用于测量组蛋白乙酰转移酶 1 乙酰化的乙酰基点击化学测定法

摘要

快速准确的化学检测以筛选特定抑制剂是药物开发武器库中的重要工具。在这里，我们提出了一种可扩展的乙酰点击化学测定法来测量HAT1乙酰化活性的抑制。

摘要

HAT1，也称为组蛋白乙酰转移酶 1，通过在核小体组装前稳定和乙酰化新生 H4，在染色质合成中起着至关重要的作用。它是各种系统中肿瘤生长所必需的，使其成为癌症治疗的潜在靶点。为了便于鉴定可抑制HAT1酶活性的化合物，我们设计了一种用于快速筛选的乙酰点击测定法。在这个简单的测定中，我们采用重组HAT1 / Rbap46，它是从活化的人细胞中纯化的。该方法以点击化学方法利用乙酰辅酶A类似物4-戊酰辅酶A（4P）。这涉及通过 HAT1 依赖性酰化反应将炔烃手柄酶促转移到生物素化的 H4 N 末端肽上。然后将捕获的肽固定在中性亲和素平板上，然后用生物素叠氮化物进行点击化学官能团化。随后，采用链霉亲和素-过氧化物酶募集来氧化 amplex 红，从而产生定量荧光输出。通过在酰化反应过程中引入化学抑制剂，我们可以根据荧光信号的还原来量化酶抑制。重要的是，该反应具有可扩展性，可以高通量筛选HAT1酶活性的潜在抑制剂。

引言

在众多真核乙酰转移酶中，HAT1 是最初分离的组蛋白乙酰转移酶 ^1,2,3。随后的研究已经牢固地确立了它在染色质复制中的关键作用，特别是在 S 期⁴ 期间合成新核小体中。我们的研究努力使人们认识到 HAT1 在乳腺细胞中受到表皮生长因子 （EGF） 处理的高度刺激⁵。此外，已经发现 HAT1 是体内快速细胞增殖和肿瘤形成所必需的 6,7,8,9。数据表明，HAT1在协调细胞分裂的合成代谢和表观遗传过程，推动肿瘤生长方面至关重要。

HAT1 与伴侣蛋白 Rbap46 复合物将赖氨酸 5 和 12 上组蛋白 H4 的氨基末端尾部二乙酰化，后者结合组蛋白并将氨基末端呈递给 HAT1。然后将组蛋白四聚体或二聚体¹⁰与HAT1 / Rbap46和其他组蛋白伴侣

研究方案

1. 方法一：生产纯化重组HAT1/Rbap46复合物

1. 解冻、回收和扩增 HEK293f 细胞
   1. 在 100 mL 烧瓶中将 1-1000 万个 HEK293f 哺乳动物^{细胞 26} 解冻到 30 mL freestyle 293 表达培养基中。在37°C下在8%CO₂ 中孵育，同时以60rpm旋转。
   2. 第二天，计数并检查细胞活力，然后将转速调整为 120 rpm。在 1 L 烧瓶中扩增至 300 mL 培养物，将接种密度保持在 500,000 个细胞/mL，并在密度超过 3 x 10⁶ 个细胞/mL 之前分裂细胞。
2. HEK293f 转染
   1. 将 5 x 10⁵ 个细胞/mL 接种在 300 mL 培养物中，放入 1 L 烧瓶中并培养 24 小时。第二天，对细胞进行计数，确保它们在 7.5 x 10⁵ 至 1.2 x 10⁶ 个细胞/mL 之间。
   2. 在 30 mL PBS 中制备 300 μg pHEK-FLAG-HAT1 和 300 μg pHEK-Rbap46 质粒 DNA 的混合物。向 DNA/PBS 中加入 1.2 mL 聚乙烯亚胺 （PEI） 并混合。将DNA / PBS / PEI混合物加入300mL培养物中....

讨论

在过去的十年中，点击化学变得突出²⁰，使相互作用的化学结构的精确设计成为可能。在此背景下，各种生物正交共价连接²¹ 已成为在其自然环境中形成复合物的有希望的选择。点击化学采用表现出快速和选择性反应的官能团对，通常称为“点击反应”。这些反应在环保、温和的水性条件下有效发生。在这里，我们介绍了一种旨在鉴定和表征 HAT1 乙酰转移酶活?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4P CoA	Cayman Chemical	10547	Click chemistry co-factor
Amplex Red	Fisher Sci	A12222	Fluorescence substrate
Biotin-PEG-Azide	Alfa Aesar	J64996MC	Click chemistry
Copper Sulfate	Sigma-aldrich	7758-98-7	Click chemistry
DMSO	Fisher Scientific	67-68-5	diluent
DTT	Acros Organics	03-12-3483	reducting agent
Forskolin	VWR	102987-310	Protein expression
Freestyle 293 Expression Medium	Thermo Fisher	12338018	Media
Freestyle 293-F cells	Thermo Fisher	R790-07	Protein expression
H4-peptide/1-23-GGK-biotin	Anaspec	AS65097	peptide substrate
HEPES	Sigma-aldrich	7365-45-9	EB buffer
Hydrogen peroxide 30% solution	Sigma-aldrich	Z00183-99-0	initiator
M2 FLAG antibody slurry	Millipore-Sigma	A2220	Protein purification
Macrosep 10K Filter (Pall Lab)	VWR	89131-980	Protein purification
Neutravidin Plate	Thermo Sci	15127	BSA-pre-blocked
NP40 (IGEPAL)	MP Biomedical	198596	20x buffer
pHEK-293 plasmid	Takara Bio	3390	Protein expression
Phosphate Buffered Saline 10x	Alfa Aesar	Z00082-33-6	wash buffer
Pra peptide	Genscript	Custom synthesis	biotinylated
Sodium Ascorbate	Sigma-aldrich	134-03-2	Click chemistry
Sodium chloride	Sigma-aldrich	7647-14-5	EB buffer
Sodium phosphate	VWR International	7558-80-7	buffer
Streptavidin	EMD Millipore	189730	competitor
Streptavidin-HRP	Cell Signaling	3999S	enzyme
THPTA ligand	Fisher Sci	1010-500	Click chemistry
Tris base	Sigma-aldrich	77-86-1	20x buffer
Triton-X 100	VWR International	9002-93-1	EB buffer
Tween-20	Sigma-aldrich	9005-64-5	Wash buffer
Urea	Sigma-Aldrich	57-13-6	quencher