تصوير الخلايا الحية المتعددة للاستجابات الدوائية في النماذج العضوية المشتقة من المريض للسرطان

Summary

عضويات الورم المشتقة من المريض هي نظام نموذجي متطور للبحوث الأساسية والانتقالية. توضح مقالة الطرق هذه بالتفصيل استخدام تصوير الخلايا الحية الفلورية المتعددة للتقييم الحركي المتزامن للأنماط الظاهرية العضوية المختلفة.

Abstract

نماذج السرطان العضوية المشتقة من المريض (PDO) هي نظام بحث متعدد الوظائف يلخص بشكل أفضل الأمراض البشرية مقارنة بخطوط الخلايا السرطانية. يمكن إنشاء نماذج شركة تنمية نفط عمان عن طريق زراعة الخلايا السرطانية للمريض في مستخلصات الغشاء القاعدي خارج الخلية (BME) وطلاءها على شكل قباب ثلاثية الأبعاد. ومع ذلك ، فإن الكواشف المتاحة تجاريا والتي تم تحسينها لمقايسات النمط الظاهري في الثقافات أحادية الطبقة غالبا ما تكون غير متوافقة مع BME. هنا ، نصف طريقة للوحة نماذج PDO وتقييم آثار الدواء باستخدام نظام تصوير الخلايا الحية الآلي. بالإضافة إلى ذلك ، نطبق أصباغ الفلورسنت المتوافقة مع القياسات الحركية لتحديد صحة الخلية وموت الخلايا المبرمج في وقت واحد. يمكن تخصيص التقاط الصور ليحدث على فترات زمنية منتظمة على مدار عدة أيام. يمكن للمستخدمين تحليل تأثيرات الدواء في صور Z-plane الفردية أو إسقاط Z للصور التسلسلية من مستويات بؤرية متعددة. باستخدام التقنيع ، يتم حساب معلمات محددة ذات أهمية ، مثل رقم PDO والمساحة وشدة التألق. نحن نقدم بيانات إثبات المفهوم التي توضح تأثير العوامل السامة للخلايا على صحة الخلايا ، وموت الخلايا المبرمج ، والجدوى. يمكن توسيع منصة التصوير الحركي الآلي هذه لتشمل قراءات النمط الظاهري الأخرى لفهم الآثار العلاجية المتنوعة في نماذج PDO للسرطان.

Introduction

تظهر عضويات الورم المشتقة من المريض (PDOs) بسرعة كنظام نموذجي قوي لدراسة تطور السرطان والاستجابات العلاجية. PDOs هي أنظمة زراعة خلايا ثلاثية الأبعاد (3D) تلخص الملف الجينومي المعقد وبنية الورم الرئيسي ^1,2. على عكس الثقافات التقليدية ثنائية الأبعاد (2D) لخطوط الخلايا السرطانية الخالدة ، تلتقط PDOs وتحافظ على عدم التجانس داخل الورم ^3,4 ، مما يجعلها أداة قيمة لكل من البحث الميكانيكي والانتقالي. على الرغم من أن PDOs أصبحت نظاما نموذجيا شائعا بشكل متزايد ، إلا أن الكواشف المتاحة تجاريا وطرق التحليل للتأثيرات الخلوية المتوافقة مع ثقافات شركة تنمية نفط عمان م....

Protocol

تمت مراجعة الدراسات التي تستخدم عينات الورم البشري والموافقة عليها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة أيوا (IRB) ، البروتوكول #201809807 ، وتم إجراؤها وفقا للمعايير الأخلاقية على النحو المنصوص عليه في إعلان هلسنكي لعام 1964 وتعديلاته اللاحقة. تم الحصول على موافقة مستنيرة من جميع الأشخاص المشاركين في الدراسة. تشمل معايير التضمين تشخيص السرطان وتوافر عينات الورم.

1. طلاء PDOs سليمة في لوحة 96 بئر

1. تحضير الكواشف.
   1. سخن ألواح 96 بئرا عند 37 درجة مئوية طوال الليل وقم بإذابة BME طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
   2. قم بإعداد وسائط ثقافة عضوية كاملة محسنة لزراعة نوع السرطان محل الاهتمام. وترد في الجدول ....

النتائج

كان هدفنا هو إثبات جدوى استخدام تصوير الخلايا الحية المتعددة لتقييم الاستجابة العلاجية لشركة تنمية نفط عمان. تم إجراء تجارب إثبات المفهوم في نموذجين منفصلين لشركة تنمية نفط عمان لسرطان بطانة الرحم: ONC-10817 و ONC-10811 (انظر الشكل التكميلي 1 والشكل التكميلي 2 لبيانات ONC-10811). تم ر?.......

Discussion

أصبحت ثقافات شركة تنمية نفط عمان شائعة بشكل متزايد في نظام النماذج المختبرية نظرا لقدرتها على عكس الاستجابات والسلوكيات الخلوية². تم إحراز تقدم كبير في تقنيات توليد PDO وثقافتها وتوسعها ، ومع ذلك فقد تأخرت طرق تحليل الاستجابات العلاجية. مجموعات الجدوى 3D المتاحة تجاريا هي مقاي?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrfuge tube	Dot Scientific Inc	1008113
15 mL conical centrifuge tube	Sarstedt	62.554.100
554 NM LED Cube	Agilent	1225012
96-well plate	Corning Costar	3596	Prewarmed to 37 °C
96-well plate	Agilent	204626-100	Prewarmed to 37 °C
A83-01	Tocris	2939	Final concentration is 500 nM (component of organoid culture media)
Advanced DMEM/F-12	Gibco	12634-010	component of organoid culture media
B27 Supplement	Gibco	17504044	Final concentration is 1x (component of organoid culture media)
BioTek BioSpa 8 Automated Incubator	Agilent	BIOSPAG-SN	Tabletop incubator; BioSpa OnDemand scheduling software comunicates with Gen5 to transfer plates between the BioSpa and the Cytation 5 for imaging (this protocol uses version 1.01.10)
BioTek Cytation 5 Cell Imaging Multimode Reader	Agilent	CYT5PW-SN	Plate reader; Gen5 software is used for this device (this protocol uses version 3.12.08)
Cultrex UltiMatrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract	R&D Systems	BME001-10
Daunorubicin HCl	Sigma-Aldrich	S3035	Reconstituted in DMSO
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2438
EDTA (0.5 M)	Thermo Fisher	AM9260G
Forskolin	Tocris	1099	Final concentration is 10 µM (component of organoid culture media)
Glutamax	Gibco	35050-061	Final concentration is 1x (component of organoid culture media)
HEPES	Gibco	15630-080	Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media)
Human EGF, Animal-Free Recombinant Protein	Gibco	AF-100-15-1MG	Final concentration is 0.5 ng/mL (component of organoid culture media)
Human FGF-10 Recombinant Protein	Gibco	100-26-1MG	Final concentration is 10 ng/mL (component of organoid culture media)
Human R-Spondin 1 Recombinant Protein	Gibco	120-38-5UG	Final concentration is 250 ng/mL (component of organoid culture media)
Hydrocortisone Stock Solution	StemCell Technologies	7926	Final concentration is 500 ng/mL (component of organoid culture media)
Imaging Filter Cube- GFP	Agilent	1225101
Imaging Filter Cube- TRITC	Agilent	1225125
Imaging LED GFP/CFP	Agilent	1225001
Incucyte Annexin V Red Dye	Sartorius	4641	Reconstituted in organoid culture media
Incucyte Cytotox Green Dye	Sartorius	4633	DMSO solution
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma-Aldrich	A7250	Final concentration is 1.25 mM (component of organoid culture media)
Nexcelom Bioscience ViaStain AOPI Staining Solution	Fisher-Scientific	13366169	Add 1:50 volume
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636	Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media)
Noggin	R&D Systems	6057-NG	Final concentration is 100 ng/mL (component of organoid culture media)
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Final concentration is 10 units/mL (component of organoid culture media)
Phosphate Buffered Saline (1x)	Gibco	14190-144
Primocin	InvivoGen	ant-pm-05	Final concentration is 100 µg/mL (component of organoid culture media)
Recombinant Human Heregulinβ-1	Pepro Tech	100-03	Final concentration is 37.5 ng/mL (component of organoid culture media)
Staurosporine solution from Streptomyces sp.	Sigma-Aldrich	S6942
TrypLE Express	Life Technologies	12604013
Y-27632, CAS 331752-47-7	Sigma-Aldrich	688000	Final concentration is 5 µM (component of organoid culture media)
β-Estradiol	Sigma-Aldrich	E2758	Final concentration is 100 nM (component of organoid culture media)