Un ensayo químico de acetil-clic para medir la acetilación de la acetil 1 de la histona acetiltransferasa 1

Resumen

Los ensayos químicos rápidos y precisos para detectar inhibidores específicos son una herramienta importante en el arsenal de desarrollo de fármacos. Aquí, presentamos un ensayo químico escalable de acetil-clic para medir la inhibición de la actividad de acetilación de HAT1.

Resumen

HAT1, también conocida como histona acetiltransferasa 1, desempeña un papel crucial en la síntesis de cromatina al estabilizar y acetilar el H4 naciente antes del ensamblaje de nucleosomas. Es necesario para el crecimiento tumoral en varios sistemas, lo que lo convierte en un objetivo potencial para el tratamiento del cáncer. Para facilitar la identificación de compuestos que pueden inhibir la actividad enzimática de HAT1, hemos ideado un ensayo de clic acetil para un cribado rápido. En este sencillo ensayo, empleamos HAT1/Rbap46 recombinante, que se purifica a partir de células humanas activadas. El método utiliza el análogo de acetil-CoA 4-pentinoil-CoA (4P) en un enfoque de química de clic. Esto implica la transferencia enzimática de un mango alquino a través de una reacción de acilación dependiente de HAT1 a un péptido N-terminal H4 biotinilado. A continuación, el péptido capturado se inmoviliza en placas de neutravidina, seguido de una funcionalización química con biotina-azida. Posteriormente, se emplea el reclutamiento de estreptavidina-peroxidasa para oxidar el rojo amplex, lo que da como resultado una salida fluorescente cuantitativa. Mediante la introducción de inhibidores químicos durante la reacción de acilación, podemos cuantificar la inhibición enzimática en función de una reducción de la señal de fluorescencia. Es importante destacar que esta reacción es escalable, lo que permite un cribado de alto rendimiento de posibles inhibidores de la actividad enzimática de HAT1.

Introducción

Entre las numerosas acetiltransferasas eucariotas, HAT1 fue la histona acetiltransferasa inicial que se aisló ^1,2,3. Investigaciones posteriores han establecido firmemente su papel fundamental en la replicación de la cromatina, particularmente en la síntesis de nuevos nucleosomas durante la fase^{S 4}. Nuestros esfuerzos de investigación condujeron al reconocimiento de que HAT1 está altamente estimulado por el tratamiento con factor de crecimiento epidérmico (EGF) en células mamarias⁵. Además, ha salido a la luz que HAT1 es necesar....

Protocolo

1. Método 1: Producción y purificación del complejo recombinante HAT1/Rbap46

1. Descongelación, recuperación y expansión de células HEK293f
   1. Descongele 1-10 millones de células de mamíferos HEK293f²⁶ en 30 ml de medios de expresión freestyle 293 en un matraz de 100 ml. Incubar en 8% de CO₂ a 37 °C mientras gira a 60 rpm.
   2. Al día siguiente, cuente y verifique la viabilidad de la celda, luego ajuste la velocidad de rotación a 120 rpm. Expandir a 300 mL de cultivo en un matraz de 1 L, manteniendo la densidad de siembra en 500.000 células/mL y dividiendo las células antes de que la densidad supere ....

Discusión

En la última década, la química de clic se volvió prominente²⁰, permitiendo el diseño preciso de estructuras químicas que interactúan. En este contexto, diversas conexiones covalentes bioortogonales²¹ han surgido como opciones prometedoras para la formación de complejos en su entorno natural. La química de clic emplea pares de grupos funcionales que exhiben reacciones rápidas y selectivas, comúnmente conocidas como "reacciones de clic". Estas reacciones se produc.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
4P CoA	Cayman Chemical	10547	Click chemistry co-factor
Amplex Red	Fisher Sci	A12222	Fluorescence substrate
Biotin-PEG-Azide	Alfa Aesar	J64996MC	Click chemistry
Copper Sulfate	Sigma-aldrich	7758-98-7	Click chemistry
DMSO	Fisher Scientific	67-68-5	diluent
DTT	Acros Organics	03-12-3483	reducting agent
Forskolin	VWR	102987-310	Protein expression
Freestyle 293 Expression Medium	Thermo Fisher	12338018	Media
Freestyle 293-F cells	Thermo Fisher	R790-07	Protein expression
H4-peptide/1-23-GGK-biotin	Anaspec	AS65097	peptide substrate
HEPES	Sigma-aldrich	7365-45-9	EB buffer
Hydrogen peroxide 30% solution	Sigma-aldrich	Z00183-99-0	initiator
M2 FLAG antibody slurry	Millipore-Sigma	A2220	Protein purification
Macrosep 10K Filter (Pall Lab)	VWR	89131-980	Protein purification
Neutravidin Plate	Thermo Sci	15127	BSA-pre-blocked
NP40 (IGEPAL)	MP Biomedical	198596	20x buffer
pHEK-293 plasmid	Takara Bio	3390	Protein expression
Phosphate Buffered Saline 10x	Alfa Aesar	Z00082-33-6	wash buffer
Pra peptide	Genscript	Custom synthesis	biotinylated
Sodium Ascorbate	Sigma-aldrich	134-03-2	Click chemistry
Sodium chloride	Sigma-aldrich	7647-14-5	EB buffer
Sodium phosphate	VWR International	7558-80-7	buffer
Streptavidin	EMD Millipore	189730	competitor
Streptavidin-HRP	Cell Signaling	3999S	enzyme
THPTA ligand	Fisher Sci	1010-500	Click chemistry
Tris base	Sigma-aldrich	77-86-1	20x buffer
Triton-X 100	VWR International	9002-93-1	EB buffer
Tween-20	Sigma-aldrich	9005-64-5	Wash buffer
Urea	Sigma-Aldrich	57-13-6	quencher