Histon Asetiltransferaz 1 Asetilasyonunu Ölçmek için Bir Asetil-Tıklama Kimyası Testi

Özet

Spesifik inhibitörleri taramak için hızlı ve doğru kimyasal tahliller, ilaç geliştirme cephaneliğinde önemli bir araçtır. Burada, HAT1 asetilasyon aktivitesinin inhibisyonunu ölçmek için ölçeklenebilir bir asetil-tıklama kimyası testi sunuyoruz.

Özet

Histon asetiltransferaz 1 olarak da bilinen HAT1, nükleozom montajından önce ortaya çıkan H4'ü stabilize ederek ve asetilleyerek kromatin sentezinde çok önemli bir rol oynar. Çeşitli sistemlerde tümör büyümesi için gereklidir, bu da onu kanser tedavisi için potansiyel bir hedef haline getirir. HAT1 enzimatik aktivitesini inhibe edebilen bileşiklerin tanımlanmasını kolaylaştırmak için, hızlı tarama için bir asetil-tıklama testi tasarladık. Bu basit tahlilde, aktive edilmiş insan hücrelerinden saflaştırılan rekombinant HAT1 / Rbap46 kullanıyoruz. Yöntem, bir tıklama kimyası yaklaşımında asetil-CoA analoğu 4-pentinoil-CoA'yı (4P) kullanır. Bu, bir alkin sapının, HAT1'e bağlı bir asilasyon reaksiyonu yoluyla biyotinillenmiş bir H4 N-terminal peptidine enzimatik transferini içerir. Yakalanan peptit daha sonra nötravidin plakaları üzerinde hareketsiz hale getirilir, ardından biyotin-azid ile tıklama kimyası işlevselleştirilmesi yapılır. Daha sonra, amplex kırmızısını oksitlemek için streptavidin-peroksidaz alımı kullanılır ve bu da kantitatif bir floresan çıktısı ile sonuçlanır. Asilasyon reaksiyonu sırasında kimyasal inhibitörler ekleyerek, floresan sinyalinin azalmasına dayalı olarak enzimatik inhibisyonu ölçebiliriz. Daha da önemlisi, bu reaksiyon ölçeklenebilir ve HAT1 enzimatik aktivitesi için potansiyel inhibitörlerin yüksek verimli taranmasına izin verir.

Giriş

Çok sayıda ökaryotik asetiltransferaz arasında HAT1,^{izole edilecek ilk} histon asetiltransferazdı ^1,2,3. Daha sonraki araştırmalar, kromatin replikasyonunda, özellikle S-fazı⁴ sırasında yeni nükleozomların sentezinde önemli rolünü sağlam bir şekilde ortaya koymuştur. Araştırma çabalarımız, HAT1'in meme hücrelerinde^epidermal büyüme faktörü (EGF) tedavisi ile yüksek oranda uyarıldığının kabul edilmesine yol açmıştır 5. Ayrıca, HAT1'in hızlı hücre proliferasyonu ve tümör oluşumu için gerekli olduğu ortaya çıkmıştır in vivo 6,7,8,9. Veriler, HAT1'in hücre bölünmesi için anabolik ve epigenetik süreçleri koordine etmede kritik olduğunu ve tümör büyümesini yönlendirdiğini göstermektedir.

HAT1, histon H4'ün amino terminal kuyruğunu, histonu bağlayan ve amino terminalini HAT1'e sunan şaperon proteini Rbap46 ile kompleks halinde lizin 5 ve 12 üzerinde di-asetillenir. Histon tetramerleri veya disomları¹⁰, HAT1/Rbap46 ve diğer histon şaperonları¹¹ ile birlikte daha sonra çekirdeğe aktarılır. Histonlar daha sonra replikasyon çatalında veya gen aktivasyonunu veya baskılanmasını desteklemek için diğer bölgelerde biriktirilmek üzere serbest bırakılır. HAT1 di-asetilasyon işaretinin histon H4 üzerindeki işlevi tam olarak anlaşılmamıştır. H4 kromatine yerleştirildikten sonra^histon deasetilaz 12,13,14,15'in etkisiyle 15-30 dakikalık bir süre içinde muhtemelen hızlı bir şekilde çıkarılır. Bu nedenle, HAT1 di-asetilasyon işareti kromatin içinde yayılmaz ve kromatin modifiye edici enzimlerin yeni ortaya çıkan kromatine alınmasında bir rol olduğu öne sürülmesine rağmen, gerçek bir epigenetik role hizmet etmeyebilir¹². Ayrıca, HAT1 kromatini doğrudan asetillemez; Aktivitesi çözünür histonlarla sınırlıdır.

Küçük moleküllü histon asetiltransferaz inhibitörlerinin geliştirilmesi, spesifik olmayan ve düşük verimli deneyler tarafından engellenmiştir ve bu da genellikle biyolojik olarak reaktif bileşiklerin^{üretilmesine neden olmuştur 16,17}. Asetiltransferaz aktivitelerini ölçmek için altın standart tahlil, verimi sınırlayan ve radyasyon gerektiren ³H-asetil-coA kullanımını gerektirir. Bununla birlikte, son zamanlarda, CBP / p300¹⁸ ve KAT6A / B 19,20'yi hedefleyen spesifik ve oldukça güçlü küçük moleküllü asetiltransferaz inhibitörleri tanımlanmış ve ³H-asetil-CoA kullanımı ile doğrulanmıştır. İleriye dönük olarak, daha iyi verim elde etmek ve laboratuvar tehlikelerinden kaçınmak için geliştirilmiş tahliller tasarlanmaktadır.

Asetilasyon izleme^21'deki son gelişmeler, enzimatik reaksiyon izlemeyi sağlamak için tıklama kimyasını kullanmıştır. Basit sentetik yollarla erişilebilen veya enzim reaksiyonlarına dahil edilebilen satın alınabilen çeşitli tıklama özellikli öncüler vardır. Bu reaksiyonlar tipik olarak rekombinant sistemlerde gerçekleştirilir, ancak hücre bazlı tahliller de mümkündür²². Tıklama özellikli kofaktörlerin ve substratların avantajı, taramanın, genellikle tarama bileşikleri tarafından bozulan ve ek işleme adımları gerektiren birleştirilmiş okuma sistemlerine ihtiyaç duymadan enzim aktivitesini doğrudan ölçebilmesidir. Bu, inhibitör tedavilerine yalnızca enzimatik adım sırasında izin verirken, tüm aşağı akış işlevselleştirme ve tespit adımları, bileşikleri uzaklaştırmak için kapsamlı yıkamadan sonra gerçekleştirilir, böylece tahlil girişiminin meydana gelme potansiyelini sınırlar. Bu avantajlar, tıklama özellikli testlerin tasarımını, genellikle serbest koenzim A'nın saptanmasına dayanan birleştirilmiş tahlillere tercih edilir hale getirir.

Önemli bir husus, tıklama özellikli kofaktörlerin enzim aktif bölgesine kabul edilmesidir. Mevcut tıklamanın etkin olduğu ortak faktörler, yerel ortak faktör için optimize edilmiş etkin siteyle tam olarak uyumlu olmayabilir. Yapısal bilgi ve modelleme, değiştirilmiş substratları dahil etmek için aktif bölgeyi genişletmek için amino asit ikamelerini tasarlamak için kullanılabilir²³. Bu, gelişmiş enzim kinetiği ve daha düşük substrat ve enzim seviyeleri ile taramayı mümkün kılabilir. Bu yaklaşımın dezavantajı, değiştirilmiş katalitik ceplerin, doğal enzimle güçlü bir şekilde etkileşime giren inhibitörleri tanımlayamamasıdır. Sonuç olarak, potansiyel enzim inhibitörlerini tanımlamak ve doğrulamak için yaklaşımların bir kombinasyonu gereklidir.

Burada, tıklama ko-faktörü 4-pentinoil-CoA²⁴ kullanarak HAT1 enzim aktivitesini saflaştırmak ve test etmek için geliştirilmiş bir yöntemi açıklıyoruz. Bu test (Şekil 1), enzim aktivitesini arttırdığı gösterilen gerekli ortak proteini Rbap46 ile kompleks halinde doğal enzim dizisini kullanır. Enzimin insan hücrelerinden saflaştırılması, tam enzim aktivitesi için önemli olan uyarıcı translasyon sonrası modifikasyonları koruyabilen selülde enzim aktivasyonuna izin verir. Yüksek verimli kimyasal ekranlar için rekombinant enzim deneylerinin tasarımı ve optimizasyonu, HAT1 küçük molekül inhibitörlerini tanımlamak ve karakterize etmek için başarıyla kullanılmıştır.

Protokol

1. Yöntem 1: Rekombinant HAT1/Rbap46 kompleksinin üretilmesi ve saflaştırılması

1. HEK293f hücrelerinin çözülmesi, kurtarılması ve genişletilmesi
   1. 100 mL'lik bir şişede 1-10 milyon HEK293f memeli hücresini²⁶ 30 mL serbest stil 293 ekspresyon ortamına çözün. 60 rpm'de dönerken 37 °C'de% 8 CO₂ içinde inkübe edin.
   2. Ertesi gün, hücre canlılığını sayın ve kontrol edin, ardından dönüş hızını 120 rpm'ye ayarlayın. 1 L'lik bir şişede 300 mL kültüre genişletin, tohumlama yoğunluğunu 500.000 hücre/mL'de tutun ve yoğunluk 3 x 10⁶ hücre/mL'yi aşmadan hücreleri bölün.
2. HEK293f transfeksiyon
   1. 1 L'lik bir şişede 300 mL kültürde 5 x^{10 5} hücre / mL tohumlayın ve 24 saat boyunca kültürleyin. Ertesi gün, 7,5 x 10⁵ ila 1,2 x 10⁶ hücre/mL arasında olduklarından emin olmak için hücreleri sayın.
   2. 30 mL PBS'de 300 μg pHEK-FLAG-HAT1 ve 300 μg pHEK-Rbap46 plazmit DNA'larının bir karışımını hazırlayın. DNA/PBS'ye 1.2 mL polietilenimin (PEI) ekleyin ve karıştırın. DNA/PBS/PEI karışımını 300 mL kültüre ekleyin ve 37 °C'de 120 rpm'de 48 saat inkübe edin.
3. Hasat hücreleri
   1. 1,7 x 10⁶ ila 2,5 x 10⁶ hücre/mL arasında olduklarından emin olmak için hücreleri sayın. Bu hücre yoğunluğunda, HAT1'i aktive etmek ve hücreleri 30 dakika, 37 °C, 120 rpm inkübe etmek için 12.5 μM'lik bir son konsantrasyona forskolin ekleyin.
   2. Hücreleri 5 dakika boyunca 300 x g'da pelet haline getirin, bir kez 30 mL PBS ile yıkayın ve sıvı_N2'de dondurun. Protein saflaştırılana kadar -80 °C'de saklayın veya doğrudan saflaştırmaya devam edin.
4. HAT1/Rbap46 kompleks BAYRAK boncuk saflaştırma
   1. Hücreleri parçalayın ve protein özü hazırlayın.
      1. 50 mL RSB-500'e (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 500 mM NaCl, 25 mM MgCl₂) bir tablet proteaz inhibitör kokteyli (PIC) ekleyerek lizis tamponu hazırlayın.
      2. 300 mL kültürden elde edilen hücre peletini buz üzerinde çözdürün ve %0.1 Triton X-100 ile 40 mL buz gibi soğuk lizis tamponu ile parçalayın. Buz üzerinde sonikate, daha sonra 4 ° C'de 10 dakika boyunca 10.000 x g'de döndürün. Tüm süpernatanı, şimdi protein özü olan buz üzerinde 50 mL'lik bir tüpte toplayın.
   2. BAYRAK boncukları hazırlayın.
      1. 5 mL 0,1 M Glisin pH 3,5,% 0,01 Triton X-100 içeren her tüpe 400 μL M2-FLAG agaroz boncuk bulamacı ekleyerek FLAG boncuklarını dört adet 15 mL'lik konik tüpe bölün. Her tüpü elle 5 saniye kuvvetlice çalkalayın.
      2. 4 ° C'de 1000 x g'de 30 saniye boyunca nabız santrifüjü, süpernatanı aspire edin, 5 mL RSB-500 +% 0.1 Triton X-100 (Tx-100; proteaz inhibitörü yok) ile iki kez yıkayın ve buz üzerinde inkübe edin.
   3. FLAG immünopresipitasyon gerçekleştirin.
      1. Yıkanmış boncuklar içeren her 15 mL konik tüpe 10 mL protein özü ekleyin. Tüpleri 4 ° C'de ters dönüşle en az 90 dakika veya gece boyunca inkübe edin.
      2. Bağlı boncukları 5x 10 mL RSB-500 +% 0.1 Tx-100 içinde yıkayın. Her yıkama için, boncukları yeniden süspanse etmek için tüpü 2x-5x ters çevirin, ardından 4 °C'de 1 dakika boyunca 1000 x g'da pelet yapın. Son olarak, RSB-100 (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl, 25 mM MgCl₂) +% 0.1 Tx-100'de 1 kez yıkayın.
   4. FLAG peptit elüsyonu: 0.5 mg / mL FLAG peptidi içeren 1.5 mL Elüsyon Tamponu (EB) içinde HAT1 kompleksini elute edin. 4 °C'de en az 1 saat veya gece boyunca inkübe edin. Ayrıştırılmış boncukları 4 °C'de 30 saniye boyunca 1000 x g'da darbeli santrifüjleyin ve saflaştırılmış HAT1/Rbap46 kompleksini içeren süpernatanı toplayın.
   5. Proteini konsantre edin ve FLAG peptidini çıkarın.
      1. 20 mL, 10.000 Dalton'luk bir kesme filtre tüpüne elüat ekleyin. EB ile hacmi 15 mL'ye getirin. 4 ° C'de 15 dakika boyunca 2500 x g'da döndürün, her seferinde ek 15 mL EB ile iki kez tekrarlayın.
      2. Filtre tüpünden son elüatı geri kazanın ve protein konsantrasyonunu A260 ile kontrol edin. 6 mL EB'de (300 mL başlangıç kültürü başına) 1 mg toplam protein konsantrasyonu bekleyin. SDS-PAGE, Coomassie ve immünoblotlama ile protein saflığını kontrol edin ve alikotları -80 ° C'de saklayın.

2. Yöntem 2: HAT1 asetil tıklama standart eğrisi

1. Standart eğrinin hazırlanması
   1. Pozitif bir kontrol H4 N-terminal peptidini şu sırayla sentezleyin: SCRG [Pra] GGKGLG [Pra] GGAKRHRKVLRGG [Lys (Biotin)], burada [Pra] Propargilglisin anlamına gelir.
   2. Pra peptidini DMSO'da 0.1 mg / mL'ye yeniden süspanse edin. Standart bir eğri oluşturmak için Pra peptidini biyotinile histon H4 peptidi (1-23-GGK-biotin) ile karıştırın (Şekil 2; Tablo 1'de bulunan hacimler). Standart eğriler, plaka bağlamadan önce taze olarak yapılabilir veya önceden yapılmışsa, 20 μL 8 M üre ile karıştırılabilir ve adım 3.3'e kadar -20 ° C'de saklanabilir.

3. Yöntem 3: HAT1 asetil-tıklama testi

1. Asetilasyon reaksiyonlarının test inhibitörleri ile birleştirilmesi
   1. Aşağıdaki bileşenlerden 0.2 mL PCR tüplerinde veya 96 oyuklu PCR plakalarında iki kopya halinde asetilasyon reaksiyonlarını birleştirin: DMSO'da 0.1 mg / mL'ye (34.8 μM) yeniden süspanse edilmiş biyotinile histon H4 peptidi (1-23-GGK-biotin), EB içinde önceden seyreltilmiş HAT1 enzimi, 20x tampon (1M Tris pH 8.5,% 0.1 NP40), 2 mM DTT, suda 1 mg / mL'ye (1 mM) çözülmüş 4-pentinoil-CoA. 20 μL'lik bir reaksiyon, 10 μL enzim, 1 μL H4 peptit, 1 μL 20x tampon, önceden karıştırılmış 1 μL DTT içerir ve buz üzerinde 96 oyuklu bir PCR plakasının kuyucuklarına gönderilir.
   2. Kuyucuk başına 1 μL DMSO (negatif kontrol) veya 1-10 μM'de çözünmüş test bileşiği veya H4K12CoA²⁵ (veya uygun pozitif kontrol inhibitörü) ekleyin. Nazikçe pipetleyerek karıştırın ve enzim: inhibitör komplekslerinin oluşmasını sağlamak için buz üzerinde 10 dakika inkübe edin.
2. Asetilasyon reaksiyonunun devamı
   1. 2 μL 4-pentinoil-CoA'yı 4 μL su ile birleştirin, ardından kuyucuklara ekleyin. Pipetleme ile nazikçe karıştırın, içeriği toplamak için RT'de 300 s boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve 37 °C'de 1 saat boyunca kapaklı tüplerde veya yeniden kapatılabilir folyolu plakalarda inkübe edin.
   2. İçeriği doğrudan reaksiyon ürünleri için işleyin veya 20 μL 8 M üre ile söndürün ve işlenene kadar -20 °C'de saklayın.
3. Neutravidin plakasına peptit bağlanması
   1. Kuyucuk başına 80 μL PBST (PBS +% 0.1 Tween-20) içeren sığır serum albümini (BSA) önceden bloke edilmiş siyah Nötravidin kaplı 96 oyuklu plakalara üreli veya üresiz reaksiyon içerikleri ekleyin.
   2. Standart eğri peptitleri, 80 μL PBST içeren kendi kuyucuklarına iki kopya halinde ekleyin. Peptitleri oda sıcaklığında (RT) 1 saat boyunca hafif yörüngesel çalkalama ile bağlayın.
4. Yıkama: Bağlama işlemi tamamlandıktan sonra, sıvıyı kuyulardan aspire edin ve kuyuları bir plaka yıkayıcı kullanarak 200 μL PBST 3x 15 strok (180 μL strok hacmi) ile yıkayın.
5. Kimya reaksiyonunu tıklayın
   1. Tıklama reaksiyonu için reaktifleri şu şekilde hazırlayın: suda 100 mM Tris(3-hidroksipropiltriazolimetil)amin (THPTA) ligandı ve suda 20 mM_CuS4 . THPTA, Cu (II) katalizli hidrolizi önler ve_O2 / Cu / askorbattan üretilen radikalleri ve peroksitleri söndürür.
   2. THPTA/Cu karışımını suda 300 mM sodyum askorbata ve DMSO'da 2.5 mM biotin azide ekleyin. Tek tıklamayla reaksiyon 140 μL PBS, 10 μL THPTA, 10 μL_CuS4, 10 μL sodyum askorbat, 20 μL biyotin-azid içerir. Tıklama reaktiflerini her zaman taze olarak karıştırın, ardından her bir oyuğa 190 μL dağıtın, plakayı kapatın ve 37 ° C'de 1 saat inkübe edin.
6. Yıkama: Sıvıyı kuyulardan aspire edin ve plakayı 3x PBST ile yıkayın (180 μL strok hacmi, her yıkama için 15 strok).
7. Streptavidin-yaban turpu peroksidaz bağlanması: Streptavidin (0.224 mg / mL) streptavidin-HRP'yi (0.224 mg / mL) 1:10 oranında seyreltin, ardından PBST'de 1:1000 oranında seyreltin. Steptavidin-HRP: streptavidin karışımı (oyuk başına 100 μL) ekleyin ve hafif yörünge çalkalama ile 1 saat boyunca RT'de inkübe edin.
8. Önceki adımlarda olduğu gibi PBST ile 3 kez yıkayın.
9. Amplex kırmızı oksidasyon
   1. Amplex kırmızı tespit reaktiflerini aşağıdaki gibi birleştirin: 4.45 mL NaHPO₄ tamponu (1x = 50 mM nihai konsantrasyon), 50 μL amplex kırmızı (DMSO'da seyreltilmiş 20 mM), 500 μL seyreltilmiş_H2O2.
   2. H2O2'yi 1x NaHPO 4 tamponunda %30 stoktan %3'e seyreltin, ardından 977 μL 1x NaHPO₄ tamponuna 22.7 μL %3_H2O2ekleyin (bu, amplex reaksiyonu için kullanılan _H2O2'dir). Oyuk başına 100 μL amplex kırmızı reaksiyon karışımı ekleyin, RT'de 30 dakika boyunca ışıktan korunarak inkübe edin, ardından standart bir floresan plaka okuyucu kullanarak floresan uyarımını/emisyonunu 571/585 nm tespit edin.
10. Enzim inhibisyonunun hesaplanması: İnhibisyon yüzdesini hesaplayın (Şekil 3) aşağıdaki formüle göre: burada D sadece DMSO ile muamele edilen kontrol reaksiyonlarının floresan değeridir, X test bileşikleri ile muamele edilen reaksiyonların değeridir ve BG arka plan kuyularının değeridir (H4 peptit kontrolü, enzim eklenmemiş).
11. Doz eğrisi: Bileşik seri olarak seyreltilmişken, tekrar tahliller için HAT1 enzim aktivitesini inhibe ettiği tespit edilen test bileşiklerini seçin. Bileşik dilüsyonları ampirik olarak belirleyin. Örneğin, 2 mM stok konsantrasyonu ile başlayın, ardından sekiz seyreltme için seri olarak 1:3 oranında seyreltin. Daha sonra 1:20 oranında seyrelterek 100 μM üst doz veren enzim tahlillerine seyreltin.
    1. Eğrinin çizilmesi: Veri analiz yazılımında (GraphPad Prism) doz-yanıt inhibisyon eğrilerine (adım 3.10'daki yüzde inhibisyon değerlerini kullanarak) uyması için en küçük kareler regresyonunu kullanın ve her bileşik için IC₅₀ değerleri türetin (Şekil 4).
12. Asetil-CoA ile asetilasyon reaksiyonu:
    1. Enzim aktivitesini 4-pentinoil-CoA yerine doğal kofaktör asetil-CoA ile doğrulamak için bunu kullanın. HAT1 asetilasyon testlerini 3.1-3.2 adımlarında açıklandığı gibi 4-pentinoil-CoA yerine asetil-CoA ile gerçekleştirin.
    2. Reaksiyon ürünlerini nitroselüloz membranlara (1-2 μL) yerleştirin, kurumasını bekleyin, ardından anti-H4-lizin-12-asetil veya anti-H4-lizin-5-asetil antikorları ile nokta-lekeleyin. İmmünoblot sinyalini dansitometri ile ölçün.

Sonuçlar

Uygun tahlil performansını sağlamak için her plakaya çift (16 kuyucuk) standart eğriler dahil edilmelidir. Standart eğri verileri, Pra içeren peptitin çözeltideki doğal H4 peptidine oranına göre %100 ila %0 aralığında tablo şeklinde ayarlanmalıdır (Tablo 1). Amplex kırmızı sinyal, %100 pra/%0 doğal H4 peptit kuyularında en yüksek ve %0 pra/%100 doğal H4 peptit kuyularında en düşük olacaktır. Floresan tespit edildikten ve kuyuların ortalaması alındıktan sonra, ortaya ç?...

Tartışmalar

Son on yılda, tıklama kimyası öne çıktı²⁰ ve etkileşen kimyasal yapıların hassas tasarımını mümkün kıldı. Bu bağlamda, çeşitli biyoortogonal kovalent bağlantılar²¹ doğal ortamlarında kompleksler oluşturmak için umut verici seçenekler olarak ortaya çıkmıştır. Tıklama kimyası, genellikle "tıklama reaksiyonları" olarak bilinen hızlı ve seçici reaksiyonlar sergileyen fonksiyonel grup çiftlerini kullanır. Bu reaksiyonlar, çevre dostu, yu...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
4P CoA	Cayman Chemical	10547	Click chemistry co-factor
Amplex Red	Fisher Sci	A12222	Fluorescence substrate
Biotin-PEG-Azide	Alfa Aesar	J64996MC	Click chemistry
Copper Sulfate	Sigma-aldrich	7758-98-7	Click chemistry
DMSO	Fisher Scientific	67-68-5	diluent
DTT	Acros Organics	03-12-3483	reducting agent
Forskolin	VWR	102987-310	Protein expression
Freestyle 293 Expression Medium	Thermo Fisher	12338018	Media
Freestyle 293-F cells	Thermo Fisher	R790-07	Protein expression
H4-peptide/1-23-GGK-biotin	Anaspec	AS65097	peptide substrate
HEPES	Sigma-aldrich	7365-45-9	EB buffer
Hydrogen peroxide 30% solution	Sigma-aldrich	Z00183-99-0	initiator
M2 FLAG antibody slurry	Millipore-Sigma	A2220	Protein purification
Macrosep 10K Filter (Pall Lab)	VWR	89131-980	Protein purification
Neutravidin Plate	Thermo Sci	15127	BSA-pre-blocked
NP40 (IGEPAL)	MP Biomedical	198596	20x buffer
pHEK-293 plasmid	Takara Bio	3390	Protein expression
Phosphate Buffered Saline 10x	Alfa Aesar	Z00082-33-6	wash buffer
Pra peptide	Genscript	Custom synthesis	biotinylated
Sodium Ascorbate	Sigma-aldrich	134-03-2	Click chemistry
Sodium chloride	Sigma-aldrich	7647-14-5	EB buffer
Sodium phosphate	VWR International	7558-80-7	buffer
Streptavidin	EMD Millipore	189730	competitor
Streptavidin-HRP	Cell Signaling	3999S	enzyme
THPTA ligand	Fisher Sci	1010-500	Click chemistry
Tris base	Sigma-aldrich	77-86-1	20x buffer
Triton-X 100	VWR International	9002-93-1	EB buffer
Tween-20	Sigma-aldrich	9005-64-5	Wash buffer
Urea	Sigma-Aldrich	57-13-6	quencher