Ацетил-клик-химический анализ для измерения ацетилирования гистон-ацетилтрансферазы 1

Резюме

Быстрые и точные химические анализы для скрининга специфических ингибиторов являются важным инструментом в арсенале разработки лекарств. Здесь мы представляем масштабируемый химический анализ с ацетиловым щелком для измерения ингибирования активности ацетилирования HAT1.

Аннотация

HAT1, также известный как гистон-ацетилтрансфераза 1, играет решающую роль в синтезе хроматина, стабилизируя и ацетилируя зарождающийся H4 перед сборкой нуклеосом. Он необходим для роста опухолей в различных системах, что делает его потенциальной мишенью для лечения рака. Чтобы облегчить идентификацию соединений, которые могут ингибировать ферментативную активность HAT1, мы разработали ацетил-клик-анализ для быстрого скрининга. В этом простом анализе мы используем рекомбинантный HAT1/Rbap46, который очищается от активированных клеток человека. В методе используется аналог ацетил-КоА 4-пентиноил-КоА (4P) в клик-химическом подходе. Это включает в себя ферментативный перенос алкинового ручки через HAT1-зависимую реакцию ацилирования на биотинилированный N4-концевой пептид. Затем захваченный пептид иммобилизуют на нейтравидиновых планшетах с последующей клик-химическим функционализированием с помощью биотина-азида. Затем рекрутирование стрептавидин-пероксидазы используется для окисления амплексного красного, что приводит к количественному выходу флуоресцентного сигнала. Вводя химические ингибиторы во время реакции ацилирования, мы можем количественно оценить ферментативное ингибирование на основе снижения сигнала флуоресценции. Важно отметить, что эта реакция является масштабируемой, что позволяет проводить высокопроизводительный скрининг потенциальных ингибиторов ферментативной активности HAT1.

Введение

Среди многочисленных эукариотических ацетилтрансфераз HAT1 был исходной гистон-ацетилтрансферазой, которая была выделена ^1,2,3. Последующие исследования твердо установили его ключевую роль в репликации хроматина, особенно в синтезе новых нуклеосом во время S-фазы⁴. Наши исследования привели к признанию того, что HAT1 сильно стимулируется лечением эпидермального фактора роста (EGF) в клетках молочной железы⁵. Кроме того, выяснилось, что HAT1 необходим для быстрой пролиферации клеток и образования опухолей in vivo

протокол

1. Способ 1: Получение и очистка рекомбинантного комплекса HAT1/Rbap46

1. Размораживание, восстановление и расширение клеток HEK293f
   1. Разморозьте 1-10 миллионов клеток млекопитающих HEK293f²⁶ в 30 мл среды для экспрессии Freestyle 293 в колбе объемом 100 мл. Инкубировать в 8%_СО2 при 37 °C при вращении при 60 об/мин.
   2. На следующий день пересчитайте и проверьте жизнеспособность ячейки, затем отрегулируйте скорость вращения до 120 об/мин. Расширьте до 300 мл культуры в колбе объемом 1 л, поддерживая плотность посева на уровне 500 000 клеток/мл и расщепляя клетки до того, как плотность превысит 3 x....

Результаты

Стандартные кривые в двух экземплярах (16 лунок) должны быть включены в каждую пластину, чтобы обеспечить надлежащее выполнение анализа. Стандартные данные кривой должны быть представлены в табличной форме с диапазоном от 100% до 0% в зависимости от соотношения Pra-содержащего пептида к нат.......

Обсуждение

В последнее десятилетие клик-химия^{стала широко} распространенной, позволив точно проектировать взаимодействующие химические структуры. В этом контексте различные биоортогональные ковалентные связи²¹ стали перспективными вариантами формирования комплексов.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
4P CoA	Cayman Chemical	10547	Click chemistry co-factor
Amplex Red	Fisher Sci	A12222	Fluorescence substrate
Biotin-PEG-Azide	Alfa Aesar	J64996MC	Click chemistry
Copper Sulfate	Sigma-aldrich	7758-98-7	Click chemistry
DMSO	Fisher Scientific	67-68-5	diluent
DTT	Acros Organics	03-12-3483	reducting agent
Forskolin	VWR	102987-310	Protein expression
Freestyle 293 Expression Medium	Thermo Fisher	12338018	Media
Freestyle 293-F cells	Thermo Fisher	R790-07	Protein expression
H4-peptide/1-23-GGK-biotin	Anaspec	AS65097	peptide substrate
HEPES	Sigma-aldrich	7365-45-9	EB buffer
Hydrogen peroxide 30% solution	Sigma-aldrich	Z00183-99-0	initiator
M2 FLAG antibody slurry	Millipore-Sigma	A2220	Protein purification
Macrosep 10K Filter (Pall Lab)	VWR	89131-980	Protein purification
Neutravidin Plate	Thermo Sci	15127	BSA-pre-blocked
NP40 (IGEPAL)	MP Biomedical	198596	20x buffer
pHEK-293 plasmid	Takara Bio	3390	Protein expression
Phosphate Buffered Saline 10x	Alfa Aesar	Z00082-33-6	wash buffer
Pra peptide	Genscript	Custom synthesis	biotinylated
Sodium Ascorbate	Sigma-aldrich	134-03-2	Click chemistry
Sodium chloride	Sigma-aldrich	7647-14-5	EB buffer
Sodium phosphate	VWR International	7558-80-7	buffer
Streptavidin	EMD Millipore	189730	competitor
Streptavidin-HRP	Cell Signaling	3999S	enzyme
THPTA ligand	Fisher Sci	1010-500	Click chemistry
Tris base	Sigma-aldrich	77-86-1	20x buffer
Triton-X 100	VWR International	9002-93-1	EB buffer
Tween-20	Sigma-aldrich	9005-64-5	Wash buffer
Urea	Sigma-Aldrich	57-13-6	quencher