مقايسة كيميائية أسيتيل كليك لقياس هيستون أسيتيل ترانسفيراز 1 أسيتيل

Summary

تعد المقايسات الكيميائية السريعة والدقيقة للكشف عن مثبطات محددة أداة مهمة في ترسانة تطوير الأدوية. هنا ، نقدم مقايسة كيميائية قابلة للتطوير فوق الأسيتيل لقياس تثبيط نشاط أستلة HAT1.

Abstract

يلعب HAT1 ، المعروف أيضا باسم Histone acetyltransferase 1 ، دورا مهما في تخليق الكروماتين عن طريق تثبيت وأستلة H4 الوليدة قبل تجميع النيوكليوسوم. وهو مطلوب لنمو الورم في أنظمة مختلفة ، مما يجعله هدفا محتملا لعلاج السرطان. لتسهيل تحديد المركبات التي يمكن أن تمنع النشاط الأنزيمي HAT1 ، ابتكرنا مقايسة نقرة الأسيتيل للفحص السريع. في هذا الفحص البسيط ، نستخدم HAT1 / Rbap46 المؤتلف ، والذي يتم تنقيته من الخلايا البشرية المنشطة. تستخدم الطريقة الأسيتل-CoA التناظري 4-pentynoyl-CoA (4P) في نهج كيمياء النقر. يتضمن ذلك النقل الأنزيمي لمقبض الألكاين من خلال تفاعل أسيلة يعتمد على HAT1 إلى ببتيد H4 N-terminal البيوتينيل. ثم يتم تجميد الببتيد الذي تم التقاطه على ألواح النيوترفيدين ، متبوعا بوظيفة كيمياء النقر باستخدام البيوتين أزيد. بعد ذلك ، يتم استخدام توظيف streptavidin-peroxidase لأكسدة amplex red ، مما يؤدي إلى ناتج فلوري كمي. من خلال إدخال مثبطات كيميائية أثناء تفاعل الأسيل ، يمكننا تحديد التثبيط الأنزيمي بناء على تقليل إشارة التألق. الأهم من ذلك ، أن هذا التفاعل قابل للتطوير ، مما يسمح بفحص عالي الإنتاجية للمثبطات المحتملة للنشاط الأنزيمي HAT1.

Introduction

من بين العديد من أسيتيل ترانسفيراز حقيقية النواة ، كان HAT1 هو أسيتيل ترانسفيراز هيستون الأولي الذي تم عزله^1،2،3. أثبتت التحقيقات اللاحقة دورها المحوري في تكرار الكروماتين ، لا سيما في تخليق نيوكليوسومات جديدة خلال المرحلة^{S-phase 4}. أدت مساعينا البحثية إلى إدراك أن HAT1 يتم تحفيزه بشكل كبير من خلال علاج عامل نمو البشرة (EGF) في الخلايا الثديية⁵. علاوة على ذلك ، فقد تبين أن HAT1 مطلوب للتكاثر السريع للخلايا وتشكيل الورم في الجسم الحي^6،7،

Protocol

1. الطريقة الأولى: إنتاج وتنقية مركب HAT1 / Rbap46 المؤتلف

1. إذابة خلايا HEK293f واستعادتها وتوسيعها
   1. قم بإذابة 1-10 مليون خلية ثديية HEK293f²⁶ إلى وسائط تعبير حرة 293 سعة 30 مل في قارورة سعة 100 مل. احتضان في 8٪ CO₂ عند 37 درجة مئوية أثناء الدوران عند 60 دورة في الدقيقة.
   2. في اليوم التالي ، عد وتحقق من صلاحية الخلية ، ثم اضبط سرعة الدوران على 120 دورة في الدقيقة. قم بالتوسع إلى 300 مل في دورق سعة 1 لتر ، مع الحفاظ على كثافة البذر عند 500000 خلية / مل وتقسيم الخلايا قبل أن تتجاوز الكثافة 3 × 10⁶ خلايا / مل.
2. نقل HEK293f
   1. بذرة 5 × 10⁵ خلايا / مل ف....

النتائج

يجب تضمين المنحنيات القياسية في نسختين (16 بئرا) على كل لوحة لضمان أداء الفحص المناسب. يجب إعداد بيانات المنحنى القياسي في شكل جدول ، مع نطاق من 100٪ إلى 0٪ وفقا لنسبة الببتيد المحتوي على Pra إلى الببتيد H4 الأصلي في المحلول (الجدول 1). ستكون إشارة Amplex الحمراء هي الأعلى في آبار الببتيد H4 ا?.......

Discussion

في العقد الماضي ، أصبحت كيمياء النقر بارزة²⁰ ، مما يتيح التصميم الدقيق للهياكل الكيميائية المتفاعلة. في هذا السياق ، ظهرت العديد من الاتصالات التساهمية المتعامدة^{الحيوية 21} كخيارات واعدة لتشكيل مجمعات في بيئتها الطبيعية. تستخدم كيمياء النقرات أزواجا من المجموعات .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4P CoA	Cayman Chemical	10547	Click chemistry co-factor
Amplex Red	Fisher Sci	A12222	Fluorescence substrate
Biotin-PEG-Azide	Alfa Aesar	J64996MC	Click chemistry
Copper Sulfate	Sigma-aldrich	7758-98-7	Click chemistry
DMSO	Fisher Scientific	67-68-5	diluent
DTT	Acros Organics	03-12-3483	reducting agent
Forskolin	VWR	102987-310	Protein expression
Freestyle 293 Expression Medium	Thermo Fisher	12338018	Media
Freestyle 293-F cells	Thermo Fisher	R790-07	Protein expression
H4-peptide/1-23-GGK-biotin	Anaspec	AS65097	peptide substrate
HEPES	Sigma-aldrich	7365-45-9	EB buffer
Hydrogen peroxide 30% solution	Sigma-aldrich	Z00183-99-0	initiator
M2 FLAG antibody slurry	Millipore-Sigma	A2220	Protein purification
Macrosep 10K Filter (Pall Lab)	VWR	89131-980	Protein purification
Neutravidin Plate	Thermo Sci	15127	BSA-pre-blocked
NP40 (IGEPAL)	MP Biomedical	198596	20x buffer
pHEK-293 plasmid	Takara Bio	3390	Protein expression
Phosphate Buffered Saline 10x	Alfa Aesar	Z00082-33-6	wash buffer
Pra peptide	Genscript	Custom synthesis	biotinylated
Sodium Ascorbate	Sigma-aldrich	134-03-2	Click chemistry
Sodium chloride	Sigma-aldrich	7647-14-5	EB buffer
Sodium phosphate	VWR International	7558-80-7	buffer
Streptavidin	EMD Millipore	189730	competitor
Streptavidin-HRP	Cell Signaling	3999S	enzyme
THPTA ligand	Fisher Sci	1010-500	Click chemistry
Tris base	Sigma-aldrich	77-86-1	20x buffer
Triton-X 100	VWR International	9002-93-1	EB buffer
Tween-20	Sigma-aldrich	9005-64-5	Wash buffer
Urea	Sigma-Aldrich	57-13-6	quencher