体内 大鼠三叉神经节感觉神经元的钙成像

摘要

基因编码钙指示剂 （GECI） 能够对感觉神经元信号传导进行稳健的群体水平分析。在这里，我们开发了一种新方法，可以对大鼠三叉神经节神经元活动进行 体内 GECI可视化。

摘要

基因编码钙指示剂 （GECI） 使成像技术能够监测靶细胞群中细胞内钙的变化。其大信噪比使GECI成为检测感觉神经元中刺激诱发活动的有力工具。GECI有助于对刺激编码的群体水平分析，以及可以同时研究的神经元数量。这种群体编码在 体内进行最合适。背根神经节 （DRG） 容纳了支配颈部以下躯体和内脏结构的感觉神经元体体，最广泛地用于 体内 成像，因为这些结构相对容易进入。最近，该技术被用于小鼠研究三叉神经节（TG）中支配口腔和颅面结构的感觉神经元。除了 DRG 之外，研究 TG 的原因还有很多，包括一长串特定于口腔和颅面结构的疼痛综合征，这些综合征似乎反映了感觉神经元活动的变化，例如三叉神经痛。由于遗传工具的可用性，小鼠在 DRG 和 TG 神经元的研究中使用最广泛。然而，由于大小的差异、易于处理的程度以及潜在的重要物种差异，有理由研究大鼠而不是小鼠 TG 神经元。因此，我们开发了一种 在体内对大鼠TG神经元进行成像的方法。我们腹膜内注射了编码 GCaMP6 的 AAV 给新生儿幼崽 （p2），导致 >90% 的 TG 和 DRG 神经元感染。开颅手术和去皮后在成人中观察到 TG，并在刺激面部下颌和上颌区域后监测 TG 神经元中 GCaMP6 荧光的变化。我们证实，荧光的增加是由周围神经阻滞诱发的刺激引起的。虽然这种方法有许多潜在的用途，但我们正在用它来表征周围神经损伤后改变的TG神经元的亚群。

引言

躯体感觉是影响皮肤或其他身体结构（包括肌肉、骨骼和内脏）的机械、热和化学刺激的神经编码，始于支配这些结构的初级传入神经元^{的活动 1}。基于单单元的电生理学方法提供了有关该过程所涉及的传入亚型以及它们的刺激反应特性如何随时间变化的大量信息^1,2,3。然而，虽然仍然有强有力的证据支持标记线理论，该理论表明特定的感觉模式是由特定的神经元亚群传达的，但许多神经元亚群对相同类型的机械、热和化学刺激做出反应的能力表明，大多数体感刺激是由多个神经元亚群编码^{的 4，5}.因此，要更好地理解躯体感觉，就必须同时研究10个（如果不是数百个）神经元的活动。

随着最近共聚焦以及随后的多光子和数字成像技术的出现，光学方法的进步促进了对神经元活动进行相对非侵入性群体水平分析的能力^6,7。该技术应用的最后一个障碍是开发能够对神经活动进行光学评估的工具。鉴于动作电位的速度可以在不到一毫秒的时间内开始和结束，能够以动作电位的速度跟踪膜电位变化的电压敏....

研究方案

所有涉及在研究中使用动物的实验均按照美国国立卫生研究院和国际疼痛研究协会提出的标准进行，并得到匹兹堡大学机构动物护理和使用委员会（协议#22051100）的批准。在每个实验结束时，通过用冰冷的磷酸盐缓冲盐水（PBS）进行心脏灌注对大鼠进行安乐死，这种方法得到了美国兽医协会和匹兹堡大学IACUC的批准。

1. GCaMP 感应

1. 订购怀孕的 Sprague Dawley 大鼠，以便幼崽可以在出生后的适当时间注射。
2. 在处理每只大鼠幼崽之前，用 70% 的 EtOH 喷洒手套。这将阻止大坝蚕食年轻人。
3. 用70%EtOH擦拭大鼠幼崽（P1-2），并在冰上麻醉3分钟。
4. 使用 25 μL 无菌气密 Hamilton 注射器腹膜内注射 15 μL AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40（Addgene）。

2. 三叉神经节暴露手术

1. 根据体重对6-8周龄大鼠（约150-200g）腹膜内施用麻醉混合物（55mg / kg氯胺酮，5.5mg / kg甲苯噻嗪，1mg / kg乙酰丙嗪）。
   注意：这通常足以维持手术麻醉平面，通过没有对后爪有害捏合的退缩反射来评估。但是，如果动物变轻，则通过鼻锥补充异氟烷。
2. 完全麻醉后，剃掉头部和....

讨论

在这里，我们展示了一种快速、非侵入性的方法，用于生成用于 TG 成像的 GECI 大鼠。我们选择了CAG启动子来驱动和维持高水平的基因表达。虽然先前的研究表明其他 AAV 血清型可以有效地驱动 DRG 神经元中的基因表达³⁹，但我们的结果与最近一项涉及在新生儿腹膜内注射 AAV^{的研究一致 32}，表明 AAV9 血清型在大鼠新生儿感觉神经元感染中非常有效。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40	Addgene	100844-AAV9	AAV9-GCaMP6s virus
ACEpromazine maleate	Covetrus	11695-0095-5	10 mg/mL
AnaSed (Xylazine) injection	AKORN Animal Health	23076-35-9	20 mg/mL
CTR5500 Electronics box	Leica	11 888 820	Power Supply
Cutwell burr drill bit	Ransom & Randolph		¼ round
DM 6000 FS	Leica	11 888 928	Base Stand
EL6000	Leica	EL6000	Light source with 120 W mercury bulb
Forceps	FST	11252-00	Dumont No. 05
Friedman rongeurs	FST	16000-14	2.5 mm cup size
Friedman-Pearson rongeurs	FST	16021-14	1 mm cup size
Heating pad (Temperature therapy pad)	STRYKER	8002-062-022
Ketamine hydrochloride	Covetrus	1695-0703-1	100 mg/mL
Plan Fluor 20x/0.40	Leica	MRH00105	20x objective, 0.4 NA10.8 mm WD
Power handle high-temp cautery pen	Bovie	HIT1	handheld Change-A-Tip cautery pen
Prime 95B	Photometrics	Prime 95B	CMOS Camera
Saline	Fisher Scientific	NC0291799	0.9% Sterile Saline
Scalpel blade	Fisher Scientific	22-079-701	size 15 disposable blade
Spatula	BRI	48-1460	brain spatula
Spring scissors	FST	91500-09	Student Vannas, 5 mm cutting edge
Spring scissors	FST	15012-12	Noyes, 14 mm cutting edge
STP6000 Smart touch panel	Leica	11 501 255	Control Panel
Syringe	Hamilton	80201	25 μL Model 1702 Luer Tip syringe
Water heater	Adroit	HTP-1500