多重活细胞成像在患者来源的癌症类器官模型中用于药物反应

摘要

患者来源的肿瘤类器官是用于基础和转化研究的复杂模型系统。本文详细介绍了使用多重荧光活细胞成像对不同类器官表型进行同步动力学评估。

摘要

患者来源的癌症类器官 （PDO） 模型是一种多功能研究系统，与癌细胞系相比，它更好地概括了人类疾病。PDO模型可以通过在细胞外基底膜提取物（BME）中培养患者肿瘤细胞并将其铺成三维圆顶来生成。然而，针对单层培养物中的表型测定进行了优化的市售试剂通常与 BME 不兼容。在此，我们描述了一种使用自动活细胞成像系统对PDO模型进行板化和评估药物效果的方法。此外，我们应用与动力学测量兼容的荧光染料来同时量化细胞健康和细胞凋亡。图像捕获可以自定义为在几天内以固定的时间间隔进行。用户可以在单个 Z 平面图像或来自多个焦平面的连续图像的 Z 投影中分析药物效应。 使用掩蔽，计算感兴趣的特定参数，例如PDO数，面积和荧光强度。我们提供概念验证数据，证明细胞毒性药物对细胞健康、细胞凋亡和活力的影响。这种自动化动力学成像平台可以扩展到其他表型读数，以了解癌症PDO模型中的各种治疗效果。

引言

患者来源的肿瘤类器官 （PDO） 正在迅速成为研究癌症发展和治疗反应的强大模型系统。PDO 是三维 （3D） 细胞培养系统，可概括原发肿瘤的复杂基因组图谱和结构 ^1,2。与永生化癌细胞系的传统二维 （2D） 培养不同，PDO 捕获并维持肿瘤内异质性 ^3,4，^使其成为机制和转化研究的宝贵工具。尽管PDO正在成为一种越来越受欢迎的模型系统，但与PDO培养物相容的市售试剂和细胞效应分析方法仍然有限。

缺乏可靠的方法来分析治疗反应的细微变化阻碍了临床转化。3D 培养物中的金标准细胞健康试剂 CellTiter-Glo 3D 利用 ATP 水平作为细胞活力的决定因素 ^5,6。虽然该试剂可用于终点检测，但也有一些注意事项，最明显的是检测完成后无法将样品用于其他目的。

活细胞成像是一种复杂的动力学显微镜，当与荧光试剂结合使用时，能够量化 PDO 模型中的各种细胞健康读数，包括细胞凋亡^7、

研究方案

使用人类肿瘤标本的研究由爱荷华大学机构审查委员会 （IRB） 审查和批准，协议 #201809807，并按照 1964 年赫尔辛基宣言及其后来的修正案中规定的伦理标准进行。获得所有参与研究的受试者的知情同意。纳入标准包括癌症诊断和肿瘤标本的可用性。

1. 将完整的 PDO 接种在 96 孔板中

1. 准备试剂。
   1. 在37°C下预热96孔板过夜，并在4°C下解冻BME。
   2. 制备针对培养感兴趣的癌症类型进行优化的完整类器官培养基。用于此处所示实验的特定培养基在 补充表1中提供。
      注意：可能需要针对不同的肿瘤类型修改培养基成分。例如，类器官培养基补充有100nM雌二醇用于妇科肿瘤¹³。制备的培养基在4°C下稳定1个月。为了长期储存，将培养基等分装到50 mL管中并储存在-20°C下。
2. 在4°C和37°C下制备两个单独的类器官培养基等分试样。 例如，如果在 96 孔板中接种 60 孔，则使用 6 mL 温热的类器官培养基和 150 μL 冰冷的类器官培养基。
3. 准备类器官洗涤缓冲液：用 10 mM HEPES、1x Glutamax、5 mM EDTA 和 10 μM Y-27632 补充 1x PBS。储存在4°C
4. 收获在 24 孔板中....

讨论

PDO 培养物因其能够反映细胞反应和行为而成为越来越流行的体外模型系统²。PDO的产生、培养和扩增技术已经取得了重大进展，但分析治疗反应的方法却滞后了。市售的 3D 活力试剂盒是裂解终点测定，错过了潜在有价值的动力学响应数据，并限制了其他方法的后续分析⁸。新兴研究正在应用活细胞成像来评估PDO模型中的药物反应。在这里，我们提出了一种利用多.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrfuge tube	Dot Scientific Inc	1008113
15 mL conical centrifuge tube	Sarstedt	62.554.100
554 NM LED Cube	Agilent	1225012
96-well plate	Corning Costar	3596	Prewarmed to 37 °C
96-well plate	Agilent	204626-100	Prewarmed to 37 °C
A83-01	Tocris	2939	Final concentration is 500 nM (component of organoid culture media)
Advanced DMEM/F-12	Gibco	12634-010	component of organoid culture media
B27 Supplement	Gibco	17504044	Final concentration is 1x (component of organoid culture media)
BioTek BioSpa 8 Automated Incubator	Agilent	BIOSPAG-SN	Tabletop incubator; BioSpa OnDemand scheduling software comunicates with Gen5 to transfer plates between the BioSpa and the Cytation 5 for imaging (this protocol uses version 1.01.10)
BioTek Cytation 5 Cell Imaging Multimode Reader	Agilent	CYT5PW-SN	Plate reader; Gen5 software is used for this device (this protocol uses version 3.12.08)
Cultrex UltiMatrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract	R&D Systems	BME001-10
Daunorubicin HCl	Sigma-Aldrich	S3035	Reconstituted in DMSO
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2438
EDTA (0.5 M)	Thermo Fisher	AM9260G
Forskolin	Tocris	1099	Final concentration is 10 µM (component of organoid culture media)
Glutamax	Gibco	35050-061	Final concentration is 1x (component of organoid culture media)
HEPES	Gibco	15630-080	Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media)
Human EGF, Animal-Free Recombinant Protein	Gibco	AF-100-15-1MG	Final concentration is 0.5 ng/mL (component of organoid culture media)
Human FGF-10 Recombinant Protein	Gibco	100-26-1MG	Final concentration is 10 ng/mL (component of organoid culture media)
Human R-Spondin 1 Recombinant Protein	Gibco	120-38-5UG	Final concentration is 250 ng/mL (component of organoid culture media)
Hydrocortisone Stock Solution	StemCell Technologies	7926	Final concentration is 500 ng/mL (component of organoid culture media)
Imaging Filter Cube- GFP	Agilent	1225101
Imaging Filter Cube- TRITC	Agilent	1225125
Imaging LED GFP/CFP	Agilent	1225001
Incucyte Annexin V Red Dye	Sartorius	4641	Reconstituted in organoid culture media
Incucyte Cytotox Green Dye	Sartorius	4633	DMSO solution
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma-Aldrich	A7250	Final concentration is 1.25 mM (component of organoid culture media)
Nexcelom Bioscience ViaStain AOPI Staining Solution	Fisher-Scientific	13366169	Add 1:50 volume
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636	Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media)
Noggin	R&D Systems	6057-NG	Final concentration is 100 ng/mL (component of organoid culture media)
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Final concentration is 10 units/mL (component of organoid culture media)
Phosphate Buffered Saline (1x)	Gibco	14190-144
Primocin	InvivoGen	ant-pm-05	Final concentration is 100 µg/mL (component of organoid culture media)
Recombinant Human Heregulinβ-1	Pepro Tech	100-03	Final concentration is 37.5 ng/mL (component of organoid culture media)
Staurosporine solution from Streptomyces sp.	Sigma-Aldrich	S6942
TrypLE Express	Life Technologies	12604013
Y-27632, CAS 331752-47-7	Sigma-Aldrich	688000	Final concentration is 5 µM (component of organoid culture media)
β-Estradiol	Sigma-Aldrich	E2758	Final concentration is 100 nM (component of organoid culture media)