Histon Asetiltransferaz 1 Asetilasyonunu Ölçmek için Bir Asetil-Tıklama Kimyası Testi

Özet

Spesifik inhibitörleri taramak için hızlı ve doğru kimyasal tahliller, ilaç geliştirme cephaneliğinde önemli bir araçtır. Burada, HAT1 asetilasyon aktivitesinin inhibisyonunu ölçmek için ölçeklenebilir bir asetil-tıklama kimyası testi sunuyoruz.

Özet

Histon asetiltransferaz 1 olarak da bilinen HAT1, nükleozom montajından önce ortaya çıkan H4'ü stabilize ederek ve asetilleyerek kromatin sentezinde çok önemli bir rol oynar. Çeşitli sistemlerde tümör büyümesi için gereklidir, bu da onu kanser tedavisi için potansiyel bir hedef haline getirir. HAT1 enzimatik aktivitesini inhibe edebilen bileşiklerin tanımlanmasını kolaylaştırmak için, hızlı tarama için bir asetil-tıklama testi tasarladık. Bu basit tahlilde, aktive edilmiş insan hücrelerinden saflaştırılan rekombinant HAT1 / Rbap46 kullanıyoruz. Yöntem, bir tıklama kimyası yaklaşımında asetil-CoA analoğu 4-pentinoil-CoA'yı (4P) kullanır. Bu, bir alkin sapının, HAT1'e bağlı bir asilasyon reaksiyonu yoluyla biyotinillenmiş bir H4 N-terminal peptidine enzimatik transferini içerir. Yakalanan peptit daha sonra nötravidin plakaları üzerinde hareketsiz hale getirilir, ardından biyotin-azid ile tıklama kimyası işlevselleştirilmesi yapılır. Daha sonra, amplex kırmızısını oksitlemek için streptavidin-peroksidaz alımı kullanılır ve bu da kantitatif bir floresan çıktısı ile sonuçlanır. Asilasyon reaksiyonu sırasında kimyasal inhibitörler ekleyerek, floresan sinyalinin azalmasına dayalı olarak enzimatik inhibisyonu ölçebiliriz. Daha da önemlisi, bu reaksiyon ölçeklenebilir ve HAT1 enzimatik aktivitesi için potansiyel inhibitörlerin yüksek verimli taranmasına izin verir.

Giriş

Çok sayıda ökaryotik asetiltransferaz arasında HAT1,^{izole edilecek ilk} histon asetiltransferazdı ^1,2,3. Daha sonraki araştırmalar, kromatin replikasyonunda, özellikle S-fazı⁴ sırasında yeni nükleozomların sentezinde önemli rolünü sağlam bir şekilde ortaya koymuştur. Araştırma çabalarımız, HAT1'in meme hücrelerinde^epidermal büyüme faktörü (EGF) tedavisi ile yüksek oranda uyarıldığının kabul edilmesine yol açmıştır 5. Ayrıca, HAT1'in hızlı hücre proliferasyonu ve tümör oluşumu için gerekli olduğu ortaya çıkmıştır in vivo<....

Protokol

1. Yöntem 1: Rekombinant HAT1/Rbap46 kompleksinin üretilmesi ve saflaştırılması

1. HEK293f hücrelerinin çözülmesi, kurtarılması ve genişletilmesi
   1. 100 mL'lik bir şişede 1-10 milyon HEK293f memeli hücresini²⁶ 30 mL serbest stil 293 ekspresyon ortamına çözün. 60 rpm'de dönerken 37 °C'de% 8 CO₂ içinde inkübe edin.
   2. Ertesi gün, hücre canlılığını sayın ve kontrol edin, ardından dönüş hızını 120 rpm'ye ayarlayın. 1 L'lik bir şişede 300 mL kültüre genişletin, tohumlama yoğunluğunu 500.000 hücre/mL'de tutun ve yoğunluk 3 x 10⁶ hücre/mL'yi aşmadan hücreleri bölün.
2. HEK293....

Tartışmalar

Son on yılda, tıklama kimyası öne çıktı²⁰ ve etkileşen kimyasal yapıların hassas tasarımını mümkün kıldı. Bu bağlamda, çeşitli biyoortogonal kovalent bağlantılar²¹ doğal ortamlarında kompleksler oluşturmak için umut verici seçenekler olarak ortaya çıkmıştır. Tıklama kimyası, genellikle "tıklama reaksiyonları" olarak bilinen hızlı ve seçici reaksiyonlar sergileyen fonksiyonel grup çiftlerini kullanır. Bu reaksiyonlar, çevre dostu, yu.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
4P CoA	Cayman Chemical	10547	Click chemistry co-factor
Amplex Red	Fisher Sci	A12222	Fluorescence substrate
Biotin-PEG-Azide	Alfa Aesar	J64996MC	Click chemistry
Copper Sulfate	Sigma-aldrich	7758-98-7	Click chemistry
DMSO	Fisher Scientific	67-68-5	diluent
DTT	Acros Organics	03-12-3483	reducting agent
Forskolin	VWR	102987-310	Protein expression
Freestyle 293 Expression Medium	Thermo Fisher	12338018	Media
Freestyle 293-F cells	Thermo Fisher	R790-07	Protein expression
H4-peptide/1-23-GGK-biotin	Anaspec	AS65097	peptide substrate
HEPES	Sigma-aldrich	7365-45-9	EB buffer
Hydrogen peroxide 30% solution	Sigma-aldrich	Z00183-99-0	initiator
M2 FLAG antibody slurry	Millipore-Sigma	A2220	Protein purification
Macrosep 10K Filter (Pall Lab)	VWR	89131-980	Protein purification
Neutravidin Plate	Thermo Sci	15127	BSA-pre-blocked
NP40 (IGEPAL)	MP Biomedical	198596	20x buffer
pHEK-293 plasmid	Takara Bio	3390	Protein expression
Phosphate Buffered Saline 10x	Alfa Aesar	Z00082-33-6	wash buffer
Pra peptide	Genscript	Custom synthesis	biotinylated
Sodium Ascorbate	Sigma-aldrich	134-03-2	Click chemistry
Sodium chloride	Sigma-aldrich	7647-14-5	EB buffer
Sodium phosphate	VWR International	7558-80-7	buffer
Streptavidin	EMD Millipore	189730	competitor
Streptavidin-HRP	Cell Signaling	3999S	enzyme
THPTA ligand	Fisher Sci	1010-500	Click chemistry
Tris base	Sigma-aldrich	77-86-1	20x buffer
Triton-X 100	VWR International	9002-93-1	EB buffer
Tween-20	Sigma-aldrich	9005-64-5	Wash buffer
Urea	Sigma-Aldrich	57-13-6	quencher