Imágenes multiplexadas de células vivas para las respuestas a los medicamentos en modelos de organoides derivados de pacientes de cáncer

Resumen

Los organoides tumorales derivados de pacientes son un sistema modelo sofisticado para la investigación básica y traslacional. Este artículo de métodos detalla el uso de imágenes fluorescentes multiplexadas de células vivas para la evaluación cinética simultánea de diferentes fenotipos de organoides.

Resumen

Los modelos de organoides derivados del paciente (PDO, por sus siglas en inglés) del cáncer son un sistema de investigación multifuncional que recapitula mejor las enfermedades humanas en comparación con las líneas celulares cancerosas. Los modelos de PDO se pueden generar mediante el cultivo de células tumorales de pacientes en extractos extracelulares de membrana basal (BME) y su siembra en forma de cúpulas tridimensionales. Sin embargo, los reactivos disponibles comercialmente que han sido optimizados para ensayos fenotípicos en cultivos monocapa a menudo no son compatibles con BME. En este artículo, describimos un método para placar modelos de PDO y evaluar los efectos de los fármacos utilizando un sistema automatizado de imágenes de células vivas. Además, aplicamos colorantes fluorescentes que son compatibles con las mediciones cinéticas para cuantificar la salud celular y la apoptosis simultáneamente. La captura de imágenes se puede personalizar para que se produzca a intervalos de tiempo regulares durante varios días. Los usuarios pueden analizar los efectos de las drogas en imágenes individuales del plano Z o en una proyección Z de imágenes en serie de múltiples planos focales. Mediante el enmascaramiento, se calculan parámetros específicos de interés, como el número de PDO, el área y la intensidad de fluorescencia. Proporcionamos datos de prueba de concepto que demuestran el efecto de los agentes citotóxicos en la salud, la apoptosis y la viabilidad celular. Esta plataforma automatizada de imágenes cinéticas se puede ampliar a otras lecturas fenotípicas para comprender los diversos efectos terapéuticos en los modelos de cáncer de PDO.

Introducción

Los organoides tumorales derivados de pacientes (PDO, por sus siglas en inglés) están emergiendo rápidamente como un sistema modelo sólido para estudiar el desarrollo del cáncer y las respuestas terapéuticas. Las PDO son sistemas de cultivo celular tridimensionales (3D) que recapitulan el complejo perfil genómico y la arquitectura del tumor primario ^1,2. A diferencia de los cultivos bidimensionales (2D) tradicionales de líneas celulares cancerosas inmortalizadas, las PDO capturan y mantienen la heterogeneidad intratumoral ^3,4, lo que las convierte en una herramienta valiosa tanto para la investigación mecanicista como para la traslacional. Aunque las PDO se están convirtiendo en un sistema modelo cada vez más popular, los reactivos disponibles comercialmente y los métodos de análisis para los efectos celulares que son compatibles con los cultivos de PDO son limitados.

La falta de métodos sólidos para analizar los cambios sutiles en la respuesta al tratamiento dificulta la traslación clínica. El reactivo de salud celular de referencia en cultivos 3D, CellTiter-Glo 3D, utiliza los niveles de ATP como determinante de la viabilidad celular ^5,6. Si bien este reactivo es útil para los ensayos de punto final, existen varias advertencias, sobre todo la imposibilidad de utilizar muestras para otros fines después de completar el ensayo.

La obtención de imágenes de células vivas es una forma sofisticada de microscopía cinética que, cuando se combina con reactivos fluorescentes, tiene la capacidad de cuantificar una variedad de lecturas de salud celular dentro de los modelos de PDO, incluida la apoptosis ^7,8,9 y la citotoxicidad¹⁰. De hecho, la obtención de imágenes de células vivas ha sido fundamental para el cribado de compuestos de alto rendimiento en plataformas 2D^11,12. Sistemas como el Incucyte han hecho que la tecnología sea asequible y, por lo tanto, accesible para grupos de investigación en una variedad de entornos. Sin embargo, la aplicación de estos sistemas para analizar cultivos 3D aún está en pañales.

En este trabajo se describe un método para evaluar la respuesta a fármacos en modelos PDO de cáncer mediante imágenes multiplexadas de células vivas (Figura 1). A través del análisis de imágenes de campo claro, los cambios en el tamaño y la morfología de la PDO se pueden monitorear cinéticamente. Además, los procesos celulares se pueden cuantificar simultáneamente a lo largo del tiempo utilizando reactivos fluorescentes, como el colorante rojo de anexina V para la apoptosis y el colorante verde citotóxico para la citotoxicidad. Los métodos presentados están optimizados para el sistema de imágenes de células vivas Cytation 5, pero este protocolo puede adaptarse a diferentes plataformas de imágenes de células vivas.

Protocolo

Los estudios que utilizaron muestras de tumores humanos fueron revisados y aprobados por la Junta de Revisión Institucional (IRB) de la Universidad de Iowa, protocolo # 201809807, y se realizaron de acuerdo con los estándares éticos establecidos en la Declaración de Helsinki de 1964 y sus enmiendas posteriores. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los sujetos que participaron en el estudio. Los criterios de inclusión incluyen el diagnóstico de cáncer y la disponibilidad de especímenes tumorales.

1. Recubrimiento de PDO intactos en una placa de 96 pocillos

1. Preparar los reactivos.
   1. Precaliente las placas de 96 pocillos a 37 °C durante la noche y descongele el BME durante la noche a 4 °C.
   2. Prepare medios de cultivo de organoides completos optimizados para cultivar el tipo de cáncer de interés. Los medios de cultivo específicos utilizados para los experimentos que se muestran en este documento se proporcionan en la Tabla Suplementaria 1.
      NOTA: Es posible que sea necesario modificar los componentes de los medios para diferentes tipos de tumores. Por ejemplo, el medio de cultivo de organoides se complementa con estradiol 100 nM para tumores ginecológicos¹³. Los medios preparados son estables a 4 °C durante 1 mes. Para el almacenamiento a largo plazo, alícuota de los medios en tubos de 50 ml y guárdelos a -20 °C.
2. Preparar dos alícuotas separadas de medios de cultivo de organoides a 4 °C y 37 °C. Por ejemplo, si se están sembrando 60 pocillos en una placa de 96 pocillos, utilice 6 ml de medio de cultivo de organoides tibios y 150 μl de medios de cultivo de organoides helados.
3. Prepare el tampón de lavado de organoides: Complemente 1x PBS con 10 mM de HEPES, 1x Glutamax, 5 mM de EDTA y 10 μM de Y-27632. Conservar a 4 °C
4. Coseche las DOP cultivadas en una placa de 24 pocillos. Realice todos los pasos sobre hielo o a 4 °C, a menos que se indique lo contrario.
   1. Aspire los medios de cada pocillo utilizando un sistema de línea de vacío.
   2. Añadir 500 μL de tampón de lavado de organoides helado y pipetear suavemente 2-3 veces con una pipeta de 1000 μL. Incuba la placa en hielo durante 10 min.
   3. Transfiera el contenido de cada pocillo a un tubo cónico de 50 ml. Para asegurarse de que todos los PDO estén en suspensión, enjuague cada pocillo con 300 μL adicionales de tampón de lavado de organoides y transfiéralo al tubo cónico de 50 mL. Centrífuga durante 5 min a 350 x g a 4 °C
   4. Aspire el sobrenadante del gránulo de BME/organoide utilizando un sistema de línea de vacío, dejando ~ 5 mL restantes en el tubo. Añadir 20 ml de tampón de lavado organoide y resuspender suavemente el gránulo con una pipeta serológica de 10 ml. Incubar en hielo durante 10 min.
   5. Centrifugar durante 5 min a 350 x g a 4 °C. Aspire el sobrenadante con un sistema de línea de vacío, teniendo cuidado de no interrumpir el gránulo de PDO.
5. Colocación de PDO en una placa de 96 pocillos: Realice todos los pasos sobre hielo a menos que se indique lo contrario.
   1. Vuelva a suspender el gránulo de PDO en una cantidad adecuada de medios de cultivo de organoides helados para crear una suspensión de PDO. Transfiera la suspensión de PDO a un tubo de microcentrífuga helado de 1,5 ml.
      NOTA: Para calcular la cantidad de medios de cultivo de organoides, determine el número de pocillos que se van a sembrar en una placa de 96 pocillos, teniendo en cuenta que los PDO se siembran en un domo de 5 μL en una proporción de 1:1 de medios de cultivo de organoides y BME. Por ejemplo, cuando se siembra una placa de 96 pocillos y se utilizan solo los 60 pocillos interiores, la cantidad total de suspensión de PDO necesaria será de 300 μL: 150 μL de medio de cultivo de organoides y 150 μL de BME. En el caso de los modelos que presentan un crecimiento óptimo a diferentes porcentajes de BME, la relación entre BME: medios puede modificarse en este paso, aunque es importante estandarizar la relación en todos los ensayos para cada modelo específico. Para tener en cuenta el error de pipeteo, agregue un 10 % de volumen a cada componente.
   2. Cuenta el número de PDO.
      1. Transfiera 2,5 μL de la suspensión de PDO a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL helado y mezcle con 2,5 μL de BME. Transfiera la mezcla de 5 μL a un portaobjetos de microscopio de vidrio limpio. No cubra el portaobjetos. La mezcla se solidificará en una cúpula.
      2. Visualice usando un microscopio de campo brillante a 4x. Cuente el número de PDO en la mezcla de 5 μL; el objetivo es tener aproximadamente 25-50 PDO por domo de 5 μL.
         NOTA: Si no se logra la densidad deseada en la mezcla de ensayo, ajuste el volumen final de la suspensión de PDO añadiendo más medios de cultivo de organoides o centrifugando la suspensión de PDO y resuspendiendo el gránulo de PDO en un volumen menor de medios de cultivo de organoides helados. Independientemente de cómo se modifique la suspensión PDO en este paso, la relación final de BME: suspensión PDO en el paso 1.5.3. debe ser 1:1.
   3. Utilizando una pipeta de 200 μL con puntas de diámetro ancho, mezcle cuidadosamente la suspensión de PDO con una cantidad igual de BME para lograr una proporción de 1:1 de medio de cultivo de organoides a BME. Evite las burbujas, que alterarán la integridad de las cúpulas.
   4. Con una pipeta de 20 μL, siembre domos de 5 μL en el centro de cada pocillo de una placa precalentada de 96 pocillos, sembrando solo los 60 pocillos interiores. Para garantizar una distribución equitativa de los PDO, pipetee periódicamente el contenido del tubo de 1,5 ml con una pipeta de 200 μl con puntas de diámetro ancho.
   5. Después de que se hayan sembrado todos los pozos, coloque la tapa en el plato e invierta suavemente. Incubar la placa invertida a 37 °C durante 20 min en la incubadora de cultivo de tejidos para permitir que las cúpulas se solidifiquen.
      NOTA: La inversión de la placa garantiza que la cúpula de medios de cultivo de BME/organoide conserve la estructura 3D para proporcionar un espacio adecuado para la formación de PDO.
   6. Dar la vuelta a la placa para que quede con la tapa levantada e incubar durante 5 minutos a 37 °C.

2. Tratamientos y adición de colorantes fluorescentes para multiplexación

1. Mientras los domos de BME se solidifican en las placas de 96 pocillos, prepare diluciones de reactivos fluorescentes de imágenes de células vivas. En este documento se dan los parámetros específicos para la multiplexación del colorante rojo de anexina V y el colorante verde citotóxico.
2. Preparación de reactivos fluorescentes (Día -1): Calcule el volumen adecuado de medios de cultivo de organoides en función del número de pocillos a tratar, suponiendo que cada pocillo se tratará con 100 μL de medios dosificados con colorante. Diluir el colorante en medios de cultivo de organoides precalentados hasta la concentración deseada.
   NOTA: La cantidad total de medios necesarios variará según el experimento. Agregue un 10% al volumen final para tener en cuenta el error de pipeteo. Por ejemplo, para tratar los 60 pocillos internos de una placa de 96 pocillos, prepare 6,6 ml de medio dosificado con colorante (Tabla 1).
3. Trate cada pocillo con 100 μL de 2 medios de cultivo de organoides dosificados con colorante. Añadir 200 μL de PBS estéril 1x a los pocillos vacíos exteriores de la placa. Incubar a 37 °C durante la noche.
   NOTA: El PBS en los pozos periféricos disminuye la evaporación de los medios de los pozos internos.
4. Adición de fármacos/agentes de tratamiento (Día 0): Preparar los fármacos en medios de cultivo de organoides precalentados a una concentración de 2x en un volumen de 100 μL por pocillo.
   NOTA: El DMSO puede ser tóxico para las células en altas concentraciones. No se supera una concentración de 0,1% de DMSO en los experimentos realizados en este estudio. Además de los fármacos, algunos reactivos fluorescentes se distribuyen como una solución de DMSO. Es importante tener en cuenta la concentración total de DMSO cuando se trabaja con este tipo de reactivos.
5. Agregue 100 μL de 2 medios dosificados con colorante a cada pocillo; Evite crear burbujas.

3. Configuración de los parámetros de imagen

1. Coloque la placa en Cytation 5. Abrir Software Gen5. Haga clic en Nueva tarea > en el modo manual del generador de imágenes. Seleccione Capturar ahora e ingrese los siguientes ajustes: Objetivo (seleccione la ampliación deseada); Filtro (seleccione la microplaca); Formato de microplaca (seleccionar número de pocillos); y Tipo de recipiente (seleccione el tipo de placa). Haga clic en Usar tapa y Usar velocidad de portadora más lenta. Haga clic en Aceptar.
   NOTA: Tipo de recipiente: Sea lo más específico posible al seleccionar información sobre la placa porque el software está calibrado a la distancia específica desde el objetivo hasta la parte inferior de la placa para cada tipo de placa y espesor del plástico.
   Velocidad de portadora más lenta: Seleccione esta casilla para evitar interrumpir las cúpulas al cargar/descargar placas.
2. Cree una pila Z que genere una imagen de todo el domo BME.
   1. Seleccione un pozo de interés para verlo (panel izquierdo, debajo del histograma).
   2. Seleccione el canal Campo claro (panel izquierdo, arriba). Haga clic en Exposición automática y ajuste la configuración según sea necesario.
   3. Establezca la parte inferior y superior de la pestaña Z-Stack: Expandir modo de imagen (panel izquierdo, centro). Marque la casilla Z-Stack . Usando las flechas de ajuste de rumbo (panel izquierdo, centro), haga clic en el ajuste hacia abajo hasta que todos los PDO hayan entrado y luego desenfocados y estén borrosos. Establécelo como la parte inferior de la pila Z. Repita en la dirección opuesta usando las flechas de ajuste de rumbo para establecer la parte superior de la pila Z.
   4. Para asegurarse de que la configuración de Z-Stack sea adecuada para otros pozos de interés, seleccione otro pozo (panel izquierdo, debajo del histograma) y visualice la parte superior e inferior de Z-Stack.
   5. Para introducir manualmente las posiciones focales, haga clic en los tres puntos situados junto al ajuste fino (panel izquierdo, parte superior). Se abrirá una ventana; escriba el valor superior de Z-Stack (que se encuentra en el panel izquierdo, en el centro, en Modo de imagen). Repita el procedimiento para el valor inferior de Z-Stack. Ajuste según sea necesario para capturar el rango Z deseado repitiendo el paso 3.2.3. Si fuera necesario realizar ajustes, seleccione otro pozo para verificar la configuración.
3. Ajuste los ajustes de exposición para los canales fluorescentes. Se describen los ajustes para dos canales fluorescentes (GFP y TRITC). El número específico de canales fluorescentes dependerá del experimento y de los cubos fluorescentes que se instalen en el sistema de imágenes de células vivas.
   NOTA: Si se prevé que la intensidad de la señal sea significativamente mayor al final del experimento, los usuarios deben considerar la posibilidad de realizar experimentos de prueba para determinar los ajustes de exposición óptimos al final del experimento que luego se pueden aplicar al configurar los parámetros iniciales.
   1. Expanda la pestaña Modo de imagen (panel izquierdo, centro) y abra Editar paso de imagen. Aparecerá una ventana emergente.
   2. En Canales, haga clic en la burbuja para el número deseado de canales. Designe un canal para el campo claro y canales adicionales para cada canal fluorescente. En este ejemplo, Canal 1 = Campo claro; Canal 2 = GFP; Canal 3 = TRITC. Con los menús desplegables Color , seleccione la configuración adecuada para cada canal. Cierre la ventana de edición haciendo clic en Aceptar.
   3. Configure cada canal fluorescente.
      1. Cambie el canal a GFP (panel izquierdo, arriba).
      2. Haga clic en Exposición automática (panel izquierdo, parte superior). Expanda la pestaña Exposición (panel izquierdo, centro) y ajuste la configuración de exposición para minimizar la señal de fondo.
      3. Copie los ajustes de exposición en la pestaña Modo de imagen siguiendo los pasos 3.3.3.3-3.3.3.6.
      4. Haga clic en el icono Copiar junto al cuadro Editar paso de imagen . Haga clic en Editar paso de imagen, que abrirá otra ventana.
      5. En el canal GFP, haga clic en el icono Portapapeles en la línea Exposición para agregar los ajustes de Iluminación, Tiempo de integración y Ganancia de cámara al canal.
      6. Repita los pasos 3.3.3.4-3.3.3.5 para el canal TRITC. Haga clic en Aceptar para cerrar la ventana.
4. Configure los pasos de preprocesamiento de imágenes y proyección Z para automatizar el preprocesamiento de imágenes.
   1. Haga clic en el icono de la cámara (panel izquierdo, esquina inferior). Se abrirá una nueva ventana.
   2. En Agregar paso de procesamiento (panel izquierdo, abajo), haga clic en Preprocesamiento de imágenes. Se abrirá una nueva ventana.
   3. En la pestaña Campo claro , anule la selección de Aplicar preprocesamiento de imágenes.
   4. Para cada pestaña Canal fluorescente , asegúrese de que la opción Aplicar preprocesamiento de imagen esté seleccionada. Anule la selección de Usar las mismas opciones que el canal 1 y haga clic en Aceptar. La ventana se cerrará.
   5. En Agregar paso de procesamiento, haga clic en Proyección Z. Se abrirá una nueva ventana. Si lo desea, ajuste el rango de corte (por ejemplo, para reducir el rango Z). Cierre la ventana seleccionando Aceptar.
5. Crear protocolo.
   1. Haga clic en Conjunto de imágenes en la barra de herramientas. En el menú desplegable, haga clic en Crear experimento a partir de este conjunto de imágenes. Se cerrará la ventana de imágenes y se abrirá la ventana de procedimientos .
      NOTA: Los parámetros seleccionados en el modo manual del generador de imágenes se cargarán automáticamente en la nueva ventana, por lo que se puede crear un protocolo experimental.
   2. Establecer la temperatura y el degradado: Haz clic en "Establecer temperatura " debajo del encabezado Acciones (izquierda). Se abrirá una nueva ventana. Seleccione Incubadora encendida e ingrese manualmente la temperatura deseada en Temperatura. A continuación, en Degradado, introduzca manualmente 1. Cierre la ventana seleccionando Aceptar.
      NOTA: La creación de un gradiente de 1 °C evitará que se forme condensación en la tapa de la placa.
   3. Designe pocillos a la imagen.
      1. Haga doble clic en el paso de imagen en Descripción. Haga clic en Placa completa (esquina derecha, parte superior). Esto abrirá la ventana Diseño de placa .
      2. Resalte los pozos de interés con el cursor. Haga clic en Aceptar. Si lo desea, marque las casillas Agrupación de enfoque automático y Agrupación de capturas . Haga clic en Aceptar para cerrar la ventana.
         NOTA: La agrupación requerirá un ajuste de la exposición, como se describe en el paso 3.3.3.2 anterior. Consulte la sección Discusión para conocer los escenarios específicos en los que se puede usar esta función.
   4. Establezca intervalos para la obtención de imágenes cinéticas.
      1. Haga clic en Opciones bajo el encabezado Otro (izquierda). Marque la casilla Procedimiento cinético discontinuo .
      2. En Tiempo total estimado, introduzca el tiempo de ejecución del experimento (por ejemplo, 5 días). En Intervalo estimado, introduzca el intervalo para obtener una imagen de la placa (por ejemplo, cada 6 h).
      3. Haga clic en Pausa después de cada ejecución para dar tiempo a que la placa se transfiera a la incubadora. Cierre la ventana seleccionando Aceptar.
   5. Actualice los pasos de reducción de datos.
      1. Haga clic en Aceptar para cerrar la ventana de procedimiento. Se abrirá una pestaña para actualizar los pasos de reducción de datos. Seleccione Sí. Haga doble clic en Preprocesamiento de imágenes. Haga clic en los diferentes canales para verificar la configuración y haga clic en Aceptar.
      2. Haga doble clic en Proyección Z. Haga clic en los diferentes canales para verificar la configuración. Haga clic en Aceptar. A continuación, vuelva a hacer clic en Aceptar para cerrar la ventana de reducción de datos.
   6. Formatee el diseño de la placa.
      1. Abra el Asistente de diseño de placas y designe los tipos de pozos siguiendo los pasos 3.6.2-3.6.3.
      2. Haga clic en el icono Diseño de placas en la barra de herramientas (esquina izquierda, arriba) para abrir el Asistente de diseño de placas.
      3. Marque las casillas junto a los tipos de pocillos utilizados en el experimento. En Controles de ensayo, introduzca el número de tipos de control diferentes con las flechas. Haga clic en Siguiente para abrir la ventana Control de ensayo #1 .
      4. Establezca las condiciones del pozo de control del ensayo siguiendo los pasos 3.6.5-3.6.8.
      5. En la ventana Control de ensayo #1, introduzca la etiqueta de control en el cuadro ID de diseño de placa . Si lo desea, ingrese el nombre completo en el cuadro adyacente. Seleccione el número de réplicas para la condición de control respectiva utilizando las flechas.
      6. Si utiliza varias concentraciones o una serie de diluciones dentro del control, haga clic en Definir diluciones/concentraciones y utilice el menú desplegable para seleccionar el Tipo. Introduzca los valores de cada concentración/dilución en la tabla.
         NOTA: La función automática se puede utilizar si las concentraciones cambian en un incremento constante.
      7. Seleccione la pestaña Color en la barra de herramientas. Elija el color de texto y el color de fondo deseados para el control en el menú desplegable. Haga clic en Siguiente.
      8. Repita según sea necesario con controles adicionales.
      9. Establezca las condiciones del pocillo de muestra siguiendo 3.6.10-3.6.12.
      10. En la página Configuración de muestra , introduzca el prefijo de ID de muestra (por ejemplo, SPL). Seleccione el número de réplicas con las flechas. Si utiliza muestras con diferentes concentraciones de tratamiento, seleccione Concentraciones o Diluciones en el menú desplegable Tipo . Introduzca las diluciones/concentraciones en la tabla e introduzca las unidades en el cuadro Unidad .
      11. Seleccione Campos de identificación en la barra de herramientas. Introduzca los nombres de categoría deseados (por ejemplo, ID de muestra, medicamento) en la tabla.
      12. Seleccione la pestaña Color en la barra de herramientas. Seleccione un color diferente para cada grupo de tratamiento/muestra. Haga clic en Finalizar. Esto abrirá la página Diseño de placas.
          NOTA: Los números del lado izquierdo se correlacionan con los diferentes números de muestra.
      13. Asigne identificadores de muestra siguiendo los pasos 3.6.14-3.6.16.
      14. Escoger SPL1 en el panel izquierdo. Utilice el cursor para seleccionar pozos.
          NOTA: Las herramientas de selección automática se pueden ajustar en el cuadro de asignación de serie. El número de réplicas y la orientación del diseño se pueden designar previamente.
      15. Repita con otras muestras para completar el diseño de la placa. Una vez satisfecho, haga clic en Aceptar.
      16. En la barra de herramientas Archivo , seleccione Identificadores de ejemplo. Complete las columnas de ID de muestra con la información adecuada para cada muestra (por ejemplo, tipo de medicamento). Presione Aceptar.
   7. Guarde el protocolo.
      1. En la barra de herramientas, haga clic en Archivo > Guardar protocolo como. Seleccione la ubicación para guardar el archivo. Introduzca un nombre de archivo. Haga clic en Guardar para cerrar la ventana.
      2. Haga clic en Archivo > Salir en la barra de herramientas. Se abrirá una pestaña para guardar los cambios en el modo manual del generador de imágenes. Seleccione No.
      3. Se abrirá una pestaña para guardar los cambios en el Experimento 1. Seleccione No. Se abrirá una pestaña para actualizar la definición del protocolo. Seleccione Actualizar. Cierre el software.
6. Importe el protocolo en BioSpa OnDemand y termine de configurar el experimento.
   1. Abra el software BioSpa OnDemand (software de programación).
   2. Seleccione una ranura disponible en el software.
   3. Retire la placa del sistema de obtención de imágenes de células vivas. Haga clic en Abrir cajón para acceder a la ranura adecuada en el software de programación e insertar la placa. Haga clic en Cerrar cajón.
      NOTA: Este paso se puede realizar en cualquier momento una vez que se haya creado el protocolo en el paso 3.5.7 anterior. Sin embargo, la placa debe estar en la Cytation 5 para realizar una ejecución de temporización en el siguiente paso 3.6.4.3.
   4. Importe el protocolo.
      1. En la pestaña Información del procedimiento , seleccione Usuario en el menú desplegable. Junto a la ranura Protocolo , haga clic en Seleccionar > Agregar una nueva entrada.
      2. Junto a la ranura Protocolo, haga clic en Seleccionar. Esto abrirá una nueva ventana para navegar al protocolo deseado en la arquitectura de archivos. Haga clic en Abrir para importar el protocolo en el software de programación.
      3. Introduzca la cantidad de tiempo necesario para obtener una imagen de la placa. Haga clic en Aceptar para cerrar la ventana Lista de protocolos Gen5 .
         NOTA: Este paso es especialmente importante cuando se ejecutan varios experimentos a la vez. Para determinar el tiempo necesario para crear una imagen, haga clic en Realizar una ejecución de tiempo ahora. Haga clic en Aceptar.
   5. Establezca intervalos de imágenes y programe el experimento.
      1. En Intervalo, introduzca el intervalo de imágenes designado en el paso 3.5.4.
      2. En Opciones de hora de inicio, seleccione Cuando esté disponible. En Duración, seleccione Fijo o Continuo.
         NOTA: Se puede designar una hora de inicio específica en lugar de ejecutar el protocolo a la siguiente hora disponible. Al seleccionar Duración fija , se establecerá un punto de conexión específico para el experimento y se requerirá que el usuario designe un período de tiempo experimental. La duración continua permitirá que el experimento se ejecute sin punto de conexión y solo puede finalizarse si un usuario detiene el experimento.
      3. Haga clic en Programar placa/recipiente. Esto abrirá la secuencia de validación de placas. Se abrirá una pestaña con la hora de primera lectura propuesta. Haga clic en Sí para aceptar esta programación.

4. Análisis de imágenes en el software Gen5 (Figura 2)

1. Abra el módulo Análisis de imágenes.
   1. Abra Gen5. En el Administrador de tareas, seleccione Experimentos > Abrir. Seleccione el experimento para abrir el archivo. Haga clic en Placa > vista en la barra de herramientas.
   2. Cambie el menú desplegable Datos a Proyección Z. Haga doble clic en un pozo de interés. Seleccione Analizar > quiero configurar un nuevo paso de reducción de datos de Análisis de imagen. Haga clic en Aceptar.
2. Análisis celular
   1. Mascarilla primaria
      1. En Configuración de análisis, seleccione Tipo: Análisis celular y canal de detección: ZProj[Tsf[Campo claro]] (panel izquierdo, centro).
      2. Haga clic en Opciones. Esto abrirá la página Máscara y recuento principal . En el cuadro Umbral , marque Automático y haga clic en Aplicar. Haga clic en el cuadro Resaltar objetos (panel derecho, abajo) para mostrar los objetos dentro del umbral designado. Ajústelo según sea necesario para incluir objetos de interés.
         NOTA: La configuración del umbral se basa en la intensidad de píxeles. Por ejemplo, si el umbral se establece en 5000, los píxeles con una intensidad superior a 5000 se incluirán en el análisis.
      3. En Selección de objetos, designe el tamaño mínimo y máximo del objeto (μm). Ajústelo según sea necesario para excluir los desechos celulares/celdas individuales.
         NOTA: El tamaño de la PDO puede variar significativamente entre los diferentes modelos y tipos. Utilice la herramienta de medición del software Gen5 para determinar los umbrales mínimos y máximos de tamaño de PDO para cada modelo. Los usuarios pueden elegir un umbral mínimo de tamaño de PDO más pequeño en relación con el valor proporcionado por la herramienta de medición para evitar la exclusión de fragmentos de PDO en momentos posteriores al tratamiento farmacológico.
      4. Para limitar el análisis a una determinada región del pozo, anule la selección de Analizar toda la imagen y haga clic en Enchufar. En la ventana Conector de imagen , utilice el menú desplegable para seleccionar Forma de enchufe . Ajuste los parámetros de tamaño y posición según sea necesario para que se ajusten a la región de interés.
         NOTA: Es importante maximizar el número de PDO dentro del enchufe y, al mismo tiempo, excluir las áreas libres de PDO para minimizar el fondo. Designe un tamaño de conector que capture de forma coherente la mayoría de los objetos de interés en las réplicas. Es importante generar un tapón que también excluya los bordes de la cúpula, ya que excluye cualquier objeto que pueda aparecer distorsionado debido a la refracción de la luz de la curvatura extrema de la cúpula alrededor de los bordes. También se puede anular la selección de Incluir objetos de borde primario para capturar solo PDO completos dentro del enchufe.
   2. Análisis de subpoblaciones. En la Figura 3 se proporciona un ejemplo de designación de subpoblación.
      1. Haga clic en Métricas calculadas en la barra de herramientas Análisis celular . Haga clic en Seleccionar o crear métricas de nivel de objeto de interés (esquina derecha, parte inferior). En Métricas de objetos disponibles , seleccione las métricas de interés (por ejemplo, circularidad) y haga clic en el botón Insertar . Haga clic en Aceptar.
         NOTA: La morfología y la densidad de cada modelo de DOP determinarán las mejores métricas de interés para distinguir la subpoblación.
      2. Haga clic en Análisis de subpoblación en la barra de herramientas Análisis celular . Haga clic en Agregar para crear una nueva subpoblación. Se abrirá una ventana emergente.
      3. Si lo desea, escriba un nombre para la subpoblación. En Métricas de objeto, seleccione una métrica de interés y presione Agregar condición. En la ventana Editar condición , introduzca los parámetros para la métrica de objeto elegida. Repita con métricas adicionales según sea necesario.
         NOTA: Los parámetros se pueden ajustar manualmente o configurar con la herramienta de búsqueda. Por ejemplo, para excluir residuos, los usuarios pueden agregar Área como métrica de objeto y seleccionar objetos menores de 800. La circularidad como métrica de objeto se utiliza de forma rutinaria, y se incluyen todos los objetos con una circularidad superior a 0,2-0,5, según el modelo.
      4. En la tabla de la parte inferior de la ventana, marque los resultados deseados para mostrar. Haga clic en Aceptar > Aplicar.
      5. Para ver los objetos dentro de la subpoblación, utilice el menú desplegable Detalles del objeto (panel derecho, centro) para seleccionar la subpoblación. Los objetos que se encuentren dentro de los parámetros se resaltarán en la imagen.
         NOTA: Para cambiar los colores de resaltado de la máscara principal y la subpoblación, haga clic en Configuración (panel derecho, parte inferior).
      6. Para ajustar los parámetros de subpoblación, vuelva a abrir la ventana Análisis de subpoblación desde la barra de herramientas Análisis celular . Seleccione la subpoblación y haga clic en Editar. Haga clic en Agregar paso.
         NOTA: Esto aplicará el mismo análisis a todos los pozos dentro del experimento en todos los puntos de tiempo. En el menú desplegable de la página Matriz, se pueden seleccionar diferentes métricas para su visualización individual.

5. Exportación de datos de Gen5 a Excel

1. Para personalizar un archivo de datos para la exportación, seleccione el icono Generadores de informes/exportaciones en la barra de herramientas. En la ventana emergente, haga clic en Nueva exportación a Excel.
2. En la página Propiedades de la ventana emergente, seleccione Ámbito > placa y Contenido > Personalizado. Haga clic en la opción Contenido en la barra de herramientas. Haga clic en Editar plantilla, que abrirá el programa Excel.
3. En la hoja de cálculo, seleccione Complementos > Tabla > datos de pozos. Coloque el cursor sobre las distintas selecciones para ver las opciones de exportación. Seleccione la métrica de interés (por ejemplo, Media del objeto[ZProj[Tsf[TRITC]]]).
   NOTA: El diseño de placa se puede agregar a la plantilla de análisis de hoja de cálculo seleccionando Complementos > Resumen de protocolo > diseño.
4. Se abrirá una ventana de edición . En el cuadro Pozos , designe los pozos para la exportación por Id. de pozo o # de pozo. Seleccione Aceptar. Se cargará una plantilla en el archivo de hoja de cálculo. Cierra la hoja de cálculo. La plantilla se guarda automáticamente.
5. Haga clic en Aceptar en la ventana Nueva exportación a Excel y cierre la ventana Generadores de informes/exportaciones .
6. Haga clic en el icono Exportar en la barra de herramientas Gen5. Marque la casilla junto al archivo de exportación deseado. Haga clic en Aceptar. Gen5 rellenará automáticamente la plantilla de hoja de cálculo y abrirá el archivo en Excel.

6. Análisis de datos externos

1. Abra el archivo de exportación (.xlsx) en Excel.
2. Para cada pozo, divida cada valor individual por el valor de punto de tiempo 0:00 para ese pozo. Esto establecerá el punto de tiempo 0 igual a 1, y cada valor más allá de eso será relativo a la lectura inicial.
3. Abra un nuevo archivo en el software de análisis de datos. Seleccione la opción de diseño XY .
   NOTA: En este protocolo, se utilizó GraphPad Prism (versión 9.5.1).
4. Etiquetas de entrada para cada grupo de datos. Copie y pegue los puntos de tiempo y los valores normalizados correspondientes para cada grupo de tratamiento en la tabla Prism. Se generará automáticamente un gráfico para los datos que se puede encontrar en Gráficos.

Resultados

Nuestro objetivo fue demostrar la viabilidad del uso de imágenes multiplexadas de células vivas para evaluar la respuesta terapéutica de la PDO. Se realizaron experimentos de prueba de concepto en dos modelos PDO separados de cáncer de endometrio: ONC-10817 y ONC-10811 (ver Figura suplementaria 1 y Figura suplementaria 2 para ver los datos de ONC-10811). La apoptosis (tinción de anexina V) y la citotoxicidad (captación de Cytotox Green) se monitorizaron cinéticamente en respuesta ...

Discusión

Los cultivos de PDO se están convirtiendo en un sistema modelo in vitro cada vez más popular debido a su capacidad para reflejar las respuestas y comportamientos celulares². Se han logrado avances significativos en las técnicas de generación, cultivo y expansión de PDO, pero los métodos para analizar las respuestas terapéuticas se han retrasado. Los kits de viabilidad 3D disponibles en el mercado son ensayos de criterios de valoración líticos, que pierden datos de respuesta cinética pote...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrfuge tube	Dot Scientific Inc	1008113
15 mL conical centrifuge tube	Sarstedt	62.554.100
554 NM LED Cube	Agilent	1225012
96-well plate	Corning Costar	3596	Prewarmed to 37 °C
96-well plate	Agilent	204626-100	Prewarmed to 37 °C
A83-01	Tocris	2939	Final concentration is 500 nM (component of organoid culture media)
Advanced DMEM/F-12	Gibco	12634-010	component of organoid culture media
B27 Supplement	Gibco	17504044	Final concentration is 1x (component of organoid culture media)
BioTek BioSpa 8 Automated Incubator	Agilent	BIOSPAG-SN	Tabletop incubator; BioSpa OnDemand scheduling software comunicates with Gen5 to transfer plates between the BioSpa and the Cytation 5 for imaging (this protocol uses version 1.01.10)
BioTek Cytation 5 Cell Imaging Multimode Reader	Agilent	CYT5PW-SN	Plate reader; Gen5 software is used for this device (this protocol uses version 3.12.08)
Cultrex UltiMatrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract	R&D Systems	BME001-10
Daunorubicin HCl	Sigma-Aldrich	S3035	Reconstituted in DMSO
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2438
EDTA (0.5 M)	Thermo Fisher	AM9260G
Forskolin	Tocris	1099	Final concentration is 10 µM (component of organoid culture media)
Glutamax	Gibco	35050-061	Final concentration is 1x (component of organoid culture media)
HEPES	Gibco	15630-080	Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media)
Human EGF, Animal-Free Recombinant Protein	Gibco	AF-100-15-1MG	Final concentration is 0.5 ng/mL (component of organoid culture media)
Human FGF-10 Recombinant Protein	Gibco	100-26-1MG	Final concentration is 10 ng/mL (component of organoid culture media)
Human R-Spondin 1 Recombinant Protein	Gibco	120-38-5UG	Final concentration is 250 ng/mL (component of organoid culture media)
Hydrocortisone Stock Solution	StemCell Technologies	7926	Final concentration is 500 ng/mL (component of organoid culture media)
Imaging Filter Cube- GFP	Agilent	1225101
Imaging Filter Cube- TRITC	Agilent	1225125
Imaging LED GFP/CFP	Agilent	1225001
Incucyte Annexin V Red Dye	Sartorius	4641	Reconstituted in organoid culture media
Incucyte Cytotox Green Dye	Sartorius	4633	DMSO solution
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma-Aldrich	A7250	Final concentration is 1.25 mM (component of organoid culture media)
Nexcelom Bioscience ViaStain AOPI Staining Solution	Fisher-Scientific	13366169	Add 1:50 volume
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636	Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media)
Noggin	R&D Systems	6057-NG	Final concentration is 100 ng/mL (component of organoid culture media)
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Final concentration is 10 units/mL (component of organoid culture media)
Phosphate Buffered Saline (1x)	Gibco	14190-144
Primocin	InvivoGen	ant-pm-05	Final concentration is 100 µg/mL (component of organoid culture media)
Recombinant Human Heregulinβ-1	Pepro Tech	100-03	Final concentration is 37.5 ng/mL (component of organoid culture media)
Staurosporine solution from Streptomyces sp.	Sigma-Aldrich	S6942
TrypLE Express	Life Technologies	12604013
Y-27632, CAS 331752-47-7	Sigma-Aldrich	688000	Final concentration is 5 µM (component of organoid culture media)
β-Estradiol	Sigma-Aldrich	E2758	Final concentration is 100 nM (component of organoid culture media)