In-Vivo Imagem de cálcio de neurônios sensoriais no gânglio trigeminal de ratos

Resumo

Indicadores de cálcio codificados geneticamente (GECI) permitem uma análise robusta em nível populacional da sinalização de neurônios sensoriais. Aqui, desenvolvemos uma nova abordagem que permite a visualização in vivo do GECI da atividade dos neurônios dos gânglios trigeminais de ratos.

Resumo

Indicadores de cálcio codificados geneticamente (GECIs) permitem técnicas de imagem para monitorar mudanças no cálcio intracelular em populações-alvo de células-alvo. Sua grande relação sinal-ruído faz dos GECIs uma ferramenta poderosa para detectar a atividade evocada por estímulo em neurônios sensoriais. Os GECIs facilitam a análise em nível populacional da codificação de estímulos com o número de neurônios que podem ser estudados simultaneamente. Essa codificação populacional é mais apropriadamente feita in vivo. Os gânglios da raiz dorsal (DRG), que abrigam a soma de neurônios sensoriais que inervam estruturas somáticas e viscerais abaixo do pescoço, são usados mais extensivamente para imagens in vivo porque essas estruturas são acessadas com relativa facilidade. Mais recentemente, esta técnica foi utilizada em camundongos para estudar neurônios sensoriais no gânglio trigeminal (GT) que inervam estruturas orais e craniofaciais. Existem muitas razões para estudar TG além da DRG, incluindo a longa lista de síndromes dolorosas específicas para estruturas orais e craniofaciais que parecem refletir alterações na atividade dos neurônios sensoriais, como a neuralgia do trigêmeo. Camundongos são usados mais extensivamente no estudo de neurônios DRG e TG devido à disponibilidade de ferramentas genéticas. No entanto, com diferenças de tamanho, facilidade de manuseio e diferenças de espécies potencialmente importantes, há razões para estudar neurônios TG de ratos em vez de camundongos. Assim, desenvolvemos uma abordagem para obtenção de imagens de neurônios TG de ratos in vivo. Injetamos filhotes neonatais (p2) por via intraperitoneal com um AAV que codifica GCaMP6s, resultando em >90% de infecção dos neurônios TG e DRG. TG foi visualizado no adulto após craniotomia e decorticação, e mudanças na fluorescência de GCaMP6s foram monitoradas em neurônios TG após estimulação das regiões mandibular e maxilar da face. Confirmamos que aumentos na fluorescência foram evocados por estímulo com bloqueio de nervo periférico. Embora essa abordagem tenha muitos usos potenciais, estamos usando-a para caracterizar a(s) subpopulação(ões) de neurônios TG alterados após lesão de nervo periférico.

Introdução

A somatosensação, codificação neural de estímulos mecânicos, térmicos e químicos que incidem sobre a pele ou outras estruturas corporais, incluindo músculos, ossos e vísceras, inicia-se com a atividade em neurônios aferentes primários que inervam essas estruturas¹. Abordagens eletrofisiológicas baseadas em unidades únicas têm fornecido uma riqueza de informações sobre os subtipos aferentes envolvidos nesse processo, bem como como suas propriedades estímulo-resposta podem mudar ao longo do tempo ^1,2,3. No entanto, embora ainda existam fortes evidências em apoio à teoria da linha marcada, que sugere que modalidades sensoriais específicas são transmitidas por subpopulações específicas de neurônios, a capacidade de muitas subpopulações de neurônios de responder aos mesmos tipos de estímulos mecânicos, térmicos e químicos sugere que a maioria dos estímulos somatossensoriais é codificada por múltiplas subpopulações de neurônios^{4, 5º}. Assim, uma melhor compreensão da somatosensação só virá com a capacidade de estudar a atividade de 10, senão centenas, de neurônios simultaneamente.

Os avanços nas abordagens ópticas com o advento relativamente recente de técnicas de imagem confocal e, posteriormente, multifóton e digital têm facilitado a capacidade de realizar análises populacionais relativamente não invasivas da atividade neuronal ^6,7. Um dos últimos obstáculos na aplicação dessa tecnologia tem sido o desenvolvimento de ferramentas que possibilitem a avaliação óptica da atividade neural. Dada a velocidade de um potencial de ação que pode começar e terminar em menos de um milissegundo, um corante sensível à voltagem com a capacidade de acompanhar mudanças no potencial de membrana na velocidade de um potencial de ação seria a ferramenta ideal para esse fim. Mas, embora tenha havido um tremendo progresso nessa área 7,8,9,10, a relação sinal-ruído para muitos desses corantes ainda não é alta o suficiente para permitir uma análise populacional de centenas de neurônios em nível de célula única. Como uma abordagem alternativa, os investigadores têm se voltado para o monitoramento de mudanças na concentração intracelular de Ca²⁺ ([Ca²⁺]_i). As limitações dessa estratégia foram claras desde o início e incluem o fato de que um aumento na [Ca²⁺]_i é uma medida indireta da atividade neural¹¹; que um aumento na [Ca²⁺]_i pode ocorrer independentemente do influxo de Ca²⁺ associado à ativação de canais de Ca²⁺ dependentes de voltagem (VGCCs)^12,13; que a magnitude e a duração de um transiente de Ca²⁺ podem ser controladas por processos independentes da atividade do VGCC 11,12,14; e que o curso temporal dos transitórios de Ca²⁺ excede em muito o de um potencial de ação¹⁵. No entanto, há uma série de vantagens significativas associadas ao uso de Ca²⁺ como uma medida indireta da atividade neural. Não menos importante é a relação sinal-ruído associada à maioria dos indicadores de Ca²⁺, refletindo tanto a magnitude da mudança no Ca²⁺ intracelular quanto o fato de que o sinal está surgindo do espaço tridimensional do citosol e não do espaço bidimensional da membrana celular. Além disso, com o desenvolvimento de indicadores de Ca²⁺ codificados geneticamente (GECI's), é possível tirar proveito de estratégias genéticas para direcionar a expressão dos indicadores de Ca²⁺ em subpopulações específicas de células, facilitando análises em nível populacional em preparações intactas (por exemplo, ver¹⁶).

Dado o número de ferramentas genéticas agora disponíveis em camundongos, não deve ser surpresa que as GECI tenham sido usadas mais extensivamente nesta espécie. Linhagens de camundongos com expressão constitutiva de GECI em subpopulações de neurônios sensoriais têm sido desenvolvidas ^7,16,17. Com o desenvolvimento de linhagens de camundongos expressando recombinases em tipos celulares específicos, é possível utilizar estratégias ainda mais sofisticadas para controlar a expressão de^GECI15. No entanto, embora essas ferramentas sejam cada vez mais poderosas, há uma série de razões pelas quais outras espécies, como ratos, podem ser mais apropriadas para algumas questões experimentais. Estes incluem o tamanho maior, facilitando uma série de manipulações experimentais que são difíceis, se não impossíveis, no rato menor; a facilidade de treinar ratos em tarefas comportamentais relativamente complexas; e pelo menos algumas evidências de que as propriedades biofísicas e os padrões de expressão de vários canais iônicos em neurônios sensoriais de ratos podem ser mais semelhantes aos observados em neurônios sensoriais humanos do que os mesmos canais em camundongos em relação ao humano¹⁸.

Enquanto a transdução dos estímulos somatossensoriais geralmente ocorre nos terminais periféricos dos aferentes primários, o potencial de ação iniciado na periferia deve passar pela estrutura que abriga os somas aferentes primários, denominados gânglios da raiz dorsal (DRG) ou trigeminal (TG), antes de atingir o sistema nervoso^central19. Embora haja evidências de que nem todo potencial de ação que se propaga ao longo de um axônio aferente primário invadirá o corpo celular²⁰, consequência do fato de os somatas aferentes primários estarem conectados ao axônio aferente principal através de uma junção T¹⁹, a maioria dos potenciais de ação iniciados na periferia parece invadir o soma²¹. Isso confere três vantagens experimentais ao usar GECIs para avaliar a codificação populacional em aferentes primários: o grande tamanho do corpo celular em relação aos axônios aumenta ainda mais o sinal para ruído quando se usa [Ca²⁺]_i como uma medida indireta de atividade aferente; os DRG são geralmente de fácil acesso; e avaliar a atividade em um local espacialmente distante dos terminais aferentes minimiza o impacto potencial da cirurgia necessária para expor os gânglios sobre as propriedades estímulo-resposta dos terminais aferentes. No entanto, como os TG estão localizados abaixo do cérebro (ou acima da paleta), eles são muito mais difíceis de acessar do que o DRG. Além disso, embora existam muitas semelhanças entre os neurônios DRG e TG, há uma lista crescente de diferenças também. Isso inclui a organização aproximadamente somatotópica dos neurônios no TG²², estruturas únicas inervadas, diferentes padrões terminais centrais 23,24,25,26 e, agora, uma lista crescente de diferenças tanto na expressão gênica^27,28 quanto na expressão funcional do receptor²⁹. Além disso, como estamos interessados na identificação de mecanismos periféricos de dor, o número relativamente grande de síndromes dolorosas que parecem ser exclusivas do sistema trigeminal (por exemplo, enxaqueca, neuralgia do trigêmeo, síndrome da ardência bucal) que parecem envolver atividade aberrante em aferentes primários 30,31,32, sugere que o GT precisa ser estudado diretamente.

Assim, enquanto as propriedades estímulo-resposta dos neurônios TG têm sido estudadas com GECIs em^{camundongos 16}, porque as razões listadas acima sugerem que o rato pode ser uma espécie mais apropriada para abordar uma variedade de questões experimentais, o objetivo do presente estudo foi desenvolver uma abordagem para usar GECIs para estudar neurônios TG no rato. Para isso, utilizamos uma abordagem viral para conduzir a expressão do GECI GCaMP6s no sistema nervoso periférico. Em seguida, removemos o prosencéfalo para permitir o acesso ao GT. Finalmente, estímulos mecânicos e térmicos foram aplicados na face, enquanto as respostas neuronais foram avaliadas em microscopia fluorescente. Juntos, esses dados suportam um papel para a utilização do rato para investigar mudanças no TG sob muitos estados, expandindo o kit de ferramentas para investigadores interessados em codificação sensorial no sistema trigeminal.

Protocolo

Todos os experimentos envolvendo o uso de animais em pesquisa foram realizados de acordo com as normas estabelecidas pelo National Institutes of Health e pela International Association for the Study of Pain e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Pittsburgh (protocolo #22051100). Ao final de cada experimento, os ratos foram eutanasiados via exanguinação com perfusão cardíaca de solução salina tamponada com fosfato gelado (PBS), uma abordagem aprovada pela Associação Médica Veterinária Americana e pela IACUC da Universidade de Pittsburgh.

1. Indução do GCaMP

1. Encomende ratas Sprague Dawley grávidas para que os filhotes possam ser injetados no momento apropriado após o nascimento.
2. Borrife as luvas com EtOH 70% antes de manusear cada filhote de rato. Isso impedirá que a barragem canibalize os filhotes.
3. Filhotes de ratos swab (P1-2) com 70% de EtOH e anestesiam no gelo por 3 min.
4. Injetar 15 μL de AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40 (Addgene) por via intraperitoneal usando uma seringa Hamilton estéril e estanque ao gás de 25 μL.

2. Cirurgia de exposição do gânglio trigeminal

1. Administrar coquetel anestésico (55 mg/kg de cetamina, 5,5 mg/kg de xilazina, 1 mg/kg de acepromazina) por via intraperitoneal com base no peso corporal em ratos de 6-8 semanas de idade (aproximadamente 150-200 g).
   NOTA: Isso geralmente é suficiente para manter um plano cirúrgico de anestesia, avaliado pela ausência de um reflexo de retirada para pinça nociva de uma pata traseira. No entanto, suplemente com isoflurano através de um cone nasal se os animais se tornarem leves.
2. Uma vez totalmente anestesiado, raspe os cabelos e bigodes da cabeça e do rosto.
3. Monte o rato em uma estrutura estereotáxica com barras auriculares e coloque uma almofada de aquecimento (~37 ^oC) por baixo para manter a temperatura corporal.
4. Monitore os sinais vitais (frequência cardíaca, frequência respiratória, saturação de oxigênio no sangue) com um oxímetro de camundongo ou comparável.
   NOTA: A temperatura corporal é monitorada por uma sonda retal e mantida pela colocação de ratos em uma manta de água circulante controlada por feedback.
5. Coloque gaze mergulhada em soro fisiológico gelado na cabeça para contrair os vasos sanguíneos para minimizar o sangramento. Usando um bisturi tamanho 15, faça uma incisão na linha média da pele e do músculo sobre o crânio.
6. Use dissecção romba da pele e do músculo para expor o crânio.
7. Usando uma broca redonda de 1/4, perfure cuidadosamente a calota craniana para expor o prosencéfalo. Em seguida, use rongeurs (copo de 2,5 mm) para cortar cuidadosamente o crânio.
8. Usando um bisturi tamanho 15, faça uma incisão no cérebro (Bregma: -3,80) e no bulbo olfatório.
   NOTA: Cortar mais caudalmente além deste ponto resultará em morte de ratos
9. Use uma espátula para desconectar cuidadosamente a dura-máter do crânio e levantar suavemente o cérebro cortado para revelar o TG e a base do crânio.
   NOTA: O uso adicional de perfusão salina gelada durante toda a extração minimizará o sangramento e otimizará o campo de dissecção a seguir.
10. Usando uma caneta cauterizada, estanque qualquer sangramento resultante da extração.
    NOTA: Cortar a dura-máter resultará em sangramento inevitável. É melhor preparar aCSF gelado (119 mM NaCl, 26,2 mM NaHCO₃, 2,5 mM KCl, 1 mM NaH₂PO₄, 1,3 mM MgCl₂, 10 mM glicose, 2,5 mM CaCl₂) para banhar a cavidade do crânio para ajudar a contrair os vasos sanguíneos, mantendo a saúde neuronal.

3. Imagem GCaMP6s

NOTA: Dado o tamanho e a densidade desses neurônios, o sistema de imagem e aquisição de dados utilizado (objetiva, microscópio, fonte de luz, câmera) determinará o número de células GECI⁺ visualizadas. A fonte de luz, a objetiva e a câmera também determinarão os parâmetros usados para a aquisição da imagem, incluindo o tempo de exposição e a taxa de captura da imagem. Enquanto técnicas multifótons e confocais podem ser usadas dependendo dos parâmetros do experimento, a microscopia de epifluorescência pode ser suficiente para resolver muitas células. Qualquer pacote de aquisição de imagens pode ser usado. O ideal é que a aplicação do estímulo seja bloqueada no tempo com o pacote do software de aquisição de imagens.

1. Coloque a cavidade craniana abaixo da objetiva e coloque o TG em foco usando luz visível.
2. O comprimento de onda de excitação do GCaMP6s é de 496 nm, e seu comprimento de onda de emissão é de 513 nm; assim, use os cubos dicroicos e de filtro apropriados para localizar as células GCaMP⁺ . Ajuste o foco para localizar e resolver a área dos gânglios em que os neurônios estão respondendo aos estímulos aplicados ao campo receptivo de interesse.
3. Utilizar uma objetiva de 10x para permitir a visualização da maioria dos neurônios do GT responsivos a estímulos mecânicos aplicados a uma região de 1^cm2 da face¹⁶. Use uma objetiva seca de 20x com uma longa distância de trabalho (10,8 mm) para aumentar a resolução.
4. Use software de aquisição (por exemplo, Metamorph) para coletar dados de fluorescência ao longo do tempo e em resposta à aplicação de estímulos.
   1. Para minimizar o fotoclareamento dos neurônios, use o menor tempo de exposição possível para detectar aumentos basais e evocados na fluorescência. Com a objetiva de ar de 20x, 0,40 NA, uma fonte de luz de haleto de mercúrio de 120 W e uma câmera complementar de metal-óxido-semicondutor (CMOS) utilizada neste estudo, um tempo de exposição de 300 ms e uma taxa de aquisição de imagens de 3 Hz, obtêm-se registros basais estáveis por >90 min.
      OBS: 1) Estes parâmetros de aquisição de imagens devem ser determinados empiricamente. 2) Mecânica (escova, puntiforme, vibração, pinça), térmica (calor e frio) e química (capsaicina, mentol, mediadores inflamatórios) podem ser aplicadas ao campo receptivo. Uma abordagem subjetiva relativamente barata é aplicar os estímulos manualmente. Abordagens mais objetivas e reprodutíveis são recomendadas, no entanto, onde atuadores controlados por realimentação podem ser usados para aplicação repetida em uma força conhecida. Embora os dispositivos Peltier controlados por feedback sejam úteis para aquecimento e resfriamento controlados, eles não são ideais para a estimulação térmica de uma face curva. Fontes de luz infravermelha controladas por feedback são uma alternativa para aquecimento, e o spray a frio é uma alternativa menos do que ideal para resfriamento.

Resultados

Como já tivemos sucesso com o sorotipo AAV9 para a infecção de neurônios sensoriais de^ratos15, usamos esse sorotipo para a expressão de GCaMP6s em neurônios TG de ratos. Portanto, primeiramente procuramos avaliar a eficiência da infecção de neurônios sensoriais de AAV9-CAG-GCaMP6s-WPRE-SV40 (AAV9-GCaMP) quando este vírus foi administrado a filhotes de ratos^neonatais20. Este vírus utiliza o promotor CAG, que dirige e mantém altos níveis de expressão gênica. A...

Discussão

Aqui, demonstramos uma maneira rápida e não invasiva de gerar um rato GECI para obtenção de imagens do TG. Escolhemos um promotor CAG para conduzir e manter altos níveis de expressão gênica. Embora estudos anteriores sugiram que outros sorotipos de AAV podem conduzir eficientemente a expressão gênica em neurônios DRG³⁹, nossos resultados são consistentes com um estudo recente envolvendo injeção intraperitoneal de AAV em neonatos³², indicando que o sorotipo AAV9...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40	Addgene	100844-AAV9	AAV9-GCaMP6s virus
ACEpromazine maleate	Covetrus	11695-0095-5	10 mg/mL
AnaSed (Xylazine) injection	AKORN Animal Health	23076-35-9	20 mg/mL
CTR5500 Electronics box	Leica	11 888 820	Power Supply
Cutwell burr drill bit	Ransom & Randolph		¼ round
DM 6000 FS	Leica	11 888 928	Base Stand
EL6000	Leica	EL6000	Light source with 120 W mercury bulb
Forceps	FST	11252-00	Dumont No. 05
Friedman rongeurs	FST	16000-14	2.5 mm cup size
Friedman-Pearson rongeurs	FST	16021-14	1 mm cup size
Heating pad (Temperature therapy pad)	STRYKER	8002-062-022
Ketamine hydrochloride	Covetrus	1695-0703-1	100 mg/mL
Plan Fluor 20x/0.40	Leica	MRH00105	20x objective, 0.4 NA10.8 mm WD
Power handle high-temp cautery pen	Bovie	HIT1	handheld Change-A-Tip cautery pen
Prime 95B	Photometrics	Prime 95B	CMOS Camera
Saline	Fisher Scientific	NC0291799	0.9% Sterile Saline
Scalpel blade	Fisher Scientific	22-079-701	size 15 disposable blade
Spatula	BRI	48-1460	brain spatula
Spring scissors	FST	91500-09	Student Vannas, 5 mm cutting edge
Spring scissors	FST	15012-12	Noyes, 14 mm cutting edge
STP6000 Smart touch panel	Leica	11 501 255	Control Panel
Syringe	Hamilton	80201	25 μL Model 1702 Luer Tip syringe
Water heater	Adroit	HTP-1500