ヒストンアセチルトランスフェラーゼ1アセチル化を測定するためのアセチルクリックケミストリーアッセイ

要約

特定の阻害剤をスクリーニングするための迅速かつ正確な化学アッセイは、医薬品開発の武器庫における重要なツールです。ここでは、HAT1アセチル化活性の阻害を測定するためのスケーラブルなアセチルクリックケミストリーアッセイを紹介します。

要約

HAT1は、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ1とも呼ばれ、ヌクレオソーム形成前に新生H4を安定化およびアセチル化することにより、クロマチン合成において重要な役割を果たします。さまざまなシステムでの腫瘍増殖に必要であり、がん治療の標的となる可能性があります。HAT1酵素活性を阻害する化合物の同定を容易にするために、迅速なスクリーニングのためのアセチルクリックアッセイを考案しました。この簡便なアッセイでは、活性化されたヒト細胞から精製された組換えHAT1/Rbap46を用います。この分析法では、アセチル-CoA 類似体である 4-ペンチノイル-CoA(4P)をクリックケミストリーアプローチで利用します。これには、HAT1依存性アシル化反応によるアルキンハンドルのビオチン化H4 N末端ペプチドへの酵素的転写が含まれます。捕捉したペプチドはニュートラアビジンプレート上に固定化され、続いてビオチン-アジドによるクリックケミストリー官能基化が行われます。続いて、ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼリクルートメントを使用してアンプレックスレッドを酸化し、定量的な蛍光出力が得られます。アシル化反応中に化学的阻害剤を導入することで、蛍光シグナルの減少に基づいて酵素阻害を定量することができます。重要なことは、この反応はスケーラブルであり、HAT1酵素活性の潜在的な阻害剤のハイスループットスクリーニングを可能にすることです。

概要

数ある真核生物のアセチルトランスフェラーゼの中で、HAT1は最初に単離されたヒストンアセチルトランスフェラーゼであった^1,2,3。その後の研究により、クロマチン複製、特にS期⁴期の新しいヌクレオソームの合成における極めて重要な役割が確固たるものとなりました。研究の結果、HAT1は乳腺細胞の上皮成長因子(EGF)処理によって高度に刺激されることが認識されました⁵。さらに、HAT1はin vivoでの急速な細胞増殖と腫瘍形成に必要であることが明らかになっています^6,7,8,9。データによると、HAT1は細胞分裂の同化プロセスとエピジェネティックプロセスの調整に不可欠であり、腫瘍の増殖を促進します。

HAT1は、ヒストンH4のアミノ末端テールをリジン5および12上のジアセチル化し、シャペロンタンパク質Rbap46と複合体でヒストンに....

プロトコル

1.方法1:組換えHAT1 / Rbap46複合体の生成と精製

1. HEK293f細胞の融解、回収、増殖
   1. 100 mLフラスコ中で、1〜1,000万個のHEK293f哺乳類細胞²⁶ を30 mLのフリースタイル293発現培地に解凍します。8% CO₂ を 37 °C で 60 rpm で回転させながらインキュベートします。
   2. 翌日、細胞の生存率をカウントして確認し、回転速度を120rpmに調整します。1 L フラスコで 300 mL 培養液に増殖させ、播種密度を 500,000 細胞/mL に維持し、密度が 3 x 10⁶ cells/mL を超える前に細胞を分割します。
2. HEK293fトランスフェクション
   1. 5 x 10⁵ cells/mL を 1 L フラスコで 300 mL 培養し、24 時間培養します。翌日、細胞を数えて、7.5 x 10⁵ から 1.2 x 10⁶ cells/mL の間であることを確認します。
   2. 30 mL の PBS 中に 300 μg の pHEK-FLAG-HAT1 と 300 μg の pHEK-Rbap46 プラスミド DNA の混合物を調製します。1.2 mLのポリエチレンイミン....

ディスカッション

過去10年間で、クリックケミストリーが顕著になり²⁰、相互作用する化学構造の正確な設計が可能になりました。この文脈の中で、種々の生体直交共有結合²¹ が、それらの自然環境において複合体を形成するための有望な選択肢として浮上してきた。クリックケミストリーは、一般に「クリック反応」として知られる、迅速で選択的な反応を示す官能基のペ.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4P CoA	Cayman Chemical	10547	Click chemistry co-factor
Amplex Red	Fisher Sci	A12222	Fluorescence substrate
Biotin-PEG-Azide	Alfa Aesar	J64996MC	Click chemistry
Copper Sulfate	Sigma-aldrich	7758-98-7	Click chemistry
DMSO	Fisher Scientific	67-68-5	diluent
DTT	Acros Organics	03-12-3483	reducting agent
Forskolin	VWR	102987-310	Protein expression
Freestyle 293 Expression Medium	Thermo Fisher	12338018	Media
Freestyle 293-F cells	Thermo Fisher	R790-07	Protein expression
H4-peptide/1-23-GGK-biotin	Anaspec	AS65097	peptide substrate
HEPES	Sigma-aldrich	7365-45-9	EB buffer
Hydrogen peroxide 30% solution	Sigma-aldrich	Z00183-99-0	initiator
M2 FLAG antibody slurry	Millipore-Sigma	A2220	Protein purification
Macrosep 10K Filter (Pall Lab)	VWR	89131-980	Protein purification
Neutravidin Plate	Thermo Sci	15127	BSA-pre-blocked
NP40 (IGEPAL)	MP Biomedical	198596	20x buffer
pHEK-293 plasmid	Takara Bio	3390	Protein expression
Phosphate Buffered Saline 10x	Alfa Aesar	Z00082-33-6	wash buffer
Pra peptide	Genscript	Custom synthesis	biotinylated
Sodium Ascorbate	Sigma-aldrich	134-03-2	Click chemistry
Sodium chloride	Sigma-aldrich	7647-14-5	EB buffer
Sodium phosphate	VWR International	7558-80-7	buffer
Streptavidin	EMD Millipore	189730	competitor
Streptavidin-HRP	Cell Signaling	3999S	enzyme
THPTA ligand	Fisher Sci	1010-500	Click chemistry
Tris base	Sigma-aldrich	77-86-1	20x buffer
Triton-X 100	VWR International	9002-93-1	EB buffer
Tween-20	Sigma-aldrich	9005-64-5	Wash buffer
Urea	Sigma-Aldrich	57-13-6	quencher