Imágenes multiplexadas de células vivas para las respuestas a los medicamentos en modelos de organoides derivados de pacientes de cáncer

Resumen

Los organoides tumorales derivados de pacientes son un sistema modelo sofisticado para la investigación básica y traslacional. Este artículo de métodos detalla el uso de imágenes fluorescentes multiplexadas de células vivas para la evaluación cinética simultánea de diferentes fenotipos de organoides.

Resumen

Los modelos de organoides derivados del paciente (PDO, por sus siglas en inglés) del cáncer son un sistema de investigación multifuncional que recapitula mejor las enfermedades humanas en comparación con las líneas celulares cancerosas. Los modelos de PDO se pueden generar mediante el cultivo de células tumorales de pacientes en extractos extracelulares de membrana basal (BME) y su siembra en forma de cúpulas tridimensionales. Sin embargo, los reactivos disponibles comercialmente que han sido optimizados para ensayos fenotípicos en cultivos monocapa a menudo no son compatibles con BME. En este artículo, describimos un método para placar modelos de PDO y evaluar los efectos de los fármacos utilizando un sistema automatizado de imágenes de células vivas. Además, aplicamos colorantes fluorescentes que son compatibles con las mediciones cinéticas para cuantificar la salud celular y la apoptosis simultáneamente. La captura de imágenes se puede personalizar para que se produzca a intervalos de tiempo regulares durante varios días. Los usuarios pueden analizar los efectos de las drogas en imágenes individuales del plano Z o en una proyección Z de imágenes en serie de múltiples planos focales. Mediante el enmascaramiento, se calculan parámetros específicos de interés, como el número de PDO, el área y la intensidad de fluorescencia. Proporcionamos datos de prueba de concepto que demuestran el efecto de los agentes citotóxicos en la salud, la apoptosis y la viabilidad celular. Esta plataforma automatizada de imágenes cinéticas se puede ampliar a otras lecturas fenotípicas para comprender los diversos efectos terapéuticos en los modelos de cáncer de PDO.

Introducción

Los organoides tumorales derivados de pacientes (PDO, por sus siglas en inglés) están emergiendo rápidamente como un sistema modelo sólido para estudiar el desarrollo del cáncer y las respuestas terapéuticas. Las PDO son sistemas de cultivo celular tridimensionales (3D) que recapitulan el complejo perfil genómico y la arquitectura del tumor primario ^1,2. A diferencia de los cultivos bidimensionales (2D) tradicionales de líneas celulares cancerosas inmortalizadas, las PDO capturan y mantienen la heterogeneidad intratumoral ^3,4, lo que las convierte en u....

Protocolo

Los estudios que utilizaron muestras de tumores humanos fueron revisados y aprobados por la Junta de Revisión Institucional (IRB) de la Universidad de Iowa, protocolo # 201809807, y se realizaron de acuerdo con los estándares éticos establecidos en la Declaración de Helsinki de 1964 y sus enmiendas posteriores. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los sujetos que participaron en el estudio. Los criterios de inclusión incluyen el diagnóstico de cáncer y la disponibilidad de especímenes tumorales.

1. Recubrimiento de PDO intactos en una placa de 96 pocillos

1. Preparar los reactivos.
   1. Precaliente las pl....

Discusión

Los cultivos de PDO se están convirtiendo en un sistema modelo in vitro cada vez más popular debido a su capacidad para reflejar las respuestas y comportamientos celulares². Se han logrado avances significativos en las técnicas de generación, cultivo y expansión de PDO, pero los métodos para analizar las respuestas terapéuticas se han retrasado. Los kits de viabilidad 3D disponibles en el mercado son ensayos de criterios de valoración líticos, que pierden datos de respuesta cinética pote.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrfuge tube	Dot Scientific Inc	1008113
15 mL conical centrifuge tube	Sarstedt	62.554.100
554 NM LED Cube	Agilent	1225012
96-well plate	Corning Costar	3596	Prewarmed to 37 °C
96-well plate	Agilent	204626-100	Prewarmed to 37 °C
A83-01	Tocris	2939	Final concentration is 500 nM (component of organoid culture media)
Advanced DMEM/F-12	Gibco	12634-010	component of organoid culture media
B27 Supplement	Gibco	17504044	Final concentration is 1x (component of organoid culture media)
BioTek BioSpa 8 Automated Incubator	Agilent	BIOSPAG-SN	Tabletop incubator; BioSpa OnDemand scheduling software comunicates with Gen5 to transfer plates between the BioSpa and the Cytation 5 for imaging (this protocol uses version 1.01.10)
BioTek Cytation 5 Cell Imaging Multimode Reader	Agilent	CYT5PW-SN	Plate reader; Gen5 software is used for this device (this protocol uses version 3.12.08)
Cultrex UltiMatrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract	R&D Systems	BME001-10
Daunorubicin HCl	Sigma-Aldrich	S3035	Reconstituted in DMSO
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2438
EDTA (0.5 M)	Thermo Fisher	AM9260G
Forskolin	Tocris	1099	Final concentration is 10 µM (component of organoid culture media)
Glutamax	Gibco	35050-061	Final concentration is 1x (component of organoid culture media)
HEPES	Gibco	15630-080	Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media)
Human EGF, Animal-Free Recombinant Protein	Gibco	AF-100-15-1MG	Final concentration is 0.5 ng/mL (component of organoid culture media)
Human FGF-10 Recombinant Protein	Gibco	100-26-1MG	Final concentration is 10 ng/mL (component of organoid culture media)
Human R-Spondin 1 Recombinant Protein	Gibco	120-38-5UG	Final concentration is 250 ng/mL (component of organoid culture media)
Hydrocortisone Stock Solution	StemCell Technologies	7926	Final concentration is 500 ng/mL (component of organoid culture media)
Imaging Filter Cube- GFP	Agilent	1225101
Imaging Filter Cube- TRITC	Agilent	1225125
Imaging LED GFP/CFP	Agilent	1225001
Incucyte Annexin V Red Dye	Sartorius	4641	Reconstituted in organoid culture media
Incucyte Cytotox Green Dye	Sartorius	4633	DMSO solution
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma-Aldrich	A7250	Final concentration is 1.25 mM (component of organoid culture media)
Nexcelom Bioscience ViaStain AOPI Staining Solution	Fisher-Scientific	13366169	Add 1:50 volume
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636	Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media)
Noggin	R&D Systems	6057-NG	Final concentration is 100 ng/mL (component of organoid culture media)
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Final concentration is 10 units/mL (component of organoid culture media)
Phosphate Buffered Saline (1x)	Gibco	14190-144
Primocin	InvivoGen	ant-pm-05	Final concentration is 100 µg/mL (component of organoid culture media)
Recombinant Human Heregulinβ-1	Pepro Tech	100-03	Final concentration is 37.5 ng/mL (component of organoid culture media)
Staurosporine solution from Streptomyces sp.	Sigma-Aldrich	S6942
TrypLE Express	Life Technologies	12604013
Y-27632, CAS 331752-47-7	Sigma-Aldrich	688000	Final concentration is 5 µM (component of organoid culture media)
β-Estradiol	Sigma-Aldrich	E2758	Final concentration is 100 nM (component of organoid culture media)