히스톤 아세틸전이효소 1 아세틸화를 측정하기 위한 아세틸 클릭 화학 분석

요약

특정 억제제를 스크리닝하기 위한 빠르고 정확한 화학 분석은 약물 개발 무기고에서 중요한 도구입니다. 여기에서는 HAT1 아세틸화 활성의 억제를 측정하기 위한 확장 가능한 아세틸 클릭 화학 분석을 제시합니다.

초록

히스톤 아세틸전이효소 1(Histone acetyltransferase 1)이라고도 하는 HAT1은 뉴클레오솜 조립 전에 초기 H4를 안정화하고 아세틸화하여 염색질 합성에 중요한 역할을 합니다. 다양한 시스템에서 종양 성장에 필요하므로 암 치료의 잠재적 표적이 될 수 있습니다. HAT1 효소 활성을 억제할 수 있는 화합물의 식별을 용이하게 하기 위해 당사는 신속한 스크리닝을 위한 아세틸 클릭 분석을 고안했습니다. 이 간단한 분석에서는 활성화된 인간 세포에서 정제된 재조합 HAT1/Rbap46을 사용합니다. 이 방법은 클릭 화학 접근 방식에서 아세틸-CoA 아날로그 4-펜티노일-CoA(4P)를 활용합니다. 여기에는 HAT1 의존성 아실화 반응을 통해 비오틴화된 H4 N-말단 펩타이드로 알카인 핸들의 효소 전달이 포함됩니다. 그런 다음 포획된 펩타이드를 뉴트라비딘 플레이트에 고정시킨 후 비오틴-아지드로 클릭 화학 기능화를 수행합니다. 그 후, 스트렙타비딘-퍼옥시다아제 모집을 사용하여 amplex red를 산화시켜 정량적 형광 출력을 생성합니다. 아실화 반응 중에 화학적 억제제를 도입하면 형광 신호의 감소를 기반으로 효소 억제를 정량화할 수 있습니다. 중요한 것은 이 반응이 확장 가능하여 HAT1 효소 활성에 대한 잠재적 억제제의 고처리량 스크리닝이 가능하다는 것입니다.

서문

수많은 진핵 아세틸 전이 효소 중에서, HAT1은 ^1,2,3 분리 될 초기 히스톤 아세틸 전이 효소였습니다. 후속 연구는 염색질 복제, 특히 S상⁴단계 동안 새로운 뉴클레오솜 합성에서 중추적인 역할을 확고하게 확립했습니다. 우리의 연구 노력은 HAT1이 유방 세포의 표피 성장 인자(EGF) 치료에 의해 매우 자극된다는 것을 인식하게 했다⁵. 또한, HAT1은 생체 내 빠른 세포 증식 및 종양 형성에 필요하다는 것이 밝혀졌습니다 6,7,8,9. 데이터에 따르면 HAT1은 세포 분열을 위한 동화 작용 및 후성유전학적 과정을 조정하여 종양 성장을 촉진하는 데 중요한 역할을 합니다.

HAT1은 히스톤을 결합하고 아미노 말단을 HAT1에 제시하는 샤페론 단백....

프로토콜

1. 방법 1: 재조합 HAT1/Rbap46 복합체 생산 및 정제

1. HEK293f 세포 해동, 회수 및 확장
   1. 1-1,000만 HEK293f 포유류 세포²⁶ 개를 100mL 플라스크에서 30mL 자유형 293 발현 배지로 해동합니다. 60 rpm으로 회전하면서 37 °C에서 8 % CO₂ 에서 배양합니다.
   2. 다음날 세포 생존율을 계산하고 확인한 다음 회전 속도를 120rpm으로 조정합니다. 1L 플라스크에서 300mL 배양액으로 확장하여 파종 밀도를 500,000 cells/mL로 유지하고 밀도가 3 x 10⁶ cells/mL를 초과하기 전에 세포를 분할합니다.
2. HEK293f 트랜스펙션
   1. 1L 플라스크에 300mL 배양액에 5 x 10⁵ 세포/mL를 파종하고 24시간 동안 배양합니다. 다음 날, 세포가 7.5 x 10⁵ 에서 1.2 x 10⁶ cells/mL 사이인지 확인하기 위해 세포를 세십시오.
   2. 30mL의 PBS에 300μg의 pHEK-FLAG-HAT1과 300μg의 pHEK-Rbap46 플라스미드 DNA의....

토론

지난 10년 동안 클릭 화학^{이 두각}을 나타내면서 상호 작용하는 화학 구조의 정밀한 설계가 가능해졌습니다. 이러한 맥락에서, 다양한 생체 직교 공유 연결(bioorthogonal covalent connections)²¹ 은 자연 환경에서 복합체를 형성하기 위한 유망한 옵션으로 등장했다. 클릭 화학은 일반적으로 "클릭 반응"으로 알려진 빠르고 선택적인 반응을 나타내는 작용기 쌍을 사용합니?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
4P CoA	Cayman Chemical	10547	Click chemistry co-factor
Amplex Red	Fisher Sci	A12222	Fluorescence substrate
Biotin-PEG-Azide	Alfa Aesar	J64996MC	Click chemistry
Copper Sulfate	Sigma-aldrich	7758-98-7	Click chemistry
DMSO	Fisher Scientific	67-68-5	diluent
DTT	Acros Organics	03-12-3483	reducting agent
Forskolin	VWR	102987-310	Protein expression
Freestyle 293 Expression Medium	Thermo Fisher	12338018	Media
Freestyle 293-F cells	Thermo Fisher	R790-07	Protein expression
H4-peptide/1-23-GGK-biotin	Anaspec	AS65097	peptide substrate
HEPES	Sigma-aldrich	7365-45-9	EB buffer
Hydrogen peroxide 30% solution	Sigma-aldrich	Z00183-99-0	initiator
M2 FLAG antibody slurry	Millipore-Sigma	A2220	Protein purification
Macrosep 10K Filter (Pall Lab)	VWR	89131-980	Protein purification
Neutravidin Plate	Thermo Sci	15127	BSA-pre-blocked
NP40 (IGEPAL)	MP Biomedical	198596	20x buffer
pHEK-293 plasmid	Takara Bio	3390	Protein expression
Phosphate Buffered Saline 10x	Alfa Aesar	Z00082-33-6	wash buffer
Pra peptide	Genscript	Custom synthesis	biotinylated
Sodium Ascorbate	Sigma-aldrich	134-03-2	Click chemistry
Sodium chloride	Sigma-aldrich	7647-14-5	EB buffer
Sodium phosphate	VWR International	7558-80-7	buffer
Streptavidin	EMD Millipore	189730	competitor
Streptavidin-HRP	Cell Signaling	3999S	enzyme
THPTA ligand	Fisher Sci	1010-500	Click chemistry
Tris base	Sigma-aldrich	77-86-1	20x buffer
Triton-X 100	VWR International	9002-93-1	EB buffer
Tween-20	Sigma-aldrich	9005-64-5	Wash buffer
Urea	Sigma-Aldrich	57-13-6	quencher