g）腹膜内施用麻醉混合物（55mg / kg氯胺酮，5.5mg / kg甲苯噻嗪，1mg / kg乙酰丙嗪）。
   注意：这通常足以维持手术麻醉平面，通过没有对后爪有害捏合的退缩反射来评估。但是，如果动物变轻，则通过鼻锥补充异氟烷。
2. 完全麻醉后，剃掉头部和面部的头发和胡须。
3. 将大鼠安装到带有耳杆的立体定位框架上，并在下面放置加热垫（~37 ^oC）以保持体温。
4. 使用鼠标血氧仪或类似仪器监测生命体征（心率、呼吸频率、血氧饱和度）。
   注意：体温由直肠探头监测，并通过将大鼠放在反馈控制的循环水毯上来维持。
5. 将蘸有冰冷盐水的纱布放在头部，以收缩血管以尽量减少出血。使用 15 号手术刀，在颅骨上方的皮肤和肌肉上做一个中线切口。
6. 使用皮肤和肌肉的钝解剖来暴露颅骨。
7. 使用 1/4 圆形钻头，小心地在颅骨上穿孔以露出前脑。然后，使用rongeurs（2.5毫米杯）小心地切开头骨。
8. 使用 15 号手术刀在大脑（Bregma：-3.80）和嗅球上切开一个切口。
   注意：超过这一点的尾部切割将导致老鼠死亡
9. 用刮刀小心地将硬脑膜与颅骨断开，轻轻提起被切断的大脑，露出颅底的TG和颅底。
   注意：在整个提取过程中额外使用冰冷盐水灌注将最大限度地减少出血并优化以下解剖区域。
10. 使用烧灼笔，止除拔牙引起的任何出血。
    注意：切割硬脑膜将导致不可避免的出血。最好制备冰冷的 aCSF（119 mM NaCl、26.2 mM NaHCO₃、2.5 mM KCl、1 mM NaH₂PO₄、1.3 mM MgCl₂、10 mM 葡萄糖、2.5 mM CaCl₂）沐浴颅腔，以帮助收缩血管，同时保持神经元健康。

3. GCaMP6s成像

注意：鉴于这些神经元的大小和密度，使用的成像和数据采集系统（物镜、显微镜、光源、相机）将确定可视化的 GECI⁺ 细胞的数量。光源、物镜和相机还将决定用于图像采集的参数，包括曝光时间和图像捕获速率。虽然根据实验参数可以使用多光子和共聚焦技术，但落射荧光显微镜可能足以解析许多细胞。可以使用任何图像采集包。理想情况下，激励应用与图像采集软件包进行时间锁定。

1. 将颅骨腔放在物镜下方，并使用可见光使TG聚焦。
2. GCaMP6s的激发波长为496 nm，发射波长为513 nm;因此，使用适当的二向色性和滤波立方体来定位 GCaMP⁺ 细胞。调整焦点以定位和解析神经节区域，其中神经元对施加到感兴趣感受野的刺激做出反应。
3. 使用 10 倍物镜可实现 TG 中大多数神经元对施加到面部 1 cm² 区域的机械刺激做出反应的可视化¹⁶。使用工作距离长 （10.8 mm） 的 20 倍干物镜以提高分辨率。
4. 使用采集软件（例如，Metamorph）收集随时间变化的荧光数据，并响应刺激应用。
   1. 为了尽量减少神经元的光漂白，请使用尽可能短的曝光时间来检测基线和诱发的荧光增加。使用本研究中使用的 20 倍、0.40 NA 空气物镜、120 W 卤化汞光源和互补金属氧化物半导体 （CMOS） 相机，曝光时间为 300 ms，图像采集速率为 3 Hz，可获得 >90 分钟的稳定基线记录。
      注：1）这些图像采集参数必须根据经验确定。2）机械（刷子、点状、振动、捏）、热（热和冷）和化学（辣椒素、薄荷醇、炎症介质）可以应用于感受野。一种相对便宜的主观方法是用手施加刺激。然而，建议采用更客观和可重复的方法，其中反馈控制执行器可用于在已知力下重复应用。虽然反馈控制的帕尔贴器件可用于受控加热和冷却，但它们并不适用于曲面的热刺激。反馈控制的红外光源是加热的替代方案，而冷喷雾是不太理想的冷却替代方案。

结果

由于我们之前已成功使用AAV9血清型感染大鼠感觉神经元¹⁵，因此我们将该血清型用于大鼠TG神经元中GCaMP6s的表达。因此，我们首先试图评估 AAV9-CAG-GCaMP6s-WPRE-SV40 （AAV9-GCaMP） 对新生大鼠幼崽施用该病毒时的感觉神经元感染效率²⁰。该病毒利用CAG启动子，该启动子驱动和维持高水平的基因表达。此外，AAV9已被证明在给予新生大鼠时可以有效地感染感觉神经元

讨论

在这里，我们展示了一种快速、非侵入性的方法，用于生成用于 TG 成像的 GECI 大鼠。我们选择了CAG启动子来驱动和维持高水平的基因表达。虽然先前的研究表明其他 AAV 血清型可以有效地驱动 DRG 神经元中的基因表达³⁹，但我们的结果与最近一项涉及在新生儿腹膜内注射 AAV^{的研究一致 32}，表明 AAV9 血清型在大鼠新生儿感觉神经元感染中非常有效。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40	Addgene	100844-AAV9	AAV9-GCaMP6s virus
ACEpromazine maleate	Covetrus	11695-0095-5	10 mg/mL
AnaSed (Xylazine) injection	AKORN Animal Health	23076-35-9	20 mg/mL
CTR5500 Electronics box	Leica	11 888 820	Power Supply
Cutwell burr drill bit	Ransom & Randolph		¼ round
DM 6000 FS	Leica	11 888 928	Base Stand
EL6000	Leica	EL6000	Light source with 120 W mercury bulb
Forceps	FST	11252-00	Dumont No. 05
Friedman rongeurs	FST	16000-14	2.5 mm cup size
Friedman-Pearson rongeurs	FST	16021-14	1 mm cup size
Heating pad (Temperature therapy pad)	STRYKER	8002-062-022
Ketamine hydrochloride	Covetrus	1695-0703-1	100 mg/mL
Plan Fluor 20x/0.40	Leica	MRH00105	20x objective, 0.4 NA10.8 mm WD
Power handle high-temp cautery pen	Bovie	HIT1	handheld Change-A-Tip cautery pen
Prime 95B	Photometrics	Prime 95B	CMOS Camera
Saline	Fisher Scientific	NC0291799	0.9% Sterile Saline
Scalpel blade	Fisher Scientific	22-079-701	size 15 disposable blade
Spatula	BRI	48-1460	brain spatula
Spring scissors	FST	91500-09	Student Vannas, 5 mm cutting edge
Spring scissors	FST	15012-12	Noyes, 14 mm cutting edge
STP6000 Smart touch panel	Leica	11 501 255	Control Panel
Syringe	Hamilton	80201	25 μL Model 1702 Luer Tip syringe
Water heater	Adroit	HTP-1500